JP2573189B2 - カリクレインの検出方法 - Google Patents
カリクレインの検出方法Info
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- kallikrein
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- sugar chain
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Description
【発明の詳細な説明】 （技術分野） この発明は、生体組織または体液中の糖タンパク酵素
カリクレインに結合している糖鎖構造の差異を検出して
生体の病態情報として取得する臨床用のカリクレインの
検出方法に関する。
カリクレインに結合している糖鎖構造の差異を検出して
生体の病態情報として取得する臨床用のカリクレインの
検出方法に関する。
（背景技術） カリクレイン［EC3,4,21,35］は、セリンプロテアー
ゼの一種でキニノゲナーゼ、キニノゲニンと呼ばれてい
るもので、キニノーゲンに作用して特異的にキニンを遊
離させる酵素である。このカリクレインは、種々の組織
や体液、すなわち、膵臓、腎臓、顎下腺、汗線、脳、肝
臓、小腸、血清、膵液、唾液、尿などに広く分布してい
ることが知られている。そして、酵素タンパク分子に糖
鎖が結合している糖タンパクの一種である。
ゼの一種でキニノゲナーゼ、キニノゲニンと呼ばれてい
るもので、キニノーゲンに作用して特異的にキニンを遊
離させる酵素である。このカリクレインは、種々の組織
や体液、すなわち、膵臓、腎臓、顎下腺、汗線、脳、肝
臓、小腸、血清、膵液、唾液、尿などに広く分布してい
ることが知られている。そして、酵素タンパク分子に糖
鎖が結合している糖タンパクの一種である。
カリクレインの生理的意義、病態学的役割について
は、いわゆるオータコイドとして極微量ではあるが生体
各所に存在し、レニン・アンジオテンシンやプロスタグ
ラジンなどと連動し、血圧、血流の調節、血液凝固系、
線溶系、神経系などにおいて重要な役割を果しているも
のと考えられる。
は、いわゆるオータコイドとして極微量ではあるが生体
各所に存在し、レニン・アンジオテンシンやプロスタグ
ラジンなどと連動し、血圧、血流の調節、血液凝固系、
線溶系、神経系などにおいて重要な役割を果しているも
のと考えられる。
このような生体意義を明らかにすることを目的とし
て、これまでにも種々の研究が行われてきている。たと
えば、尿性カリクレインの起源の一つは腎臓皮質の遠位
尿細管細胞であり、その腎臓での生理作用はNa+および
水の代謝調節が考えられている。臨床検査方法にも、本
態性の高血圧症患者の尿中に排出されるカリクレイン量
は正常人のそれと比べて低く、原発性アルドステロン
症、バーター（Bratter）症候群患者では高いとの報告
がある。また、尿性カリクレインの量は水電解質の代謝
に重要な関係があることが示されている。このため、尿
中に排出されるカリクレインの量的測定は、各種疾病の
診断においても臨床的な意義を有している。その定量的
測定法についても種々の検討がなされている。たとえ
ば、この定量的測定法としては、（１）血圧または血流
を測定することによる生物学的方法、（２）キニノーゲ
ンから遊離せしめるキニン遊離能の測定、（３）合成基
質を用いる酵素化学的測定法、（４）免疫化学的測定法
が知られている。
て、これまでにも種々の研究が行われてきている。たと
えば、尿性カリクレインの起源の一つは腎臓皮質の遠位
尿細管細胞であり、その腎臓での生理作用はNa+および
水の代謝調節が考えられている。臨床検査方法にも、本
態性の高血圧症患者の尿中に排出されるカリクレイン量
は正常人のそれと比べて低く、原発性アルドステロン
症、バーター（Bratter）症候群患者では高いとの報告
がある。また、尿性カリクレインの量は水電解質の代謝
