JP6720311B2 - 糖化アルブミンの測定方法 - Google Patents
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Description
このような背景のもと、本発明者は、ID−MS法で測定したGA値が認証値として定められた認証標準物質を上位基準とし、酵素法等による測定用の標準物質の値へと紐付けたトレーサビリティ体系を確立し(図1)、酵素法による測定対象物の測定値を、ID−MS法による測定対象物の測定値と一致させる方法を見出した。また、吸光度測定を用いた酵素法により、被験材料の、GA認証値にトレーサブルなGA値を、簡便且つ安価に、短時間で測定する方法を見出した。すなわち本発明は以下のとおりである。
以下の工程を含む、糖化アルブミン(GA)認証値にトレーサブルなGA値の測定方法:
A0)
被験材料のGA値の実測値をGA認証標準物質のGA認証値へ、
被験材料のGA濃度[P]の実測値をGA認証標準物質のGA濃度[L]へ、
被験材料のGA値の実測値をGA認証標準物質のGA認証値から被験材料に設定したGA値へ、又は
被験材料のGA濃度[P]の実測値をGA認証標準物質のGA濃度[L]から被験材料に設定したGA濃度[L]へ、
換算するための式を決定する工程;及び
F0)
GA認証標準物質のGA濃度[L]から換算したGA濃度[P]及びGA認証標準物質のアルブミン濃度から換算したアルブミン濃度を設定した標準物質を用いて作成した検量線を用いて、被験材料のGA濃度[P]及びアルブミン濃度を測定し、工程A0)で決定した回帰式を用いてGA認証値にトレーサブルなGA値を決定する工程
(上記各工程において、GA濃度[L]は、グルコースが結合したリジン残基(DOF−Lys)の濃度であり、GA濃度[P]は、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度である)。
[2]
以下の工程を含む、糖化アルブミン(GA)認証値にトレーサブルなGA値の測定方法:
A1)以下のb)、c)及びe0)〜h)を含む工程により、回帰式IIIを決定する工程;
b)以下の式1:
GA濃度[L](A)
=GA認証標準物質のGA認証値(B)×GA認証標準物質のアルブミン濃度(C) (式1)
を用いて、異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のGA濃度[L](A)を決定する工程;
c)2種以上のGA認証標準物質におけるGA由来の吸光度(D)を測定する工程;
e0)切片をゼロとする以下の直線の式II0:
D=α0E (式II0)
を作成する工程
(ここで、α0は、任意の正の値であり、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である);
f)式II0を用いて、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)を2種以上決定する工程;
g)以下の式2:
GA値(F)=GA濃度[P](E)/アルブミン濃度(C) (式2)
を用いて、GA値(F)を2種以上決定する工程;及び
h)2種以上のGA認証標準物質のGA認証値(B)と、対応する2種以上のGA値(F)とから回帰式III:
B=γF+δ (回帰式III)
を作成する工程
(上記各工程において、GA濃度[L]は、グルコースが結合したリジン残基(DOF−Lys)の濃度であり、GA濃度[P]は、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度である)。
[2−1]
式II0が以下のd)及びe)を含む工程により作成される式IIである、[2]に記載の方法。
d)2種以上のGA由来の吸光度(D)と、2種以上のGA濃度[L](A)とから、回帰式I:
D=αA+β (回帰式I)
を作成する工程;
e)回帰式Iの切片をゼロとする式II:
D=αE (式II)
を作成する工程。
[2−2]
式II0が以下のe1)を含む工程により作成される式II1である、[2]に記載の方法。
e1)切片をゼロとする以下の式II1:
D=α1E (式II1)
を作成する工程
(ここで、α1=[工程c)において測定したGA認証標準物質のうちの1種のGA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)]/[工程b)において決定した対応するGA認証標準物質のGA濃度[L](A)]である)。
[3]
さらに以下の工程を含む、[2]〜[2−2]のいずれかに記載の方法:
B)標準物質におけるGA由来の吸光度(G)を測定し、式II0、式II又は式II1を用いて対応するGA濃度[P](H)を決定する工程;及び
C)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定することにより、標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程。
[4]
工程C)が以下の工程C1)〜C3)を含む、[3]に記載の方法:
C1)GA認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(K)と、GA認証標準物質のアルブミン濃度(C)から、下記式3:
K=εC (式3)
を満たすεを決定する工程;
C2)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定する工程;及び
C3)吸光度(I)から、式3’:
I=εJ (式3’)
を用いて標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程。
[5]
工程b)に先立って、以下の工程a1)〜a3):
a1)以下の式4:
アルブミンモル認証値(L)
=アルブミン認証標準物質のアルブミン認証値/アルブミンの分子量 (式4)
を用いてアルブミンモル認証値(L)を決定する工程;
a2)アルブミン認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(M)を測定する工程;及び
a3)アルブミンモル認証値(L)と、吸光度(M)から、下記式5:
M=θL (式5)
を満たすθを決定する工程;
を含み、
工程C)が以下の工程C2)及びC4):
