WO2001094618A1 - Procede de detection d'albumine saccharifiee - Google Patents

Procede de detection d'albumine saccharifiee Download PDF

Info

Publication number
WO2001094618A1
WO2001094618A1 PCT/JP2001/004734 JP0104734W WO0194618A1 WO 2001094618 A1 WO2001094618 A1 WO 2001094618A1 JP 0104734 W JP0104734 W JP 0104734W WO 0194618 A1 WO0194618 A1 WO 0194618A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
albumin
serum
glycated
value
saccharified
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/004734
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Isami Tsuboi
Michihiro Taguchi
Original Assignee
Bml, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bml, Inc. filed Critical Bml, Inc.
Priority to AU2001260716A priority Critical patent/AU2001260716A1/en
Priority to CA002411850A priority patent/CA2411850A1/en
Priority to JP2002502158A priority patent/JP4847668B2/ja
Priority to EP01934548A priority patent/EP1291438A1/en
Priority to US10/297,748 priority patent/US20040048387A1/en
Publication of WO2001094618A1 publication Critical patent/WO2001094618A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/02—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates involving antibodies to sugar part of glycoproteins

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a specific glycated protein in serum.
  • Diabetes should be treated and detected as accurately and as early as possible.
  • glycated albumin in serum has attracted attention as a short-term blood glucose control index, and an appropriate method of detecting glycated albumin is currently being sought.
  • glycated albumin in serum is carried out by a so-called HPLC method (Clinical Laboratory vol 40:. 1275-1280, 1996) force s, in this method, it is difficult to process large quantities of sample, There is a problem that running costs are increased.
  • the present inventors have made intensive studies to solve this problem and found that it is effective to use a glycoprotein measurement reagent that can detect glycated protein in serum by an enzymatic method. I thought. Furthermore, in order to improve the accuracy of this detection method, if the quantified value of glycated protein obtained with the glycoprotein measurement reagent is divided by the quantified value of albumin quantified in the same serum sample and corrected, this correction is performed. It was found that the value showed a very good correlation with the quantitative value of glycated albumin in serum (quantitative value by the above HPLC method).
  • the problem to be solved by the present invention is to perform the regression equation using the corrected quantification method using the enzymatic method without the above-mentioned section appearing and by the HPLC method.
  • the present inventor has found that the appearance of the above-mentioned section is caused by the use of an artificial type of glycated albumin standard material used for quantification by the enzymatic method. .
  • saccharified albumin used in the enzymatic method is obtained by recombining a recombinant albumin or human-derived albumin fraction obtained from Escherichia coli or the like into which a gene encoding albumin has been incorporated in the presence of glucose. It is a saccharified albumin obtained by forcibly saccharifying albumin by keeping the temperature around 7 ° C. This artificial saccharified albumin aims to bind glucose to all four sugar chain binding sites present on albumin.
  • the enzymatic method is performed using such conventional glycated albumin as a standard substance, there is a tendency that the results obtained by the HPLC method do not always show a good correlation.
  • the number of glycated albumin saccharides originally present in at least the serum of healthy humans is less than 4, usually 1 or 2 or so.
  • the quantification method of glycated albumin one molecule of glycated albumin can be recognized equally regardless of the number of sugar bonds in albumin. It is conceivable that the measured values fluctuate due to the change. Also, in order to perform saccharification perfectly when the above-mentioned forced saccharification is performed (that is, the average number of sugar bonds per molecule of albumin is approximately 4), it is necessary to keep the temperature in the presence of glucose.
  • the present inventors have separated and collected glycated albumin present in the serum of a human (healthy person) and collected the glycated albumin. To use it as a reference material.
  • the present invention provides a glycoprotein measurement reagent for measuring glycated protein in serum, dividing the quantitative value by the quantitative value of total albumin in the serum, and correcting the corrected value.
  • a glycoprotein measurement reagent which is used as the quantitative value of glycated albumin in glycated albumin
  • glycated albumin used as a standard substance is obtained by separating from the albumin fraction derived from the blood of healthy humans
  • the present invention provides a method for detecting saccharified albumin, which is a saccharified albumin (hereinafter, also referred to as the present detection method).
  • Healthy person means a person who is not diabetic or a diabetic border region.
  • a healthy person has a fasting plasma blood glucose level of less than 11 Omg / dl, and 5 Glycated albumin derived from blood with a plasma glucose level of less than 140 mg / dl 2 hours after the glucose tolerance test (hereinafter also referred to as natural glycated albumin)
  • glycated albumin present in the serum of healthy humans.
  • the average number of glycated molecules per albumin molecule in albumin having four glycated sites is less than 4, It means saccharified albumin which is usually 1-2.
  • the average number of sugar bonds per molecule of natural glycated albumin which can be used as a standard substance in the present detection method is generally 1 to 2, and is shown in Examples described later.
  • the ratio is preferably approximately 1.3 to 2.1 (rounded to the second decimal place), in the present invention, the average of the number of sugar bonds is 1.3 to 2.1 (decimal point).
  • a detection method using saccharified albumin (rounded to the second place) as a standard substance is also provided as this detection method.
  • this detection method uses a glycoprotein measurement reagent and glycated protein in serum.
  • Glycoprotein was quantified using a glycoprotein measurement reagent, and the resulting quantified value was divided by the quantified value of total albumin in the serum and corrected, and the corrected value was used as the quantified value of glycated albumin in the serum.
  • the present invention also provides a method for detecting glycated albumin, wherein the average number of sugar bonds per molecule of glycated albumin used as a standard substance is 1.3 to 2.1.
  • a means for directly separating non-glycated albumin and glycated albumin from human serum for example, a carrier in which aminophenylboronic acid is immobilized as a ligand
  • a carrier in which aminophenylboronic acid is immobilized as a ligand for example, a carrier in which aminophenylboronic acid is immobilized as a ligand
  • the method for producing natural saccharified albumin is not limited to this.
  • a part of the saccharification site of a non-saccharified albumin molecule is protected by a protecting group or the like so that saccharification does not occur.
  • Natural saccharified albumin can also be obtained by removing the protecting group and the like after the forced saccharification is performed.
  • the reagent for measuring a glycoprotein using the above enzyme includes, for example, a reagent combining ketoaminooxidase or fructosamine oxidase, in which substrate specificity is recognized between protease and glycated amino acid.
  • the measurement reagents are sold as so-called “Gly-Pro reagents” by Auto Corp. fructosamine reagent (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and “Gly-Pro TM Reagent”.
  • Fig. 1 is a drawing examining the correlation between the glycated albumin value in serum and the corrected value obtained by the corrected enzyme method using artificial glycated albumin as a standard substance.
  • Fig. 2 shows the glycated albumin in serum.
  • 3 is a drawing in which a correlation between an albumin value and a correction value obtained by a correction enzyme method using natural glycated albumin as a standard substance was examined.
  • Human albumin (including glycated albumin) can be obtained by separation from human serum or plasma by a generally known method. For example, proteins in human serum or plasma can be isolated by an anion exchange column. And other protein components.
  • glycated albumin is separated and collected from such healthy human albumin by applying means capable of selecting non-glycated albumin and glycated albumin.
  • a means for selecting this albumin for example, separation of glycated albumin and non-glycated albumin using a carrier having a ligand that can specifically adsorb either glycated albumin or non-glycated albumin as a ligand can be mentioned.
  • a carrier include a carrier in which aminophenylboronic acid is immobilized as a ligand.
  • the hydroxyl group of aminophenylboronic acid bound as a ligand to the carrier and the cis-diol group of glucose bound in saccharified albumin are bonded to the carrier.