に重要な関係があることが示されている。このため、尿
中に排出されるカリクレインの量的測定は、各種疾病の
診断においても臨床的な意義を有している。その定量的
測定法についても種々の検討がなされている。たとえ
ば、この定量的測定法としては、（１）血圧または血流
を測定することによる生物学的方法、（２）キニノーゲ
ンから遊離せしめるキニン遊離能の測定、（３）合成基
質を用いる酵素化学的測定法、（４）免疫化学的測定法
が知られている。
しかしながら一般に、生化学的手法による臨床検査方
法とそれに基づく疾病の診断方法については、今日でも
なお多くの努力や研究が行われているものの、検査結果
の示す数字の裏付けともいうべき診断の正確さ、的中率
などが必ずしも高くないものが多く、60〜70％位から、
30〜50％程度のものなどが含まれている。このため、他
の方法による結果と多角的に総合するなどして判定して
いる。このように、生体内の複雑極まる病変の情報を正
確にとらえることは困難を極めている。
法とそれに基づく疾病の診断方法については、今日でも
なお多くの努力や研究が行われているものの、検査結果
の示す数字の裏付けともいうべき診断の正確さ、的中率
などが必ずしも高くないものが多く、60〜70％位から、
30〜50％程度のものなどが含まれている。このため、他
の方法による結果と多角的に総合するなどして判定して
いる。このように、生体内の複雑極まる病変の情報を正
確にとらえることは困難を極めている。
今日の科学技術の大きな進歩にもかかわらず、いわゆ
る難病、奇病といわれるもののうちには、ほとんど適格
な検査方法や診断法に乏しい為、診断がほぼ確実になっ
た頃にはたいてい手のほどこし様のない手遅れの状態に
陥ってしまうものがあり、今日の医学の進歩をもってし
ても、運命のなせるいたずらとしてあきらめざるを得な
いものもある。たとえば、特殊なガン、特に膵臓ガンな
どはこの例である。
る難病、奇病といわれるもののうちには、ほとんど適格
な検査方法や診断法に乏しい為、診断がほぼ確実になっ
た頃にはたいてい手のほどこし様のない手遅れの状態に
陥ってしまうものがあり、今日の医学の進歩をもってし
ても、運命のなせるいたずらとしてあきらめざるを得な
いものもある。たとえば、特殊なガン、特に膵臓ガンな
どはこの例である。
このため、的中率の高い主要マーカーの探索研究が緊
急、かつ、極めて重要な課題になっている。
急、かつ、極めて重要な課題になっている。
カリクレインの有する生体に関する情報の有意義性に
ついても、このような生化学、医学の現状から、臨床的
利用についての要望がさらに一層高まってきている。カ
リクレインが関与すると思われる病変については、これ
までほとんど診断法あるいは検査方法が皆無に等しいも
の、さらには、的中率の低いものが少くないからであ
る。
ついても、このような生化学、医学の現状から、臨床的
利用についての要望がさらに一層高まってきている。カ
リクレインが関与すると思われる病変については、これ
までほとんど診断法あるいは検査方法が皆無に等しいも
の、さらには、的中率の低いものが少くないからであ
る。
カリクレインの有する生体情報を適確に取得し、その
内容を判定することは、臨床医学において、さらに基礎
医学、生化学において非常に大きな課題になっている。
内容を判定することは、臨床医学において、さらに基礎
医学、生化学において非常に大きな課題になっている。
（発明の目的） この発明のカリクレイン検出方法は、このような事情
を鑑みてなされたものであり、カリクレインの有する生
体情報の取得を的確、かつ容易とする新しい方法を提供
することを目的としている。
を鑑みてなされたものであり、カリクレインの有する生
体情報の取得を的確、かつ容易とする新しい方法を提供
することを目的としている。
（発明の開示） この発明は、上記の目的を実現するものとして、生体
組織または体液中のカリクレインに結合している糖鎖構