C2)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定する工程;及び
C4)吸光度(I)から、式5’:
I=θJ (式5’)
を用いて標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程;
を含む、[3]に記載の方法。
[6]
さらに以下の工程F1)〜F4)を含む、[2]〜[5]のいずれかに記載の方法:
F1)GA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するGA濃度[P](N)を決定する工程;
F2)工程F1)で用いたGA認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(K)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するアルブミン濃度(O)を決定する工程;
F3)下記式6:
GA認証標準物質のGA値(P)=GA濃度[P](N)/アルブミン濃度(O) (式6)
を用いてGA値(P)を決定する工程;及び
F4)GA値(P)と前記回帰式IIIを用いて、工程F1)で用いたGA認証標準物質の認証値にトレーサブルなGA値(Q)を決定する工程。
[7]
以下の工程を含む、糖化アルブミン(GA)認証値にトレーサブルなGA値の測定方法:
A2)以下のb)、c)、e0)、f)及びi)を含む工程により、回帰式IVを決定する工程;
b)以下の式1:
GA濃度[L](A)
=GA認証標準物質のGA認証値(B)×GA認証標準物質のアルブミン濃度(C) (式1)
を用いて、異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のGA濃度[L](A)を決定する工程;
c)2種以上のGA認証標準物質におけるGA由来の吸光度(D)を測定する工程;
e0)切片をゼロとする以下の直線の式II0:
D=α0E (式II0)
を作成する工程
(ここで、α0は、任意の正の値であり、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である);
f)式II0を用いて、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)を2種以上決定する工程;
i)2種以上のGA濃度[L](A)とGA濃度[P](E)とから、回帰式IV:
A=κE+λ (回帰式IV)
を作成する工程
(上記各工程中、GA濃度[L]は、グルコースが結合したリジン残基(DOF−Lys)の濃度であり、GA濃度[P]は、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度である)。
[7−1]
式II0が以下のd)及びe)を含む工程により作成される式IIである、[7]に記載の方法。
d)2種以上のGA由来の吸光度(D)と、2種以上のGA濃度[L](A)とから、回帰式I:
D=αA+β (回帰式I)
を作成する工程;
e)回帰式Iの切片をゼロとする式II:
D=αE (式II)
を作成する工程。
[7−2]
式II0が以下のe1)を含む工程により作成される式II1である、[7]に記載の方法。
e1)切片をゼロとする以下の式II1:
D=α1E (式II1)
を作成する工程
(ここで、α1=[工程c)において測定したGA認証標準物質のうちの1種のGA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)]/[工程b)において決定した対応するGA認証標準物質のGA濃度[L](A)]である)。
[8]
さらに以下の工程を含む、[7]〜[7−2]のいずれかに記載の方法:
B)標準物質におけるGA由来の吸光度(G)を測定し、式II0、式II又は式II1を用いて対応するGA濃度[P](H)を決定する工程;
C)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定することにより、標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程。
[9]
さらに以下の工程を含む、[7]〜[8]のいずれかに記載の方法:
F1)GA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応する酵素法によるGA濃度[P](N)を決定する工程;
F2)工程F1)で用いたGA認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(K)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するアルブミン濃度(O)を決定する工程;
F5)GA濃度[P](N)から回帰式IVを用いて、GA認証標準物質のGA濃度[L](R)を決定する工程;及び
F6)下記式7:
GA認証標準物質のGA値(Q1’)=GA濃度[L](R)/アルブミン濃度(O) (式7)
を用いて、工程F1)で用いたGA認証標準物質の認証値にトレーサブルなGA値(Q1’)を決定する工程。
[10]
以下の工程を含む、糖化アルブミン(GA)認証値にトレーサブルなGA値の測定方法:
A3)以下のb)〜e0)及びj)〜o)を含む工程により、回帰式Vを決定する工程;
b)以下の式1:
GA濃度[L](A)
=GA認証標準物質のGA認証値(B)×GA認証標準物質のアルブミン濃度(C) (式1)
を用いて、異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のGA濃度[L](A)を決定する工程;
c)2種以上のGA認証標準物質におけるGA由来の吸光度(D)を測定する工程;
d)2種以上のGA由来の吸光度(D)と、2種以上のGA濃度[L](A)とから、回帰式I:
D=αA+β (回帰式I)
を作成する工程;
e0)切片をゼロとする以下の直線の式II0:
D=α0E (式II0)
を作成する工程
(ここで、α0は、任意の正の値であり、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である);
j)2種以上の被験材料におけるGA由来の吸光度(S)を測定し、回帰式Iを用いて対応するGA濃度[L](T)を決定する工程;