  • Saccharified albumin is selectively captured.
  • a desired natural saccharified albumin can be produced.
  • the carrier is immobilized with aminophenylphenolic acid as a ligand, for example, another substance having a cis-diol group, such as D-sorbitol, is captured by the carrier.
  • the force s for example, substitution with glycated albumin, should be selected according to the specific type of the selected separation carrier, and is not limited thereto.
  • the above-mentioned process for producing saccharified albumin can be used as a method for selectively producing non-glycated albumin.
  • This non-glycated albumin is also very useful as a standard substance.
  • the supplier of the blood used as a raw material for production may be an unhealthy person, and is preferably a healthy person).
  • non-saccharified albumin usually contains natural saccharified albumin in relation to the total amount of albumin. It is contained in an amount of about 10 to 15% by mass.
  • the serum of a healthy person can be used instead of the non-glycated albumin.
  • Purification and collection of natural saccharified albumin from the above-mentioned fraction containing saccharified albumin can be carried out by using well-known methods widely used for purifying and collecting proteins. That is, the desired natural saccharification can be performed from the fraction containing glycated albumin by appropriately using treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration, gel filtration, liquid chromatography, centrifugation, electrophoresis, dialysis, etc. It can purify and collect the albumin.
  • natural glycated albumin produced in this manner has an average of less than 4 glycation sites per albumin molecule among the 4 saccharification sites of albumin, usually 1 to 2 sites, More specifically, saccharified albumin is saccharified at 1.3 to 2.1 places (rounded to the second decimal place).
  • This detection method is based on the premise that glycated protein in serum (which can be prepared from a blood sample by an ordinary method) is quantified using a glycoprotein measurement reagent. Force, Chikararu i-th "constant is," Young, D., Effects of drugs on cl inical laboratory t ests, 4 th ed., AACC Press, Washington, and the child to adopt a method that has been described in DC, 1995 J Can be.
  • Glycoproteins in serum are digested with proteases such as pronase and proteinase K to produce fructosyl amino acids.
  • proteases such as pronase and proteinase K
  • fructosyl amino acids are digested with proteases such as pronase and proteinase K to produce fructosyl amino acids. 2
  • ketoaminooxidase or fructosamine oxidase is acted on in the presence of oxygen to generate hydrogen peroxide
  • the present detection method is characterized in that the above-mentioned natural glycated albumin is used as a standard substance in the measurement by such an enzymatic method.
  • the method for quantifying the total albumin is not particularly limited, and examples thereof include an immunoturbidimetric method, a latex method, and a dye method.
  • the glycated albumin value in serum can be accurately quantified and detected.
  • the most preferable aspects of this detection method are: 1) the process of quantifying glycated protein in serum using natural albumin as a standard, 2) the process of quantifying total albumin in the serum, and 3) the value obtained in 1). This is to automate the three processes of the correction process of dividing by the value obtained in.
  • Such an automation process can be easily performed by those skilled in the art by adjusting an existing automated quantification device for serum test according to the present detection method.
  • a urine sample may be used as the sample used in the present detection method depending on the purpose of the specific test.
  • the present invention provides, as a standard substance, natural glycated albumin (glycated albumin obtained by separating from an albumin fraction derived from the blood of a healthy person, or an average number of glycated bonds per molecule of glycated albumin of 1. 3 to 2.1 saccharified albumin) as a component of the kit.
  • glycated albumin obtained by separating from an albumin fraction derived from the blood of a healthy person, or an average number of glycated bonds per molecule of glycated albumin of 1. 3 to 2.1 saccharified albumin
  • This kit for detection requires, in addition to natural glycated albumin as described above, non-glycated albumin, and a quantification reagent for quantifying glycated protein by enzymatic method, which is used as a standard substance for detection. Can be included as a component of the kit.
  • the molar ratio [B] of the glycated protein in the serum to the total albumin was measured using “Gly-Pr 0 reagent” (Gly-Pro TM Reagent: manufactured by Zenzym). Then, by calculating [B] / [A] by dividing the former [A] by the latter [B], the average number of sugar bonds per molecule of saccharified albumin of each sample was determined. Table 1 shows the results.
  • the average number of glycated bonds per molecule of glycated albumin derived from the donors of samples 1 to 6 as healthy subjects was 1.3 to 2.1 (respectively, the numbers after the second decimal place are (The average value of the six samples is 2.01.)
  • the average number of glycated albumin per molecule of glycated albumin in a sample from a patient with borderline diabetes or diabetes is a numerical value. It can be seen that is large and the variation is large.
  • glycated albumin derived from blood of healthy subjects has a small number of sugar bonds per molecule and almost two, and is suitable as a standard substance when glycated albumin is quantified by an enzymatic method. It became clear that there was.
  • the mixed gel was allowed to stand for 16 hours while refrigerated (4 ° C)
  • the serum components collected on the gel were removed by pipetting from the opening of the column with a pipette.
  • the mixed gel, equilibrated solution [0. 02M EP PS buffer (p H 8. 6), 0. 1 5 MN a C 1, 0. 0 1 MM g C 1 2 ] passing a 5 mL
  • unadsorbed components were eluted.
  • the unadsorbed component is dialyzed in a physiological saline solution 500 times the volume of the sample while stirring with a stirrer, and the dialysate is filtered using a filtration membrane (Centricon 10: Amicon). Ultrafiltration was performed at 3,000 rpm for 6 hours, and the concentration was reduced to about 1/4 (Centricone 10 was replaced with a new one every 1/2 concentration).
  • the concentrate of the sample thus obtained was used as a low-value sample of saccharified albumin (non-saccharified albumin).
  • the amount of natural saccharified albumin in the low-value sample of saccharified albumin was about 10 mass 0 / to the total amount of albumin. Met.
  • the concentrate of the sample thus obtained was used as a high-value sample of saccharified albumin (saccharified albumin).
  • the average number of sugar bonds per molecule of albumin in the high-value sample of saccharified albumin was 2.02.
  • Example 1-3 provider serum a crude human albumin 2g
  • a crude human albumin 2g was dissolved in an aqueous solution in 1 100 ml containing 5 mass 0/0 glucose and 0.05 mass 0/0 sodium azide The temperature was kept at 37 ° C. for 48 hours. Thereafter, this solution was dialyzed overnight in distilled water at 5 ° C. using a permeable membrane. After completion of the dialysis, the dialysate was subjected to ultrafiltration using an ultrafiltration membrane (Centricon 10: Amicon) at 3000 rpm for 6 hours, and concentrated to about 1/4 (1Z2 concentration). Each time the Sentricon 10 was replaced with a new one). The sample thus obtained was used as an artificially high sample of saccharified albumin.
  • Serum was obtained from blood samples from 48 blood sample donors, and the saccharified albumin produced in the above production example was obtained using “Gly-Pr 0 reagent” (Gly-Pro TM Reagent: manufactured by Zenzam). Serum glycated protein (1) was quantified using low-value samples and artificially high-value samples as standard solutions.
  • glycated albumin (2) in serum was quantified by the HP LC method (two-column method described in “Clinical Laboratory vol. 40: 1275-1280, 1996”).
  • Fig. 1 is a drawing that examines the correlation between (2) and the value (%) of (3) instead of (1) above.
  • the serum glycated protein (1), (1) was quantified using the low value sample and the high value sample of glycated albumin produced in the above Production Example as standard solutions.
  • FIG. 1 Drawings examining the correlation between the quantified value of glycated albumin (2) in serum by the HPLC method and the value (1),, divided by the total albumin value (3) ', similar to the above, FIG.
  • glycated albumin which can be a good indicator for diabetes, can be accurately and simply detected and quantified by the present detection method.
  • the detection method is, in the detection of diabetes seen that force s is a very effective means.
  • glycated albumin which can be a good indicator for diabetes, can be accurately and simply detected and quantified, and a very effective means for detecting diabetes is provided.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