造の差異を生体の病態情報を反映する多様性プロフィル
として検出するカリクレインの検出方法であって、前記
プロフィルを複数種のレクチンを用いる交差免疫親和電
気泳動によって検出することを特徴とするカリクレイン
の検出方法をも提供する。
組織または体液中のカリクレインに結合している糖鎖構
造の差異を生体の病態情報を反映する多様性プロフィル
として検出するカリクレインの検出方法であって、前記
プロフィルを複数種のレクチンを用いる交差免疫親和電
気泳動によって検出することを特徴とするカリクレイン
の検出方法をも提供する。
以上のとおりのこの発明の方法は、この発明の発明者
によって行われてきたカリクレインについての一層正確
な病変の情報の取得と、的中率の高い診断法としての確
立に関する研究に基づいて完成されたものである。そし
て、この方法は、生体内や体液、たとえば尿中排出のカ
リクレイン量が、ある種の疾患において臨床的に変動す
ることに鑑み、単なる量的変動のみならず、質的変動、
すなわち、カリクレインに結合する糖鎖構造の多様性プ
ロフィールを詳細に検討することによって、的確な病変
の情報を取得し、ひいては的中率の高い診断法として確
立すべく努めてきた成果によるものである。
によって行われてきたカリクレインについての一層正確
な病変の情報の取得と、的中率の高い診断法としての確
立に関する研究に基づいて完成されたものである。そし
て、この方法は、生体内や体液、たとえば尿中排出のカ
リクレイン量が、ある種の疾患において臨床的に変動す
ることに鑑み、単なる量的変動のみならず、質的変動、
すなわち、カリクレインに結合する糖鎖構造の多様性プ
ロフィールを詳細に検討することによって、的確な病変
の情報を取得し、ひいては的中率の高い診断法として確
立すべく努めてきた成果によるものである。
すなわち、この発明の方法においては、生体各所の組
織や体液中に存在するカリクレインを同定するのに必要
な操作、たとえば、抽出や濃縮などを行い、従来公知の
犬を用いるin vivo血流増加活性の測定、合成基質を用
いる酵素化学的測定法、免疫化学的測定法などによっ
て、まず、カリクレインであることを特定する。これと
同時に、Ｎ−グリコシド型糖鎖の一次構造差異にもとづ
くカリクレイン類を多様性プロフィルを検討する。
織や体液中に存在するカリクレインを同定するのに必要
な操作、たとえば、抽出や濃縮などを行い、従来公知の
犬を用いるin vivo血流増加活性の測定、合成基質を用
いる酵素化学的測定法、免疫化学的測定法などによっ
て、まず、カリクレインであることを特定する。これと
同時に、Ｎ−グリコシド型糖鎖の一次構造差異にもとづ
くカリクレイン類を多様性プロフィルを検討する。
この糖鎖の構造差異性の検出には、各種のレクチン類
の固定化カラムクロマトグラフィーを用いることがまず
考えられる。
の固定化カラムクロマトグラフィーを用いることがまず
考えられる。
このカラムクロマトグラフィーでは、順次にクロマト
グラフィーを行って、複数種のレクチンの各々に対する
親和性の差によって、吸着されないで素通りするもの、
弱く吸着されるものであって、低イオン強度の溶出液で
すぐに溶出されるもの、さらに強く吸着されるものであ
って、高イオン強度の溶出液ではじめて溶出されるもの
などに区分する。この区分をプロフィールとして見るこ
とにより、生体のカリクレインが関与すると思われる病
態学的情報を正常コントロール群と比較しつつ、特異性
の高い臨床医学的知見として観察する。
グラフィーを行って、複数種のレクチンの各々に対する
親和性の差によって、吸着されないで素通りするもの、
弱く吸着されるものであって、低イオン強度の溶出液で
すぐに溶出されるもの、さらに強く吸着されるものであ
って、高イオン強度の溶出液ではじめて溶出されるもの
などに区分する。この区分をプロフィールとして見るこ
とにより、生体のカリクレインが関与すると思われる病