k)2種以上の被験材料におけるアルブミン由来の吸光度(U)を測定し、アルブミン濃度(V)を決定する工程;
l)以下の式8:
GA値1(W)=GA濃度[L](T)/アルブミン濃度(V) (式8)
を用いて、2種以上の被験材料のGA値1(W)をGA濃度[L](T)から決定する工程;
m)2種以上の被験材料におけるGA由来の吸光度(S)から、式II0を用いて対応するGA濃度[P](X)を決定する工程;
n)以下の式9:
GA値2(Y)=GA濃度[P](X)/アルブミン濃度(V) (式9)
を用いて、2種以上の被験材料のGA値2(Y)をGA濃度[P](X)から決定する工程;
o)2種以上の被験材料のGA値1(W)と、対応する2種以上のGA値2(Y)とから回帰式V:
W=πY+φ (回帰式V)
を作成する工程
(上記各工程中、GA濃度[L]は、グルコースが結合したリジン残基(DOF−Lys)の濃度であり、GA濃度[P]は、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度である)。
[10−1]
式II0が以下のe)を含む工程により作成される式IIである、[10]に記載の方法。
e)回帰式Iの切片をゼロとする式II:
D=αE (式II)
を作成する工程;
[10−2]
式II0が以下のe1)を含む工程により作成される式II1である、[10]に記載の方法。
e1)切片をゼロとする以下の式II1:
D=α1E (式II1)
を作成する工程
(ここで、α1=[工程c)において測定したGA認証標準物質のうちの1種のGA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)]/[工程b)において決定した対応するGA認証標準物質のGA濃度[L](A)]である)。
[11]
さらに以下の工程を含む、[10]〜[10−2]のいずれかに記載の方法:
B)標準物質におけるGA由来の吸光度(G)を測定し、式II0、式II又は式II1を用いて対応するGA濃度[P](H)を決定する工程;
C)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定することにより、標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程。
[12]
さらに以下の工程を含む、[10]〜[11]のいずれかに記載の方法:
F1’)被験材料のGA由来の吸光度(S)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するGA濃度[P](N’)を決定する工程;
F2’)工程F1’)で用いた被験材料のアルブミン由来の吸光度(U)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するアルブミン濃度(O’)を決定する工程;及び
F3’)下記式6’:
被験材料のGA値(P’)=GA濃度[P](N’)/アルブミン濃度(O’)(式6’)
を用いてGA値(P’)を決定する工程。
F4’)GA値(P’)と前記回帰式Vを用いて、工程F1’)で用いた被験材料に値付けた認証GA値1(W)にトレーサブルなGA値(Q2’)を決定する工程。
[13]
以下の工程を含む、糖化アルブミン(GA)認証値にトレーサブルなGA値の測定方法
A4)以下のb)〜e0)、j)、m)、及びp)を含む工程により、回帰式VIを決定する工程;
b)以下の式1:
GA濃度[L](A)
=GA認証標準物質のGA認証値(B)×GA認証標準物質のアルブミン濃度(C) (式1)
を用いて、異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のGA濃度[L](A)を決定する工程;
c)2種以上のGA認証標準物質におけるGA由来の吸光度(D)を測定する工程;
d)2種以上のGA由来の吸光度(D)と、2種以上のGA濃度[L](A)とから、回帰式I:
D=αA+β (回帰式I)
を作成する工程;
e0)切片をゼロとする以下の直線の式II0:
D=α0E (式II0)
を作成する工程
(ここで、α0は、任意の正の値であり、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である);
j)2種以上の被験材料におけるGA由来の吸光度(S)を測定し、回帰式Iを用いて対応するGA濃度[L](T)を決定する工程;
m)2種以上の被験材料におけるGA由来の吸光度(S)から、式II0を用いて対応するGA濃度[P](X)を決定する工程;及び
p)2種以上の被験材料のGA濃度[L](T)とGA濃度[P](X)とから、回帰式VI:
T=ψX+ω (回帰式VI)
を作成する工程
(上記各工程中、GA濃度[L]は、グルコースが結合したリジン残基(DOF−Lys)の濃度であり、GA濃度[P]は、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度である)。
[13−1]
式II0が以下のe)を含む工程により作成される式IIである、[13]に記載の方法。
e)回帰式Iの切片をゼロとする式II:
D=αE (式II)
を作成する工程。
[13−2]
式II0が以下のe1)を含む工程により作成される式II1である、[13]に記載の方法。
e1)切片をゼロとする以下の式II1:
D=α1E (式II1)
を作成する工程
(ここで、α1=[工程c)において測定したGA認証標準物質のうちの1種のGA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)]/[工程b)において決定した対応するGA認証標準物質のGA濃度[L](A)]である)。
[14]
さらに以下の工程を含む、[13]〜[13−2]のいずれかに記載の方法。
B)標準物質におけるGA由来の吸光度(G)を測定し、式II0、式II又は式II1を用いて対応するGA濃度[P](H)を決定する工程;及び
C)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定することにより、標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程。
[15]