糖化アルブミンの検出方法 技術分野
本発明は、 血清中の特定の糖化タンパク質の検出方法に関する発明である。 背景技術
糖尿病の治療は、 可能な限り的確に、 かつ、 早期に発見して行うことが好まし い。 かかる糖尿病のマーカーとして、 血清中の糖化アルブミンが、 短期的血糖管 理指標として着目されており、 この糖化アルブミンの適切な検出方法が現在模索 されている。
現在、 血清中の糖化アルブミ ンは、 いわゆる H P L C法によって行われている (臨床検査 vol. 40: 1275-1280， 1996) 力 s、 この方法では、 大量の検体を処理する ことが困難であり、 ランニングコス トも嵩むという問題点がある。
本発明者らは、 この課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、 酵素法によ り血清中の糖化タンパク質を検出することが可能な糖タンパク質測定試薬を用い ることが有効であることに想到した。 そして、 さらに、 この検出の方式における 精度を向上させるために、 糖タンパク質測定試薬で得た糖化タンパク質の定量値 を、 同一の血清検体において定量したアルブミンの定量値で除して補正すると、 この補正値が、 血清中の糖化アルブミンの定量値 （上記の H P L C法での定量 値） と、 非常に良好な相関を示すことが明らかにした。
しかしながら、 この相関性が良好な糖化アルブミンの定量方法を用いても、 現 状では、 得られる回帰式をプロッ トした場合に、 Y軸負方向 （X軸正方向） への 切片が現れてしまい、 取扱いが複雑 '不便になり、 臨床現場等における円滑な取 扱いを妨げる原因ともなりかねない。
そこで、 本発明が解決すべき課題は、 酵素法を用いた補正定量法を用いて、 回 帰式をプロッ トしても、 上記のような切片が現れることなく、 かつ、 H P L C法 によって行われる糖化アルブミ ンの定量値と、 1 ： 1対応の相関が認められるよ うにする手段を提供することにある。 発明の開示
本発明者は、 この課題の解決に向けて、 まず、 上記の切片が現れる原因につい ての検討を行った。
その結果、 本発明者は、 上記の切片が現れるのは、 酵素法による定量の際に用 いる、 糖化アルブミンの標準物質として、 人工タイプのものを用いていることに 原因があることを突き止めた。
すなわち、 現状において、 酵素法において用いる糖化アルブミンは、 アルブミ ンをコ一ドする遺伝子を組み込んだ大腸菌等から得られる、 組換え型アルブミン またはヒ ト由来のアルブミン画分を、 グルコース存在下で、 3 7 °C付近で保温す ることにより、 強制的にアルブミンを糖化して得られる糖化アルブミンである。 この人工糖化アルブミンは、 アルブミンに 4か所存在する糖鎖結合部位全てにグ ルコースを結合させることを目指している。 しかしながら、 かかる従来の糖化ァ ルブミンを標準物質として酵素法を行うと、 H P L C法で行った結果に必ずしも よい相関を示すとは限らない傾向が認められる。 この理由として、 本来、 少なく とも健常人の血清に存在する糖化アルブミンの糖の結合数は、 4未満であり、 多, くは、 1〜 2程度であり、 従来から用いられている H P L C法による糖化アルブ ミンの定量法においては、 アルブミンにおける糖の結合数にかかわらず、 1分子 の糖化アルブミンを等しく認識することが可能であるが、 酵素法による定量の場 合には、 この糖の結合数によって測定値に変動が認められてしまうことが考えら れる。 また、 上述の強制的な糖化を行った場合の糖化を、 完璧に行うためには (すなわち、 アルブミン 1分子当りの糖結合数の平均を、 ほぼ 4とする） 、 グル コース存在下での保温を長期間 （最低、 1週間程度） 行う必要があるが、 この保 存期間中にアルブミン自体が変性してしまう傾向が認められるために、 このよう な長期間の保存を行うこと自体が困難である。 その結果、 アルブミン 1分子当り の糖結合数にばらつきが多くなつた結果、 測定値の変動を生じてしまっているこ とが考えられる。
このように、 可能な限り、 通常の血清に存在する糖化アルブミンに近似したも ので、 かつ、 ァルプミ ン 1分子当りの糖結合数のばらつきが少ない糖化アルブミ ンを糖化アルブミンの標準物質として用いらなければ、 必然的に H P L C法によ り得られる結果とのズレが生じてしまうこととなるのである。
かかる人工糖化ァルブミンを酵素法において用いることによって生ずる不利益 を解消する手段として、 本発明者は、 ヒ ト （健常人） の血清に存在する糖化アル ブミンを分離 ·採取して、 これを糖化アルブミンの標準物質として用いることに 想到した。
すなわち、 本発明は、 糖タンパク質測定試薬で、 血清中の糖化タンパク質を定 量し、 その定量値を、 同血清中の総アルブミ ンの定量値で除して補正し、 かかる 補正値を同血清中の糖化アルブミンの定量値とする、 糖タンパク質測定試薬を用 いて糖化アルブミンを検出する方法において、 標準物質として使用する糖化アル ブミンが、 健常人の血液に由来するアルブミン画分から分離して得られる糖化ァ ルブミ ンである、 糖化アルブミ ンの検出方法 （以下、 本検出方法ともいう） を提 供する発明である。
健常人 （本発明においては、 糖尿病または糖尿病境界域ではない人のことを意 味する。 具体的には、 健常人は、 空腹時血漿血糖値が 1 1 O mg/dl 未満で、 かつ、 7 5 グルコース負荷試験の 2時間後の血漿血糖値が 1 4 0 mg/dl 未満の者とし て定義される） の血液に由来する糖化アルブミ ン （以下、 自然糖化アルブミ ンと もいう） とは、 通常、 健常人の血清において存在する糖化アルブミンのことを意 味するものであり、 具体的には、 糖化部位が 4か所存在するアルブミンにおける、 アルブミン 1分子当りの平均糖化数が、 4未満、 通常は 1〜 2である糖化アルブ ミ ンのことを意味する。
このよう に、 本検出方法において標準物質として用いられ得る自然糖化ァルブ ミ ンの、 1分子当りの糖結合数の平均は、 一般的には 1〜 2であり、 後述する実 施例において示されるように、 好適には、 概ね 1 . 3〜 2 . 1 (小数点第 2位以 下は四捨五入） であるので、 本発明では、 かかる糖結合数の平均が 1 . 3〜 2 . 1 (小数点第 2位以下は四捨五入） である糖化アルブミ ンを、 標準物質として用 いた検出方法も、 本検出方法として提供する。