態学的情報を正常コントロール群と比較しつつ、特異性
の高い臨床医学的知見として観察する。
使用するレクチンとしては、コンカナバリンＡをはじ
めとして種々のものが考えられる。たとえばコンカナバ
リンＡの他のレクチン類としては、 Ｅ−PHA: Erythrocyte agglutinating phytohemagglutinin アカインゲンマメ レクチン Lentil−L: Lentil lectin レンズマメ レクチン WGA: Wheat grem agglutinin 小麦胚芽レクチン PNA: Peanut agglutinin ピーナツ レクチン SBA: Soy bean agglutinin 大豆レクチン その他 などを用いることができる。また、これらレクチンの種
類に対応して、糖鎖構造の差異による親和性のプロフィ
ールをクロマトグラフィーによってさらに詳しく検索す
ることができる。たとえば、次のようにして、多段階の
操作を行うことも有効である。これによってかなり詳し
い多様性糖鎖構造差異に関するプロフィールをみること
ができる。
めとして種々のものが考えられる。たとえばコンカナバ
リンＡの他のレクチン類としては、 Ｅ−PHA: Erythrocyte agglutinating phytohemagglutinin アカインゲンマメ レクチン Lentil−L: Lentil lectin レンズマメ レクチン WGA: Wheat grem agglutinin 小麦胚芽レクチン PNA: Peanut agglutinin ピーナツ レクチン SBA: Soy bean agglutinin 大豆レクチン その他 などを用いることができる。また、これらレクチンの種
類に対応して、糖鎖構造の差異による親和性のプロフィ
ールをクロマトグラフィーによってさらに詳しく検索す
ることができる。たとえば、次のようにして、多段階の
操作を行うことも有効である。これによってかなり詳し
い多様性糖鎖構造差異に関するプロフィールをみること
ができる。
一方、この発明では、交差免疫親和電気泳動法が採用
される。
される。
たとえば、電気泳動用の平板ゲルに、まず適当濃度の
レクチンを含ませて電気泳動させる。カリクレインの種
々の糖鎖による複数種のレクチンの各々に対する親和性
の差異によって易動度に差を生じさせる。さらに２次元
方向のゲルに適当濃度のカリクレイン抗体を含ませて電
気泳動させる。カリクレインの抗原抗体反応のアークを
生じさせ、多様な糖鎖をもつカリクレインを定性定量す
る。このような２次元電気泳動による方法は、臨床検査
方法として一般的にも賞用されていることからも、カリ
クレインにかかわる診断医学上の有用な情報をもたらす
ものといえる。
レクチンを含ませて電気泳動させる。カリクレインの種
々の糖鎖による複数種のレクチンの各々に対する親和性
の差異によって易動度に差を生じさせる。さらに２次元
方向のゲルに適当濃度のカリクレイン抗体を含ませて電
気泳動させる。カリクレインの抗原抗体反応のアークを
生じさせ、多様な糖鎖をもつカリクレインを定性定量す
る。このような２次元電気泳動による方法は、臨床検査
方法として一般的にも賞用されていることからも、カリ
クレインにかかわる診断医学上の有用な情報をもたらす
ものといえる。
このような手法を活用することによって、生体組織ま
たは体液中のカリクレインに結合している糖鎖構造の変
動の検出が可能になる。この検出から生体の病態情報を
取得する。
たは体液中のカリクレインに結合している糖鎖構造の変
動の検出が可能になる。この検出から生体の病態情報を
取得する。
さらに、この発明の方法について補足するならば、従
来は、特定の糖タンパク質の糖鎖構造の研究としては生
体試料からまずいったんこれを均質に純化し、その純品
について化学的処理を行うなど、糖鎖部分あるいはそれ
らの断片毎に各種のイオン交換体によるクロマトグラフ