工程b)に先立って、さらに以下の工程a1)〜a3):
a1)下記式4:
アルブミンモル認証値(L)
=アルブミン認証標準物質のアルブミン認証値/アルブミンの分子量 (式4)
を用いてアルブミンモル認証値(L)を決定する工程;
a2)アルブミン認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(M)を測定する工程;
a3)アルブミンモル認証値(L)と、吸光度(M)から、下記式5:
M=θL (式5)
を満たすθを決定する工程;
を含み、工程A4)がさらに以下の工程k):
k)2種以上の被験材料におけるアルブミン由来の吸光度(U)を測定し、アルブミン濃度(V)を決定する工程;
を含み、工程A4)が、工程j)及びk)より後に、さらに以下の工程l):
l)以下の式8:
GA値1(W)=GA濃度[L](T)/アルブミン濃度(V) (式8)
を用いて、2種以上の被験材料におけるGA値1(W)をGA濃度[L](T)から決定する工程;
を含み、方法がさらに以下の工程:
F1’)被験材料のGA由来の吸光度(S)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応する酵素法によるGA濃度[P](N’)を決定する工程;
F2’)工程F1’)で用いた被験材料のアルブミン由来の吸光度(U)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するアルブミン濃度(O’)を決定する工程;
F5’)GA濃度[P](N’)から回帰式VIを用いて、被験材料のGA濃度[L](R’)を決定する工程;及び
F6’)下記式7’:
被験材料のGA値(Q3’)=GA濃度[L](R’)/アルブミン濃度(O’)(式7’)
を用い、工程F1’)で用いた被験材料に設定したGA認証値1(W)にトレーサブルなGA値(Q3’)を決定する工程;
を含む、[13]〜[14]のいずれかに記載の方法。
[16]
3種以上のGA認証標準物質を用いる、[1]〜[15]のいずれかに記載の方法。
[17]
前記GA認証値が、同位体希釈質量分析(ID−MS)法によるGA認証値である、[1]〜[16]のいずれかに記載の方法。
[18]
前記GA認証値が、同位体希釈質量分析(ID−MS)法によるGA認証値であり、前記GA認証標準物質がJCCRM 611である、[1]〜[16]のいずれかに記載の方法。
[19]
[2]、[2−1]又は[2−2]の方法で決定された回帰式III、[7]、[7−1]又は[7−2]の方法で決定された回帰式IV、[10]、[10−1]又は[10−2]の方法で決定された回帰式V及び[13]、[13−1]又は[13−2]の方法で決定された回帰式VIからなる群から選択される回帰式;
GA測定用試薬;
アルブミン測定用試薬;及び
標準物質;
を含む、GA値測定用キット。
[20]
[2]、[2−1]又は[2−2]の方法で決定された式III、[7]、[7−1]又は[7−2]の方法で決定された式IV、[10]、[10−1]又は[10−2]の方法で決定された式V及び[13]、[13−1]又は[13−2]の方法で決定された式VIからなる群から選択される式が設定された演算部;
式II0、式II又は式II1によってGA濃度[P]が設定された標準物質を用いて検量線を作成する検量線作成部、若しくは式II0、式II又は式II1が演算に組み込まれている検量線作成部;
及び
GA値を測定する測定部;
を含む、糖化アルブミン(GA)認証値にトレーサブルなGA値の測定装置。
[21]
以下の1)標準物質と2)演算プログラムを用いることを特徴とする、糖化アルブミン(GA)認証値にトレーサブルなGA値の測定方法:
1)上記工程e0)で作成された式II0、工程e)で作成された式II又は工程e1)で作成された式II1によってGA濃度[P]が設定された標準物質;及び
2)[2]、[2−1]又は[2−2]の方法で決定された式III、[7]、[7−1]又は[7−2]の方法で決定された式IV、[10]、[10−1]又は[10−2]の方法で決定された式V及び[13]、[13−1]又は[13−2]の方法で決定された式VIからなる群から選択される式が組み込まれた演算プログラム。
本実施形態において、糖化アルブミン(GA。グリコアルブミンともいう。)とは、以下に詳述するJSCC勧告法により定義される、「グルコースが結合したリジン残基、(Nε-(1-deoxy-D-fructose-1-yl)-L-lysine,DOF−Lys)を有するアルブミン」である。
GA値=GA濃度/アルブミン濃度
ここで、GA濃度については、測定原理の違いから、酵素法を用いて測定した場合のGA濃度は糖化アミノ酸もしくは糖化ペプチドの濃度を指し、本実施形態において、GA濃度[P]ということがある。一方、ID−MS法を用いて測定した場合のGA濃度はDOF−Lys濃度を指し、本実施形態において、GA濃度[L]ということがある。
工程b)は、式1(GA濃度[L](A)=GA認証標準物質のGA認証値(B)×GA認証標準物質のアルブミン濃度(C))を用いて、異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のGA濃度[L](A)を決定する工程である。ここで、GA認証標準物質のアルブミン濃度(C)は、任意の方法で測定又は決定することができ、たとえば、酵素法等を用いて測定することができる。また、GA認証標準物質の認証書に記載のアルブミン濃度を参考値として用いて工程b)を実施することも可能である。
吸光度の測定は、公知の任意の手法を用いて実施することができる。例えば、特開2001−54398号公報等に記載の方法を参照してGAの測定用試薬を用いて実施することができる。GAの測定用試薬としては、酸化酵素、分解酵素、発色剤などを含み、GAを酸化/分解するなどして過酸化水素を生じさせ、その過酸化水素と反応した発色剤の吸光度を測定してGA濃度を測定できるものであれば特に限定されない。GAの測定用試薬は、後述する標準物質を含んでもよく、希釈液、安定化剤などの他の成分を含んでもよい。また、各成分がそれぞれ異なる容器に収容されていてもよい。試薬の具体例については、後述の実施例を参照することができ、例えば、GA試薬 ルシカ(登録商標)GA−L等を用いることができるが、これに限定されない。