すなわち、 本検出方法は、 糖タンパク質測定試薬で、 血清中の糖化タンパク質 を定量し、 その定量値を、 同血清中の総アルブミンの定量値で除して補正し、 か かる補正値を同血清中の糖化アルブミンの定量値とする、 糖タンパク質測定試薬 を用いて糖化アルブミンを検出する方法において、 標準物質として使用する糖化 ァルブミンの 1分子当りの糖結合数の平均が 1 . 3〜 2 . 1である、 糖化アルブ ミンの検出方法、 としても提供される。
自然糖化アルブミンを製造するには、 直接、 ヒトの血清から、 非糖化アルブミ ンと糖化アルブミンとを分別する手段 （例えば、 アミノフヱニルボロン酸をリガ ンドとして固定した担体） を用いて、 自然糖化アルブミンを分別採取することが、 効率的、 かつ、 現実的である。 しかしながら、 自然糖化アルブミンの製造方法は、 これに限定されるべきものではなく、 例えば、 非糖化アルブミン分子の糖化部位 の一部分を保護基等で、 糖化を起こさない状態とし、 これに対して、 現在行われ ている、 強制糖化を行った後に、 保護基等を除去すること等を行うことによって も、 自然糖化アルブミンを得ることができる。
なお、 上記の酵素を用いた糖タンパク質測定試薬は、 例えば、 プロテアーゼと 糖化ァミノ酸に基質特異性が認められる、 ケトァミノォキシターゼまたはフルク トサミンォキシダーゼを組み合わせた試薬が挙げられ、 この態様の測定試薬は、， いわゆる 「Gly- Pro 試薬」 として、 オートヮコーフルク トサミン試薬 （和光純薬, 社製） および 「Gly- ProTM Reagent」 から発売されている。 図面の簡単な説明
第 1図は、 血清中の糖化アルブミン値と人工の糖化アルブミンを標準物質とし て用いた補正酵素法により得られる補正値との相関を検討した図面であり、 第 2 図は、 血清中の糖化アルプミン値と自然糖化アルブミンを標準物質として用いた 補正酵素法により得られる補正値との相関を検討した図面である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態を説明する。
A . 自然糖化アルプミンの製造 - 上述したように、 自然糖化アルブミンは、 健常人の血清または血漿から分離 - 採取することにより製造することが、 現状では効率的である。
自然糖化アルブミンを製造する前提として、 まず、 健常人のヒトアルブミンを 調製することが好適である。 ヒトアルブミン （糖化アルブミンを含んでいる） は、 通常公知の方法により、 ヒト血清または血漿から分離して得ることが可能である 例えば、 陰イオン交換カラムにより、 ヒ ト血清または血漿中の蛋白をアルブミ ン とその他の蛋白成分に分離することにより得ることができる。
次いで、 かかる健常人のヒ トアルブミンから、 糖化アルブミンを、 非糖化アル ブミンと糖化アルブミンを選択することができる手段を施し、 分離して採取する ことが好ましい。 このアルブミ ンの選択手段としては、 例えば、 糖化アルブミン または非糖化アルブミンのいずれかを特異的に吸着可能な分子種をリガンドとし た担体を用いた糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分別を挙げることができる かかる担体としては、 例えば、 アミノフェニルボロン酸をリガンドとして固定し た担体等を挙げることができる。
ァミノフエ二ルポロン酸をリガンドとして固定した担体においては、 担体にリ ガンドとして結合しているアミノフエニルボロン酸の水酸基と、 糖化アルブミン において結合しているグルコースの cis - diol基と結合することにより、 糖化アル ブミ ンが選択的に捕捉される。 この担体に捕捉された糖化アルブミンを、 溶出す ることにより、 所望する自然糖化アルブミンを製造することができる。 糖化アル ブミンの溶出手段としては、 ァミノフエ二ルポ口ン酸をリガンドとして固定した 担体であれば、 例えば、 D—ソルビトール等のような、 cis- diol基を有する他の 物質を、 担体に捕捉された糖化ァルブミンに対して置換すること等が挙げられる 力 s、 選択する分別担体の具体的な種類に応じて選択されるべきものであり、 これ に限定されるものではない。
なお、 上記の糖化アルブミンの製造過程を、 非糖化アルブミンの選択的な製造 手段とすることも可能であり、 この非糖化アルブミ ンも、 標準物質として非常に 有用である （なお、 非糖化アルブミンの製造原料となる血液の供給者は、 非健常 人であってもよい力、 健常人であることが好適である） 。 通常、 上記の糖化アル ブミンの製造過程を、 非糖化アルブミンの選択的な製造手段として用いた場合の 非糖化アルブミ ンには、 通常、 自然糖化アルブミ ンが、 全アルブミン量に対して 1 0〜 1 5質量％程度含有される。 また、 本検出方法を行うに際しては、 上記の 非糖化アルブミンの代わりに、 健常人の血清そのものを用いることもできる。 上記の糖化アルブミ ンを含む画分からの、 自然糖化アルブミンの精製 ·採取は、 蛋白質を精製 ·採取する際に汎用されている、 公知の方法を駆使して行うことが できる。 すなわち、 通常の蛋白沈澱剤による処理、 限外濾過、 ゲル濾過、 液体ク 口マトグラフィー、 遠心分離、 電気泳動、 透析法等を適宜用いることにより、 糖 化アルブミンを含む画分から、 所望の自然糖化アルプミンを精製 ·採取すること ができる。
このようにして製造される自然糖化アルブミンは、 上述したように、 4か所存 在するアルブミンの糖化部位のうち、 平均で、 アルブミン 1分子当り 4か所未満、 通常は、 1〜2か所、 さらに具体的には、 1 . 3〜2 . 1か所 （小数点第 2位以 下は四捨五入） が糖化されている糖化アルブミンである。
上述したように、 自然糖化アルブミ ンを、 酵素法による糖化アルブミ ン定量に おける標準物質として用いることにより、 酵素法においても、 糖化部位が全てが 糖化した人工の糖化アルブミンに認められるような過反応が認められないため、 酵素法を用いた補正定量法による糖化ァルブミン定量の簡便性を維持しつつ、 精 度の高いデータを得ることができる。