ィー、分子ふるいゲル過法などを行いつつ、標準単糖
類あるいは寡糖類、多糖類などと比較しつつ１次構造を
推定していた。このため、極微量の糖タンパク質の純化
精製だけても数日間を要し、さらに通常の生体学的糖分
析に数日を要する状態であり、到底疾病の診断につなが
る方法といい難いものであった。
来は、特定の糖タンパク質の糖鎖構造の研究としては生
体試料からまずいったんこれを均質に純化し、その純品
について化学的処理を行うなど、糖鎖部分あるいはそれ
らの断片毎に各種のイオン交換体によるクロマトグラフ
ィー、分子ふるいゲル過法などを行いつつ、標準単糖
類あるいは寡糖類、多糖類などと比較しつつ１次構造を
推定していた。このため、極微量の糖タンパク質の純化
精製だけても数日間を要し、さらに通常の生体学的糖分
析に数日を要する状態であり、到底疾病の診断につなが
る方法といい難いものであった。
これに対して、この発明の方法では、これらの難点を
改善し、診断法として有効な情報を実用的な処理および
時間内に適用しえるものとした。
改善し、診断法として有効な情報を実用的な処理および
時間内に適用しえるものとした。
さらにこの発明を詳しく説明するために、次に実施例
を示す。
を示す。
もちろん、この発明は、以下の実施例によって限定さ
れるものではない。
れるものではない。
以下の実施例においては、ヒト尿中活性型カリクレイ
ンは、抗ヒト尿性カリクレイン抗体によって抑制された
Ｈ−Pro−Phe−Arg−MCA水解活性量、すなわち、加藤ら
の方法（H.Kato et.al,J.Biochem.87,1127（1980））に
準じて求めた。
ンは、抗ヒト尿性カリクレイン抗体によって抑制された
Ｈ−Pro−Phe−Arg−MCA水解活性量、すなわち、加藤ら
の方法（H.Kato et.al,J.Biochem.87,1127（1980））に
準じて求めた。
不活性型カリクレインはトリプシン処理後、新たに生
じた活性量として求めた。
じた活性量として求めた。
種々の患者の尿中カリクレインの糖鎖構造の多様性と
その変動は、カミングス（Cummings）とコルフェルド
（Korufeld）の方法（R.D.Cummings ＆ S.Korufeld,J.B
iol.Chem,257,11235,（1982））に準じ、種々のレクチ
ン固定化カラムに対する親和性を、カリクレイン活性を
指標として分析し、健常ヒト尿性カリクレインの場合と
比較した。
その変動は、カミングス（Cummings）とコルフェルド
（Korufeld）の方法（R.D.Cummings ＆ S.Korufeld,J.B
iol.Chem,257,11235,（1982））に準じ、種々のレクチ
ン固定化カラムに対する親和性を、カリクレイン活性を
指標として分析し、健常ヒト尿性カリクレインの場合と
比較した。
参考例１ ヒト尿300mlをセロファンチューブに入れ水道水に対
して３時間透析した。精製水で膨潤させたDEAE−セファ
デックスＡ−50を原尿100mlに対して7g（乾燥重量0.2g
相当）加え、電気伝導度1.0mmho/cm以下、pH6.0〜6.5の
条件で１時間攪拌した。ゲル過して集め、10mmho/cm
酢酸アンモニウム溶液、pH6.6に懸濁させてガラス製グ
リスフィルターに充填し、同溶液でこのフィルターから
の溶出液の280mmにおける吸光度が0.1以下になるまで十
分に洗浄した。次いで40mmho/cm酢酸アンモニウム溶
液、pH6.0で溶出を行った。
して３時間透析した。精製水で膨潤させたDEAE−セファ
デックスＡ−50を原尿100mlに対して7g（乾燥重量0.2g
相当）加え、電気伝導度1.0mmho/cm以下、pH6.0〜6.5の
条件で１時間攪拌した。ゲル過して集め、10mmho/cm
酢酸アンモニウム溶液、pH6.6に懸濁させてガラス製グ
リスフィルターに充填し、同溶液でこのフィルターから
の溶出液の280mmにおける吸光度が0.1以下になるまで十