D=αA+β (回帰式I)
を作成する工程である。工程d)は、例えば、後述の実施例に示すとおり、2種以上のGA由来の吸光度(D)を縦軸に、2種以上のGA濃度[L](A)を横軸にプロットし、回帰直線式を設定することにより実施することができる。
D=α0E (式II0)
を作成する工程である。ここで、Eは、GA由来の吸光度Dと比例するGA濃度[P](E)である。工程e0)は、任意の正の傾きα0を設定することにより実施することができる。また、工程e0)は、工程c)を実施後、工程d)を行わずに実施することができる。
D=αE (式II)
を作成する工程である。ここでEは、GA由来の吸光度Dと比例するGA濃度[P](E)である。
D=α1E (式II1)
を作成する工程である。ここで、傾きα1は、[工程c)において測定したGA認証標準物質のうちの1種のGA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)]/[工程b)において決定した対応するGA認証標準物質のGA濃度[L](A)]であり、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である。
工程e1)は、例えば、後述の実施例に示すとおり、GA認証標準物質HHにおけるGA由来の吸光度(D)を縦軸に、対応するGA濃度[L](A)横軸にプロットし、この点と原点との2点を通る直線式を設定することにより実施することができる。
B=γF+δ (回帰式III)
を作成する工程である。工程h)は、例えば、後述の実施例に示すとおり、2種以上のGA認証標準物質のGA認証値(B)を縦軸に、対応する2種以上のGA値(F)を横軸にプロットし、回帰直線式を設定することにより実施することができる。
このように回帰式IIIを設定することで、GA認証標準物質のGA認証値と、GA認証標準物質を酵素法で測定した場合のGA値とを相関させることができる。
B)標準物質におけるGA由来の吸光度(G)を測定し、式II0、式II又は式II1を用いて対応するGA濃度[P](H)を決定する工程;及び
C)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定することにより、標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程;
を含むことができる。これらの工程により、認証値から換算した濃度を標準物質に値付けることができる。なお、アルブミン由来の吸光度とは、アルブミン測定用試薬等によって得られるアルブミンに基づく吸光度であり、実際に被験材料を、アルブミン測定用試薬を用いて測定した際に得られた吸光度からブランク吸光度を引いた値や、HPLC等でアルブミンを分離してアルブミン測定用試薬等によって測定される吸光度である。
、Glycated albumin Calibrator(IVDLab CO.,LTD)、Glycated Serum Protein Assay Calibrators(Diazyme Laboratories)、及び糖化白蛋白校准品(寧波美康生物科技有限公司)等が挙げられる。
及びGlycated serum albumin(IVDLab CO.,LTD)等を用いることができるが、これに限定されない。
C1)GA認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(K)と、GA認証標準物質のアルブミン濃度(C)から、下記式3:
K=εC (式3)
を満たすεを決定する工程;
C2)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定する工程;及び
C3)吸光度(I)から、式3’:
I=εJ (式3’)
を用いて標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程;
を含み、これにより標準物質のアルブミン濃度(J)を決定することができる。
工程C1)におけるGA認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(K)及びC2)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)は、工程C)を参照して測定することができる。
a1)以下の式4:
アルブミンモル認証値(L)
=アルブミン認証標準物質のアルブミン認証値/アルブミンの分子量 (式4)
を用いてアルブミンモル認証値(L)を決定する工程;
a2)アルブミン認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(M)を測定する工程;及び
a3)アルブミンモル認証値(L)と、吸光度(M)から、下記式5:
M=θL (式5)
を満たすθを決定する工程;
を含み、
工程C)が以下の工程C2)及びC4):
C2)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定する工程;及び
C4)吸光度(I)から、式5’:
I=θJ (式5’)
を用いて標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程;
を含み、これにより標準物質のアルブミン濃度(J)を決定することができる。
F1)GA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するGA濃度[P](N)を決定する工程;
F2)工程F1)で用いたGA認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(K)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するアルブミン濃度(O)を決定する工程;
F3)下記式6:
GA認証標準物質のGA値(P)=GA濃度[P](N)/アルブミン濃度(O) (式6)
を用いてGA値(P)を決定する工程;及び
F4)GA値(P)と前記回帰式IIIを用いて、工程F1)で用いたGA認証標準物質の認証値にトレーサブルなGA値(Q)を決定する工程;
を含むことができる。これらの工程により、標準物質を用いた検量線で認証標準物質を測定して換算することで認証値が算出できることを確認できる。