すなわち、 H P L C法による糖化アルブミ ンの定量結果と、 ほぼ 1 ： 1で相関 し、 かつ、 回帰式をプロッ トしても、 プロッ ト図において切片が現れることを回 避することが可能である。
B . 本検出方法および検出用キッ ト
本検出方法は、 血清中 （常法により、 血液検体から調製することが可能であ る） の糖化タンパク質を、 糖タンパク質測定試薬で定量することを前提としてい る。 力、力る i目』定は、 「Young， D. ， Effects of drugs on cl inical laboratory t ests, 4 t hed. , AACC Press, Washington, DC, 1995 J に記載されている方法を採るこ とができる。
この測定の大まかな原理は、 以下のごとくである。
①血清中の糖化タンパク質をプロナーゼ、 プロティナーゼ K等のプロテアーゼ により消化し、 フルク トシルアミノ酸して、 ②このフルク トシルアミノ酸を基質として、 酸素の存在下でケトアミノォキシ ダーゼまたはフルク トサミンォキシダーゼを作用させて過酸化水素を発生させ、
③この過酸化水素を定量 〔例えば、 4ーァミノアンチピリンと N—ェチル一N 一 （2—ヒドロキシー 3—スルホプロピル） 一 m—トルイジン等の存在下で、 ぺ ルォキシダーゼを作用させて発色させ、 これを 5 5 O nmにおける吸光度測定によ り定量する方法等〕 する。
本検出方法では、 このような酵素法による測定において、 標準物質として、 上 述した自然糖化アルブミンを用いることを特徴とする。
また、 本検出方法では、 上記の糖化タンパク質を定量する血清において、 別途、 総ァルブミンを定量することが必要である。
かかる総アルブミンの定量方法は、 特に限定されず、 免疫比濁法、 ラテックス 法、 色素法等を例示することができる。
このようにして得られる総アルブミンの定量値で、 上記の糖化タンパク質の定 量値を除して補正することにより、 血清中の糖化アルブミン値を的確に定量 ·検 出することができる。
本検出方法の最も好ましい態様は、 ①自然アルブミンを標準物質として用いた 血清中の糖化タンパク質の定量過程、 ②同血清中の総アルブミンの定量過程、 お よび、 ③ ①で得られた値を②で得られた値で除する補正過程の、 3つの過程を、 自動化して行うことである。
かかる自動化過程は、 既存の血清検査用の自動化定量装置を、 本検出方法に応 じて調整することで、 当業者であれば、 容易に行うことができる。
本発明により、 低コストで、 従来の H P L C法による結果と同等の結果を得る ことが可能である。
なお、 本検出方法において用いる検体を、 尿検体とすることも、 具体的な検査 の目的によっては可能である。
また、 本発明は、 標準物質として、 自然糖化アルブミン （健常人の血液に由来 するアルブミン画分から分離して得られる糖化アルブミン、 または、 糖化アルブ ミンの 1分子当りの糖結合数の平均が 1 . 3〜 2 . 1の糖化アルブミン） を、 キ ッ トの構成要素として含む、 本検出方法を行うための、 検出用キッ ト （以下、 本 検出用キッ トともいう） をも提供する発明である。 本検出用キッ トには、 検出の 標準物質として用いる、 上述した内容の自然糖化アルブミンの他に、 非糖化アル ブミン、 酵素法による糖化タンパク質を定量するための、 定量試薬等を必要に応 じてキッ トの構成要素として含有させることができる。 実施例
以下、 本発明を実施例により、 さらに具体的に説明する。
2 0名の血液提供者 〔健常人 6名 （検体番号 1 〜 6 ) 、 境界域糖尿病患者 4名 (検体番号 7〜 1 0 ) 、 糖尿病患者 （検体番号 1 1 〜 2 0 ) 〕 を募って、 H P L Cにより、 各検体の全アルブミンに対する糖化タンパク質の質量比率を計測し、 その値から、 公知の手法 〔安川恵子他： グリコアルブミン， 臨床検査 4 0 ( 1 2 ) ， 1 2 7 5〜 1 2 8 0頁 （1 9 9 6年） 〕 に従い、 全アルブミンに対する糖 化タンパク質のモル比率 〔A〕 を算出した。 また、 同じ検体に対して、 「Gly-Pr 0 試薬」 （Gly- ProTM Reagent：ゼンザィム社製） を用いて、 血清中の糖化タン パク質の全アルブミンに対するモル比率 〔B〕 を測定した。 そして、 前者 〔A〕 で、 後者 〔B〕 で除した、 〔B〕 / 〔A〕 を算出することにより、 各検体の糖化 アルブミンの 1分子当りの平均糖結合数を求めた。 この結果を第 1表に示す。
検体番号 質量比率 (°/。） [A] (/ mol/g.ALB) [B] ( mol/g. ALB) [A]/[B]
1 12.1 1.78 3.5 1.97
2 13 1.91 4 2.09
3 13.6 2 4 2.00
4 14.2 2.09 4.4 2.11
5 14.8 2.18 4 1.84
6 15.5 2.28 4.7 2.06
7 16.4 2.41 5.5 2.28
8 17.6 2.59 5.7 2.20
9 18.3 2.69 5.5 2.04
10 19.8 2.91 7 2.40
11 20.1 2.96 6.6 2.23
12 21.5 3.16 7.1 2.25
13 22.5 3.31 8.1 2.45
14 23.8 3.5 8.5 2.43
15 24 3.53 8.7 2.47
16 25.7 3.78 9.2 2.43
17 26.9 3.96 9.4 2.38
18 27.9 4.10 9.4 2.29
19 28.2 4.15 13.7 3.30
20 29.3 4.31 10.4 2.41
この結果により、 健常人である、 検体 1〜 6の提供者に由来する糖化アルブミ ンの 1分子当りの平均糖結合数は、 それぞれ、 1. 3〜2. 1 (小数点第 2位以 下は四捨五入） であり （6検体の平均値は、 2. 0 1である） 、 これに対して、 境界糖尿病や糖尿病の患者からの検体における糖化アルブミンの 1分子当りの平 均糖結合数は、 数値が大きくなり、 かつ、 ばらつきが大きいことがわかる。