分に洗浄した。次いで40mmho/cm酢酸アンモニウム溶
液、pH6.0で溶出を行った。
カリクレイン活性のある画分を集めたのち、食塩含有
0.01Mトリス塩酸緩衝液に対し透析し、これを濃縮ヒト
尿性カリクレインとした。
0.01Mトリス塩酸緩衝液に対し透析し、これを濃縮ヒト
尿性カリクレインとした。
次にコンカナバリンＡを固定化したセファロース4Bを
カラム（0.76x32.5cm）に充填し、食塩含有0.01Mトリス
塩酸緩衝液で平衡化した後、前記の濃縮ヒト尿性カリク
レイン（原尿40〜150ml相当量）を添加し、上記の平衡
化に用いた緩衝液て抽出（非親和性画分として8mlx10
本）させた後、10mMα−メチルグルコシドを含む同緩衝
液で溶出（弱親和性画分として8mlx10本）し、さらに、
500mMα−グルコシドを含む同緩衝液で溶出（強親和性
として8mlx10本）した。
カラム（0.76x32.5cm）に充填し、食塩含有0.01Mトリス
塩酸緩衝液で平衡化した後、前記の濃縮ヒト尿性カリク
レイン（原尿40〜150ml相当量）を添加し、上記の平衡
化に用いた緩衝液て抽出（非親和性画分として8mlx10
本）させた後、10mMα−メチルグルコシドを含む同緩衝
液で溶出（弱親和性画分として8mlx10本）し、さらに、
500mMα−グルコシドを含む同緩衝液で溶出（強親和性
として8mlx10本）した。
流速は100ml/hrで行った。
添付した第１図はこのようにして得られた溶出パター
ンを示し、これはカリクレインの糖鎖により多様性がコ
ンカナバリンＡへの親和性の差異にもとづいて得られた
溶出プロフィールを示している。この第１図のピーク
（ａ）は、非親和性の画分を、ピーク（ｂ）は、弱親和
性の画分を、また、ピーク（ｃ）は、強親和性の画分を
示している。また、実線は活性型カリクレイン、点線は
不活性型カリクレイン（活性化処理後検出）の場合につ
いて示している。
ンを示し、これはカリクレインの糖鎖により多様性がコ
ンカナバリンＡへの親和性の差異にもとづいて得られた
溶出プロフィールを示している。この第１図のピーク
（ａ）は、非親和性の画分を、ピーク（ｂ）は、弱親和
性の画分を、また、ピーク（ｃ）は、強親和性の画分を
示している。また、実線は活性型カリクレイン、点線は
不活性型カリクレイン（活性化処理後検出）の場合につ
いて示している。
横軸のFr.No.の線分で示した各画分を集め、その活性
量を測定した結果、各画分のカリクレインの相対量の比
は、次の第１表の通りであった。
量を測定した結果、各画分のカリクレインの相対量の比
は、次の第１表の通りであった。
参考例２ 参考例１と同様にして、各疾患患者のコンカナバリン
Ａ固定化セファロース4Bカラムクロマトグラフィーを行
った。
Ａ固定化セファロース4Bカラムクロマトグラフィーを行
った。
第２表は、その定量結果を平均値として示したもので
ある。表中の略記号は次のものを示している。
ある。表中の略記号は次のものを示している。
EH:本態性高血圧症、 CGN:慢性糸球対腎炎、 CRF:慢性腎不全、 NS:ネフローゼ症候群、 BS:バーター症候群、 PA:原発性アルドステロン症、 AP:急性膵臓炎 EH、APの場合には、健常人の場合に比べてコンカナバ
リンＡ非親和性の割合が活性型および不活性型のいずれ
においても有意に増大している。
リンＡ非親和性の割合が活性型および不活性型のいずれ
においても有意に増大している。
CRFでも同様の変化が認められる。
また、BS、PAでは、活性型、および不活性型のいずれ
のものも、弱親和性の割合が増加し、NSでは強親和性の
ものが増加している。特にNSでは、不活性型において顕
著であった。
のものも、弱親和性の割合が増加し、NSでは強親和性の
ものが増加している。特にNSでは、不活性型において顕
著であった。
実施例１ １次元ゲルとして75mMトリスベロナール緩衝液、pH8.