工程F1)における検量線の作成は、GA濃度[P]の規定された標準物質について、工程c)の方法と同様にGA由来の吸光度を測定して実施することができる。
工程F2)における検量線の作成は、アルブミン濃度の規定された標準物質について、工程C)の方法と同様にアルブミン由来の吸光度を測定して実施することができる。
工程F3)では、工程F1)で決定したGA濃度[P](N)を、工程F2)で決定したアルブミン濃度(O)で割ることにより、GA認証標準物質のGA値(P)を決定する。この際、GA値の単位をmmol/molにするために適宜単位合わせをしてもよい。例えば、GA濃度[P](μmol/L)をアルブミン濃度(μmol/L)で割る場合、1000をかけて単位合わせをすることができる。
さらに工程F4)で、GA値(P)、回帰式IIIを用いて、すなわち、Q=γP+δに当てはめることにより、工程F1)で用いたGA認証標準物質の認証値にトレーサブルなGA値(Q)を決定することができる。工程F4で得られたGA値(Q)が、工程F1)で用いたGA認証標準物質の認証値と一致することを確認することで、回帰式IIIを用いてGA値のトレーサビリティ体系が確立したことを確認することができる。すなわち、GA認証値にトレーサブルなGA値を、回帰式IIIと酵素法を用いて、簡便に測定可能であることが確認される。
工程a)は、上記工程C)を参照して実施することができ、例えば、BCG法、BCP法又は改良BCP法を用いて実施することができる。
a1)以下の式4:
アルブミンモル認証値(L)
=アルブミン認証標準物質のアルブミン認証値/アルブミンの分子量 (式4)
を用いてアルブミンモル認証値(L)を決定する工程;
a2)アルブミン認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(M)を測定する工程;
a3)アルブミンモル認証値(L)と、吸光度(M)から、下記式5:
M=θL (式5)
を満たすθを決定する工程;
a4)異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(Z)を測定する工程;及び
a5)吸光度(Z)から、下記式5’’:
Z=θC (式5’’)
を用いてアルブミン濃度(C)を決定する工程;
を含むことができる。
工程a1)〜a3)は、上述したとおりに実施することができる。工程a4)は、工程C)を参照して実施することができる。
b)以下の式1:
GA濃度[L](A)
=GA認証標準物質のGA認証値(B)×GA認証標準物質のアルブミン濃度(C) (式1)
を用いて、異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のGA濃度[L](A)を決定する工程;
c)2種以上のGA認証標準物質におけるGA由来の吸光度(D)を測定する工程;
e0)切片をゼロとする以下の直線の式II0:
D=α0E (式II0)
を作成する工程
(ここで、α0は、任意の正の値であり、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である);
f)式II0を用いて、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)を2種以上決定する工程;及び
i)2種以上のGA濃度[L](A)とGA濃度[P](E)とから、回帰式IV:
A=κE+λ (回帰式IV)
を作成する工程。
d)2種以上のGA由来の吸光度(D)と、2種以上のGA濃度[L](A)とから、回帰式I:
D=αA+β (回帰式I)
を作成する工程;
e)回帰式Iの切片をゼロとする式II:
D=αE (式II)
を作成する工程。
e1)切片をゼロとする以下の式II1:
D=α1E (式II1)
を作成する工程
(ここで、α1=[工程c)において測定したGA認証標準物質のうちの1種のGA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)]/[工程b)において決定した対応するGA認証標準物質のGA濃度[L](A)]である)。
工程i)は、例えば、後述の実施例に示すとおり、2種以上のGA濃度[L](A)を縦軸に、2種以上のGA濃度[P](E)を横軸にプロットし、回帰直線式を設定することにより実施することができる。
このように回帰式IVを設定することで、GA認証標準物質のGA濃度[L]と、GA認証標準物質を酵素法で測定した場合のGA濃度[P]とを相関させることができ、この回帰式IVとアルブミン濃度の測定値を用いて、GA認証標準物質のGA認証値と、GA認証標準物質を酵素法で測定した場合のGA値とを相関させることができる。
B)標準物質におけるGA由来の吸光度(G)を測定し、式II0、式II又は式II1を用いて対応するGA濃度[P](H)を決定する工程;
C)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定することにより、標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程。
工程B)及びC)は、上述のとおりに実施することができる。これらの工程により、認証値から換算した濃度を標準物質に値付けることができる。
F1)GA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応する酵素法によるGA濃度[P](N)を決定する工程;
F2)工程F1)で用いたGA認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(K)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するアルブミン濃度(O)を決定する工程;
F5)GA濃度[P](N)から回帰式IVを用いて、GA認証標準物質のGA濃度[L](R)を決定する工程;及び
F6)下記式7:
GA認証標準物質のGA値(Q1’)=GA濃度[L](R)/アルブミン濃度(O) (式7)
を用いて、工程F1)で用いたGA認証標準物質の認証値にトレーサブルなGA値(Q1’)を決定する工程。