このように、 健常人に血液に由来する糖化アルブミンは、 1分子当りの糖結合 数が、 ばらつきが少なく、 ほぼ 2であり、 酵素法で糖化アルブミ ンを定量する場 合の標準物質として適していることが明らかとなった。
製造例 陰イオン交換カラムによ り、 ヒ ト （健常人：上記参考例の検体 1〜 3の.提供 者） の血清 （各人 1 5 OmL) から分離された粗ヒトアルブミンを、 透析してグル コースを除去して、 さらに、 これを濃縮した後、 生理食塩水で希釈し、 蛋白濃度 を 7g/dlの割合に調整した。 次いで、 このヒ トアルブミ ン溶液を、 ァミノフエ二 ルポロン酸ァガロースゲル （シグマ社製） と混合した。 具体的には、 ゲル 5mLに 対し、 ヒ トアルブミ ン溶液 5mL (体積比 1 ： 1) を混合した。 なお、 ゲルは、 再 生液 1 ( 20 mM 水酸化ナトリ ウム） およぴ再生液 2 ( 0. 3 % 酢酸） で処理 した後に、 平衡化してから使用した。
上記の混合ゲルを、 1 6時間冷蔵 （4°C) しつつ静置した後、 ゲルの上に溜ま つた血清成分をカラムの開口部からピペッ トで抜取り、 除去した。
①糖化アルブミンの低値試料の調製
次に、 混合ゲルに、 平衡化液 〔0. 02M EP P S緩衝液 （ p H 8. 6) ， 0. 1 5 M N a C 1 , 0. 0 1 M M g C 12 〕 5 mLを流すことで、 未吸着成 分を溶出させた。 かかる未吸着成分を、 試料の 500倍容量の冷却した生理食塩 水中で、 スターラーで攪拌しながら透析し、 この透析液を、 限タ 濾過膜 （セント リコン 1 0 ： アミコン社製） を用いて、 3 000 rpm で 6時間の限外濾過を行い、 約 1 / 4まで濃縮を行った （ 1 / 2濃縮毎にセントリコン 1 0.を、 新しいものと 交換した） 。
このようにして得た試料の濃縮物を、 糖化ァルブミンの低値試料 （非糖化ァル ブミン） とした。
この糖化アルブミンの低値試料の自然糖化アルブミン量は、 全アルブミン量に 対して約 1 0質量0 /。であった。
②糖化アルブミンの高値試料の調製
上記の工程 (!''により、 未吸着成分を溶出させた混合ゲルに、 再度、 上記の平衡 化液を 45mL流し、 混合ゲルを洗浄した。 次に、 この混合ゲルに、 溶出液 〔0. 02 M E P P S緩衝液 （pH 8. 6) ， 0. 1 5M N a C 1 , 0. 1 M ソ ルビトール〕 2 OmLを流し、 7〜 1 OmLの分画を回収した。 かかる分画を、 50 0倍容量の冷却した生理食塩水中で、 スターラーで攪拌しながら透析し、 この透 析液を、 限外濾過膜 （セン トリコン 1 0 ： アミコン社製） を用いて、 300 Orp m で 6時間の限外濾過を行い、 約 1/4まで濃縮を行った （1/2濃縮毎にセン トリコン 1 0を、 新しいものと交換した） 。
このようにして得た試料の濃縮物を、 糖化アルブミ ンの高値試料 （糖化アルブ ミン） とした。
なお、 この糖化アルブミンの高値試料のアルブミン 1分子当りの平均糖結合数 は、 2. 02であった。
③糖化アルブミンの人工高値試料の調製
ヒト血清 （検体 1〜 3提供者の血清） から分離された、 粗ヒトアルブミン 2g を、 5質量0 /0グルコースと 0. 05質量0 /0アジ化ナトリウムを含有する水溶液 1 00ml中に溶解し、 3 7°Cで 48時間の保温を行った。 その後、 この溶液を、 透 析膜を用いて、 5 °Cの蒸留水中で一晩の透析を行った。 透析を終了後、 透析物を 限外濾過膜 （セントリコン 1 0 ： アミコン社製） を用いて、 3000 rpm で 6時 間の限外濾過を行い、 約 1/4まで濃縮を行った （1Z2濃縮毎にセントリコン 1 0を、 新しいものと交換した） 。 このようにして得た試料を、 糖化アルブミン の人工的高値試料とした。
試験例 1
48人の血液検体提供者からの血液検体から、 それぞれ血清を得て、 「Gly-Pr 0 試薬」 （Gly- ProTM Reagent： ゼンザィム社製） により、 上記の製造例におい て製造した糖化アルブミンの低値試料と同人工的高値試料を標準液として使用し て、 血清中の糖化タンパク質 （1) を定量した。
そして、 同時に、 HP LC法 〔 「臨床検査 vol.40 :1275-1280， 1996」 に記載さ れた 2カラム法〕 によって、 血清中の糖化アルブミン （2) を定量した。
次に、 （1) の値を、 常法によって定量した、 各々の血清検体における総アル ブミ ン値 （g/L)で除した値を算出した （3) 。
そして、 上記の （1) の代わりに （3) の値 （％) の値と、 （2) との相関を 検討した図面が、 第 1図である。
第 1図において、 横軸正方向における切片の存在が認められた。 この切片は、 すでに、 HP LC法で臨床的に認められている正常範囲を逸脱するもので、 これ をこのまま臨床現場で用いると、 少なからず取扱いに混乱を惹き起こす可能性を 否定することができない。
試験例 2
試験例 1と同様の試験系において、 上記の製造例において製造した糖化アルブ ミンの低値試料と同高値試料を標準液として使用して、 血清中の糖化タンパク質 . (1) ， を定量した。
そして、 上記と同様の血清中の糖化アルブミ ン （2) の HP LC法による定量 値と、 （1) ， を総アルブミ ン値で除した値 （3) ' との相関を検討した図面が、 第 2図である。
この第 2図においては、 第 1図のような切片が認められず、 相関係数は、 0. 970で良好であり、 かつ、 傾きも 1. 04 5と、 H P L C法による測定値 (2) との間において、 殆ど変動は認められなかった。
これらの結果により、 本検出方法により、 糖尿病に関する良好な指標となり得 る糖化アルブミンを、 精度良く、 かつ、 簡便に検出 '定量することができること が明らかになった。
つまり、 本検出方法が、 糖尿病の検出において、 非常に有効な手段であること 力 sわかる。 産業上の利用可能性
本発明により、 糖尿病に関する良好な指標となり得る糖化アルブミンを、 精度 良く、 かつ、 簡便に検出 ·定量することができることが明らかになり、 非常に有 効な糖尿病の検出手段が提供される。