6に1.5％（W/V）に溶解したアガロースに、同緩衝液に
溶解したコンカナバリンＡ溶液を56℃に保ちつつ加え、
水平なガラス板（6.9x8.9cm）上に厚さ1.6mmとなるよう
に注ぎ、室温で静置してゲル化させた。その後、第２図
に示したように、破線に沿って切れ目を入れ、さらにパ
ンチャーで直径3mmの穴をあけて各検体溶液およびブロ
ムフェノールブルー・牛血清アルブミン複合体（BPB−A
lb）を11μ加え、2mA/cmの電流で、BPB−Albが7.5cm
移動するまで泳動させた。
6に1.5％（W/V）に溶解したアガロースに、同緩衝液に
溶解したコンカナバリンＡ溶液を56℃に保ちつつ加え、
水平なガラス板（6.9x8.9cm）上に厚さ1.6mmとなるよう
に注ぎ、室温で静置してゲル化させた。その後、第２図
に示したように、破線に沿って切れ目を入れ、さらにパ
ンチャーで直径3mmの穴をあけて各検体溶液およびブロ
ムフェノールブルー・牛血清アルブミン複合体（BPB−A
lb）を11μ加え、2mA/cmの電流で、BPB−Albが7.5cm
移動するまで泳動させた。
その後、第２図のように１次元ゲルを別のガラス板
（8.9x8.9cm）上に移し、残りの部分に抗ヒト尿性カリ
クレイン抗体0.1mg/mlを含む1.0％（W/V）のアガロース
溶液を厚さ1.6mmとなるように注いで２次元ゲルを作成
した。
（8.9x8.9cm）上に移し、残りの部分に抗ヒト尿性カリ
クレイン抗体0.1mg/mlを含む1.0％（W/V）のアガロース
溶液を厚さ1.6mmとなるように注いで２次元ゲルを作成
した。
2V/cmの電圧で、１次元の泳動とは直角方向に18時間
泳動させた。泳動後、ゲルを生理食塩水に２日間、さら
に精製水に３時間浸したのち、0.05％（W/V）クマジ−
ブリリアントブル−Ｒ−250を溶解した45％（V/V）メタ
ノール10％（V/V）酢酸混液中で１時間染色し、25％（V
/V）エタノールの10％（V/V）酢酸混液中で脱色して５
％（V/V）エタノールの８％（V/V）酢酸混液中で保存し
た。
泳動させた。泳動後、ゲルを生理食塩水に２日間、さら
に精製水に３時間浸したのち、0.05％（W/V）クマジ−
ブリリアントブル−Ｒ−250を溶解した45％（V/V）メタ
ノール10％（V/V）酢酸混液中で１時間染色し、25％（V
/V）エタノールの10％（V/V）酢酸混液中で脱色して５
％（V/V）エタノールの８％（V/V）酢酸混液中で保存し
た。
第３図は、この結果得られた正常ヒトの場合と急性膵
炎の場合に得られた泳動像を示す。これによって診断の
情報とすることができる。
炎の場合に得られた泳動像を示す。これによって診断の
情報とすることができる。
第３図のＸ軸方向は、１次元泳動を示し、Ｙ軸方向
は、２次元泳動を示している。Ｘ軸（１次元泳動）の場
合には、コンカナバリンＡに対する親和性（小→大）、
Ｙ軸（２次元泳動）の場合には、抗体と反応するカリク
レインの量（小→大）を示している。
は、２次元泳動を示している。Ｘ軸（１次元泳動）の場
合には、コンカナバリンＡに対する親和性（小→大）、
Ｙ軸（２次元泳動）の場合には、抗体と反応するカリク
レインの量（小→大）を示している。
第３図（１）の健常人の場合は、ピーク（ａ）および
（ｂ）のカリクレイン相対量の比が53.5％、46.5％であ
るが、第３図（２）のAP（急性膵炎）の患者の場合に
は、ピーク（ａ）と（ｂ）の比は、30.6％、62.6％と、
健常人とは大きく相違している。APの病態についての重
要な情報を与えている。
（ｂ）のカリクレイン相対量の比が53.5％、46.5％であ
るが、第３図（２）のAP（急性膵炎）の患者の場合に
は、ピーク（ａ）と（ｂ）の比は、30.6％、62.6％と、
健常人とは大きく相違している。APの病態についての重
要な情報を与えている。
実施例２ 実施例１と同様にして、EH、およびBS患者について尿
性カリクレインの交差親和免疫２次元電気泳動を行っ
た。
性カリクレインの交差親和免疫２次元電気泳動を行っ
た。
その結果は、第４図に示したとおりとなった。
EHの場合には、速く泳動される非親和性のもの割合が
増大し、逆にBSの場合には、遅く泳動される弱親和性の
割合が増加した。この結果は、コンカナバリンＡカラム
による分析とも一致している。
増大し、逆にBSの場合には、遅く泳動される弱親和性の