工程F5)において、工程F1)で得たGA濃度[P](N)から回帰式IVを用いて、GA認証標準物質のGA濃度[L](R)を決定し、さらに、工程F6)において、GA認証標準物質のGA値(Q1’)を決定することができる。なお、工程F6において、GA値の単位をmmol/molにするために適宜単位合わせをしてもよい。例えば、GA濃度[P](μmol/L)をアルブミン濃度(μmol/L)で割る場合、1000をかけて単位合わせをすることができる。
工程F5)で得られたGA値(Q1’)が、工程F1)で用いたGA認証標準物質の認証値と一致することを確認することで、回帰式IVを用いてGA値のトレーサビリティ体系が確立したことを確認することができる。すなわち、GA認証値にトレーサブルなGA値を、回帰式IVと酵素法を用いて、簡便に測定可能であることが確認される。
b)以下の式1:
GA濃度[L](A)
=GA認証標準物質のGA認証値(B)×GA認証標準物質のアルブミン濃度(C) (式1)
を用いて、異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のGA濃度[L](A)を決定する工程;
c)2種以上のGA認証標準物質におけるGA由来の吸光度(D)を測定する工程;
d)2種以上のGA由来の吸光度(D)と、2種以上のGA濃度[L](A)とから、回帰式I:
D=αA+β (回帰式I)
を作成する工程;
e0)切片をゼロとする以下の直線の式II0:
D=α0E (式II0)
を作成する工程
(ここで、α0は、任意の正の値であり、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である);
j)2種以上の被験材料におけるGA由来の吸光度(S)を測定し、回帰式Iを用いて対応するGA濃度[L](T)を決定する工程;
k)2種以上の被験材料におけるアルブミン由来の吸光度(U)を測定し、アルブミン濃度(V)を決定する工程;
l)以下の式8:
GA値1(W)=GA濃度[L](T)/アルブミン濃度(V) (式8)
を用いて、2種以上の被験材料のGA値1(W)をGA濃度[L](T)から決定する工程;
m)2種以上の被験材料におけるGA由来の吸光度(S)から、式II0を用いて対応するGA濃度[P](X)を決定する工程;
n)以下の式9:
GA値2(Y)=GA濃度[P](X)/アルブミン濃度(V) (式9)
を用いて、2種以上の被験材料のGA値2(Y)をGA濃度[P](X)から決定する工程;
o)2種以上の被験材料のGA値1(W)と、対応する2種以上のGA値2(Y)とから回帰式V:
W=πY+φ (回帰式V)
を作成する工程。
e)回帰式Iの切片をゼロとする式II:
D=αE (式II)
を作成する工程
(ここで、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である)。
e1)切片をゼロとする以下の式II1:
D=α1E (式II1)
を作成する工程
(ここで、α1=[工程c)において測定したGA認証標準物質のうちの1種のGA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)]/[工程b)において決定した対応するGA認証標準物質のGA濃度[L](A)]である)。
工程j)及びk)は、工程B)及びC)を参照して実施することができる。なお、本実施形態において、「被験材料」は、糖化アルブミンを含有する限り特に限定されず、如何なるものを用いてもよいが、好ましくは、血液由来成分、例えば血清、血漿、全血、血液成分を加工し得られた物等を用いることができる。具体例としては、健常人検体、患者検体、GA−L 管理血清(旭化成ファーマ(株))、GA−Lキャリブレーター(旭化成ファーマ(株))等が挙げられる。
工程l)〜n)は、各工程の手順に従い、後述の実施例も参照して実施することができる。工程o)は、後述の実施例に示すとおり、2種以上のGA値1(W)を縦軸に、対応する2種以上のGA値2(Y)を横軸にプロットし、回帰直線式を設定することにより実施することができる。
この方法によれば、回帰式Iを経由して任意の被験材料のGA値1(W)を設定し、酵素法由来の被験材料のGA値2(Y)と、回帰式Vで相関させることができる。
被験材料のGA由来の吸光度(S)から、回帰式Iを用いて対応するGA濃度[L](T)を求める工程;
吸光度(S)とGA濃度[L](T)とから回帰式I’を作成する工程;
回帰式I’の切片をゼロとする式II’を作成する工程;
を含む方法で作成される式II’を用いて実施することもできる。
また、上記の工程f)、m)及び工程B)は、式II0の代わりに、下記の工程:
被験材料のGA由来の吸光度(S)から、回帰式Iを用いて対応するGA濃度[L](T)を求める工程;
吸光度(S)と対応するGA濃度[L](T)とから設定される点及び原点との2点を通過する、切片をゼロとする式II’’を作成する工程;
を含む方法で作成される式II’’を用いて実施することもできる。
被験材料のGA由来の吸光度(S)から、回帰式Iを用いて対応するGA濃度[L](T)を求める工程;
吸光度(S)、とGA濃度[L](T)とから回帰式I’を作成する工程;
を含む方法で作成される回帰式I’を用いて実施することもできる。
B)標準物質におけるGA由来の吸光度(G)を測定し、式II0、式II又は式II1を用いて対応するGA濃度[P](H)を決定する工程;
C)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定することにより、標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程。
工程B)及びC)は、上述のとおりに実施することができる。これらの工程により、認証値から換算した濃度を標準物質に値付けることができる。
F1’)被験材料のGA由来の吸光度(S)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するGA濃度[P](N’)を決定する工程;
F2’)工程F1’)で用いた被験材料のアルブミン由来の吸光度(U)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するアルブミン濃度(O’)を決定する工程;及び
F3’)下記式6’:
被験材料のGA値(P’)=GA濃度[P](N’)/アルブミン濃度(O’)(式6’)
を用いてGA値(P’)を決定する工程。