Claims

請求の範囲
1 . 糖タンパク質測定試薬で、 血清中の糖化タンパク質を定量し、 その定量値を、 同血清中の総アルブミンの定量値で除して補正し、 かかる補正値を同血清中の糖 化ァルブミ ンの定量値とする、 糖タンパク質測定試薬を用いて糖化ァルブミ ンを 検出する方法において、 標準物質として使用する糖化アルブミンが、 健常人の血 液に由来するアルブミン画分から分離して得られる糖化アルブミンである、 糖化 アルブミンの検出方法。
2 . 糖タンパク質測定試薬で、 血清中の糖化タンパク質を定量し、 その定量値を、 同血清中の総アルブミンの定量値で除して補正し、 かかる補正値を同血清中の糖 化アルブミンの定量値とする、 糖タンパク質測定試薬を用いて糖化アルブミンを 検出する方法において、 標準物質として使用する糖化アルブミンの 1分子当りの 糖結合数の平均が 1 . 3〜 2 . 1である、 糖化アルブミ ンの検出方法。
3 . 糖タンパク質測定試薬で、 血清中の糖化タンパク質を定量し、 その定量値を、 同血清中の総アルブミンの定量値で除して補正し、 かかる補正値を同血清中の糖 化アルブミンの定量値とする、 糖タンパク質測定試薬を用いて糖化アルブミンを 検出する方法において、 健常人の血液に由来するアルブミン画分から分離して得 られる糖化アルブミンを標準物質として用いて、 血清中の糖化アルブミンを検出 する、 健常人由来の糖化アルブミ ンの使用方法。
4 . 糖タンパク質測定試薬で、 血清中の糖化タンパク質を定量し、 その定量値を、 同血清中の総アルブミンの定量値で除して補正し、 かかる補正値を同血清中の糖 化アルブミンの定量値とする、 糖タンパク質測定試薬を用いて糖化アルブミンを 検出する方法において、 糖化アルブミンの 1分子当りの糖結合数の平均が 1 . 3 〜 2 . 1の糖化アルブミンを標準物質として用いて、 血清中の糖化アルブミ ンを 検出する、 糖化ァルブミ ンの 1分子当りの糖結合数の平均が 1 . 3〜 2 . 1の糖 化アルブミンの使用方法。
5 . 標準物質として、 健常人の血液に由来するアルブミ ン画分から分離して得ら れる糖化アルブミンをキッ トの構成要素として含む、 請求項 1記載の糖化アルブ ミンの検出方法を行うための、 検出用キッ ト。
6 . 標準物質として、 糖化 レブミンの 1分子当りの糖結合数の平均が 1 . 3〜 2 . 1の糖化アルブミンをキッ トの構成要素として含む、 請求の範囲第 2項記載 の糖化アルブミンの検出方法を行うための、 検出用キッ ト。
PCT/JP2001/004734 2000-06-07 2001-06-05 Procede de detection d'albumine saccharifiee WO2001094618A1 (fr)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2001260716A AU2001260716A1 (en) 2000-06-07 2001-06-05 Method of detecting saccharified albumin
CA002411850A CA2411850A1 (en) 2000-06-07 2001-06-05 Method of detecting saccharified albumin
JP2002502158A JP4847668B2 (ja) 2000-06-07 2001-06-05 糖化アルブミンの検出方法
EP01934548A EP1291438A1 (en) 2000-06-07 2001-06-05 Method of detecting saccharified albumin
US10/297,748 US20040048387A1 (en) 2000-06-07 2001-06-05 Method of detecting saccharified albumin

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000170773 2000-06-07
JP2000-170773 2000-06-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001094618A1 true WO2001094618A1 (fr) 2001-12-13

Family

ID=18673433

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/004734 WO2001094618A1 (fr) 2000-06-07 2001-06-05 Procede de detection d'albumine saccharifiee