割合が増加した。この結果は、コンカナバリンＡカラム
による分析とも一致している。
また、コンカナバリンＡ以外のレクチン類を同様に用
いてのカラムによる分析により、病態によって誘発され
る糖鎖構造の差異にもとづく新しいプロフイールを把握
することができる。
いてのカラムによる分析により、病態によって誘発され
る糖鎖構造の差異にもとづく新しいプロフイールを把握
することができる。
第１図は、参考例としてのカラムクロマトグラフィーに
よる分析例を示し、第２図は、この発明の交差親和性免
疫電気泳動法のゲル作成法を示している。 また、第３図および第４図は、この電気泳動法による分
析の例を示している。
よる分析例を示し、第２図は、この発明の交差親和性免
疫電気泳動法のゲル作成法を示している。 また、第３図および第４図は、この電気泳動法による分
析の例を示している。
Claims (1)
- 【請求項１】生体組織または体液中のカリクレインに結
合している糖鎖構造の差異を生体の病態情報を反映する
多様性プロフィルとして検出するカリクレインの検出方
法であって、前記プロフィルを複数種のレクチンを用い
る交差免疫親和電気泳動によって検出することを特徴と
するカリクレインの検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61186211A JP2573189B2 (ja) | 1986-08-08 | 1986-08-08 | カリクレインの検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61186211A JP2573189B2 (ja) | 1986-08-08 | 1986-08-08 | カリクレインの検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6342468A JPS6342468A (ja) | 1988-02-23 |
| JP2573189B2 true JP2573189B2 (ja) | 1997-01-22 |
Family
ID=16184310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61186211A Expired - Lifetime JP2573189B2 (ja) | 1986-08-08 | 1986-08-08 | カリクレインの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2573189B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7018640B2 (en) | 1995-06-07 | 2006-03-28 | Pfizer Incorporated | In ovo vaccination against coccidiosis |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5796257A (en) * | 1980-12-05 | 1982-06-15 | Green Cross Corp:The | Kit for preparation of sample for inspection of urine callicrein |
-
1986
- 1986-08-08 JP JP61186211A patent/JP2573189B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４［１］（１９８１），ｐ１５−２０ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7018640B2 (en) | 1995-06-07 | 2006-03-28 | Pfizer Incorporated | In ovo vaccination against coccidiosis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6342468A (ja) | 1988-02-23 |
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