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20040048387A1 (ja)
EP (1) EP1291438A1 (ja)
JP (1) JP4847668B2 (ja)
AU (1) AU2001260716A1 (ja)
CA (1) CA2411850A1 (ja)
WO (1) WO2001094618A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007107950A (ja) * 2005-10-12 2007-04-26 Bml Inc 糖化アルブミンの管理試料
JP2007163515A (ja) * 2002-06-18 2007-06-28 Asahi Kasei Pharma Kk 糖化タンパク質測定用検量物質および標準測定法
EP2352020A2 (en) 2010-01-19 2011-08-03 Arkray, Inc. Method for analyzing sample by electrophoresis and use of the same
CN109477839A (zh) * 2016-07-28 2019-03-15 旭化成制药株式会社 糖化白蛋白的测定方法
WO2021002371A1 (ja) 2019-07-01 2021-01-07 旭化成ファーマ株式会社 フェロシアン化物の酸化還元電位を大きくするプロテアーゼの安定化剤を含む糖化タンパク質測定試薬、糖化タンパク質の測定方法、糖化タンパク質測定試薬の保存方法、及び糖化タンパク質測定試薬の安定化方法
WO2022158556A1 (ja) * 2021-01-23 2022-07-28 株式会社Provigate タンパク質の糖化度を評価する方法及び装置

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109991426A (zh) * 2019-04-03 2019-07-09 深圳市安帝宝科技有限公司 一种糖化血清白蛋白检测试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61280297A (ja) * 1985-06-04 1986-12-10 Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho アマドリ化合物の定量法及びその定量用試薬
JPH0556799A (ja) * 1990-07-04 1993-03-09 Nakarai Tesuku Kk 糖化タンパク質の検出試薬
EP0709457A1 (en) * 1994-10-05 1996-05-01 Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. Fructosyl amino acid oxidase and process for producing the same

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5132230A (en) * 1989-03-28 1992-07-21 Isolab, Inc. Primary standard and method of making secondary standards for calibration of glycated protein assays
GB9116315D0 (en) * 1991-07-29 1991-09-11 Genzyme Ltd Assay
JP3850904B2 (ja) * 1994-10-05 2006-11-29 アークレイ株式会社 フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ及びその製造方法
DE69603472T2 (de) * 1995-05-05 1999-12-30 Genzyme Ltd Bestimmung von glykierten proteinen

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61280297A (ja) * 1985-06-04 1986-12-10 Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho アマドリ化合物の定量法及びその定量用試薬
JPH0556799A (ja) * 1990-07-04 1993-03-09 Nakarai Tesuku Kk 糖化タンパク質の検出試薬
EP0709457A1 (en) * 1994-10-05 1996-05-01 Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. Fructosyl amino acid oxidase and process for producing the same

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007163515A (ja) * 2002-06-18 2007-06-28 Asahi Kasei Pharma Kk 糖化タンパク質測定用検量物質および標準測定法
JP2007107950A (ja) * 2005-10-12 2007-04-26 Bml Inc 糖化アルブミンの管理試料
EP2352020A2 (en) 2010-01-19 2011-08-03 Arkray, Inc. Method for analyzing sample by electrophoresis and use of the same
CN109477839A (zh) * 2016-07-28 2019-03-15 旭化成制药株式会社 糖化白蛋白的测定方法
CN109477839B (zh) * 2016-07-28 2022-06-14 旭化成制药株式会社 糖化白蛋白的测定方法
WO2021002371A1 (ja) 2019-07-01 2021-01-07 旭化成ファーマ株式会社 フェロシアン化物の酸化還元電位を大きくするプロテアーゼの安定化剤を含む糖化タンパク質測定試薬、糖化タンパク質の測定方法、糖化タンパク質測定試薬の保存方法、及び糖化タンパク質測定試薬の安定化方法
WO2022158556A1 (ja) * 2021-01-23 2022-07-28 株式会社Provigate タンパク質の糖化度を評価する方法及び装置

Also Published As

Publication number Publication date
US20040048387A1 (en) 2004-03-11
JP4847668B2 (ja) 2011-12-28
CA2411850A1 (en) 2002-12-06
AU2001260716A1 (en) 2001-12-17
EP1291438A1 (en) 2003-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7393549B2 (en) Defructosylation method
US20050133425A1 (en) Sample preparation of biological fluids for proteomic applications
JP4834771B2 (ja) ヘモグロビン消化用試薬
JPH0559380B2 (ja)
EP1889918B1 (en) Analysis apparatus and analysis method for glycosylated hemoglobin
WO2001094618A1 (fr) Procede de detection d'albumine saccharifiee
JP4183116B2 (ja) 糖化タンパク質測定用検量物質および標準測定法
JPH08228795A (ja) 糖鎖分析用試料の調製方法及び該試料を用いた診断方法
CN115433724B (zh) 一种猪肝中提取5核苷酸酶方法
JP4183197B2 (ja) 糖化アルブミンの測定方法
JP4622836B2 (ja) 分析装置
JP2008157905A (ja) 添加法による生体試料中蛋白・ペプチドの定量方法
JP5069023B2 (ja) 糖化タンパク質測定用検量物質および標準測定法
Baydanoff et al. Non-enzymatic glycation of elastin
CN206975046U (zh) 糖化血红蛋白检测试纸条
Brunnekreeft et al. Improved rapid procedure for simultaneous determinations of hemoglobins A1a, A1b, A1c, F, C, and S, with indication for acetylation or carbamylation by cation-exchange liquid chromatography
JP2007107950A (ja) 糖化アルブミンの管理試料
JP2003525451A (ja) 生合成炭水化物欠損トランスフェリン対照標準
Mogi et al. Selective removal of beta 2-microglobulin from plasma specimens of long-term hemodialysis patients by high-performance immunoaffinity chromatography
JP3615428B2 (ja) 蛋白結合型糖化蛋白を酵素免疫法で測定するための前処理方法
CN115792045B (zh) 一种门冬胰岛素中d-苏氨酸的检测方法
JP2000178298A (ja) グリコシル化および非グリコシル化タンパク質の分離法
JP2573189B2 (ja) カリクレインの検出方法
Cooper et al. Why the assay of serum cystine by protein precipitation and chromatography should be abandoned
CN116640741A (zh) 一种从牛血清中提取肌酸激酶的方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2411850

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001934548

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001934548

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10297748

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2001934548

Country of ref document: EP