F4’)GA値(P’)と前記回帰式Vを用いて、工程F1’)で用いた被験材料に値付けた認証GA値1(W)にトレーサブルなGA値(Q2’)を決定する工程。
工程F4’)で得られたGA値(Q2’)が、工程F1’)で用いた被験材料に値付けた認証GA値1(W)と一致することを確認することで、回帰式Vを用いてGA値のトレーサビリティ体系が確立したことを確認することができる。すなわち、GA認証値にトレーサブルなGA値を、回帰式Vと酵素法を用いて、簡便に測定可能であることが確認される。
b)以下の式1:
GA濃度[L](A)
=GA認証標準物質のGA認証値(B)×GA認証標準物質のアルブミン濃度(C) (式1)
を用いて、異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のGA濃度[L](A)を決定する工程;
c)2種以上のGA認証標準物質におけるGA由来の吸光度(D)を測定する工程;
d)2種以上のGA由来の吸光度(D)と、2種以上のGA濃度[L](A)とから、回帰式I:
D=αA+β (回帰式I)
を作成する工程;
e0)切片をゼロとする以下の直線の式II0:
D=α0E (式II0)
を作成する工程
(ここで、α0は、任意の正の値であり、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である);
j)2種以上の被験材料におけるGA由来の吸光度(S)を測定し、回帰式Iを用いて対応するGA濃度[L](T)を決定する工程;
m)2種以上の被験材料におけるGA由来の吸光度(S)から、式II0を用いて対応するGA濃度[P](X)を決定する工程;及び
p)2種以上の被験材料のGA濃度[L](T)とGA濃度[P](X)とから、回帰式VI:
T=ψX+ω (回帰式VI)
を作成する工程。
e)回帰式Iの切片をゼロとする式II:
D=αE (式II)
を作成する工程
(ここで、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である)。
e1)切片をゼロとする以下の式II1:
D=α1E (式II1)
を作成する工程
(ここで、α1=[工程c)において測定したGA認証標準物質のうちの1種のGA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)]/[工程b)において決定した対応するGA認証標準物質のGA濃度[L](A)]である)。
工程p)は、例えば、後述の実施例に示すとおり、2種以上のGA濃度[L](T)を縦軸に、2種以上のGA濃度[P](X)を横軸にプロットし、回帰直線式を設定することにより実施することができる。
この方法によれば、回帰式Iを経由して任意の被験材料のGA濃度[L](T)を決定し、式II0を経由して任意の被験材料のGA濃度[P](X)を決定し、両者を回帰式VIで相関させることができる。
B)標準物質におけるGA由来の吸光度(G)を測定し、式II0、式II又は式II1を用いて対応するGA濃度[P](H)を決定する工程;
C)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定することにより、標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程。
工程B)及びC)は、上述のとおりに実施することができる。これらの工程により、認証値から換算した濃度を標準物質に値付けることができる。
a1)下記式4:
アルブミンモル認証値(L)
=アルブミン認証標準物質のアルブミン認証値/アルブミンの分子量 (式4)
を用いてアルブミンモル認証値(L)を決定する工程;
a2)アルブミン認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(M)を測定する工程;
a3)アルブミンモル認証値(L)と、吸光度(M)から、下記式5:
M=θL (式5)
を満たすθを決定する工程;
を含み、工程A4)がさらに以下の工程k):
k)2種以上の被験材料におけるアルブミン由来の吸光度(U)を測定し、アルブミン濃度(V)を決定する工程;
を含み、工程A4)が、工程j)及びk)より後に、さらに以下の工程l):
l)以下の式8:
GA値1(W)=GA濃度[L](T)/アルブミン濃度(V) (式8)
を用いて、2種以上の被験材料におけるGA値1(W)をGA濃度[L](T)から決定する工程;
を含み、方法がさらに以下の工程:
F1’)被験材料のGA由来の吸光度(S)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応する酵素法によるGA濃度[P](N’)を決定する工程;
F2’)工程F1’)で用いた被験材料のアルブミン由来の吸光度(U)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するアルブミン濃度(O’)を決定する工程;
F5’)GA濃度[P](N’)から回帰式VIを用いて、被験材料のGA濃度[L](R’)を決定する工程;及び
F6’)下記式7’:
被験材料のGA値(Q3’)=GA濃度[L](R’)/アルブミン濃度(O’)(式7’)
を用い、工程F1’)で用いた被験材料に設定したGA認証値1(W)にトレーサブルなGA値(Q3’)を決定する工程;
を含むものであることができる。
工程F1’)、F2’)、F5’)及びF6’)は、それぞれ工程F1)、F2)、F5)及びF6)を参照して実施することができる。
工程F6’)で得られたGA値(Q3’)が、工程F1’)で用いた被験材料に設定したGA認証値1(W)と一致することを確認することで、回帰式VIを用いてGA値のトレーサビリティ体系が確立したことを確認することができる。すなわち、GA認証値にトレーサブルなGA値を、回帰式VIと酵素法を用いて、簡便に測定可能であることが確認される。
被験材料のGA値の実測値をGA認証標準物質のGA認証値へ換算するための回帰式(回帰式III)、
被験材料のGA濃度[P]の実測値をGA認証標準物質のGA濃度[L]へ換算するための回帰式(回帰式IV)、
被験材料のGA値の実測値をGA認証標準物質のGA認証値から被験材料に設定したGA値へ換算するための回帰式(回帰式V)、又は
被験材料のGA濃度[P]の実測値をGA認証標準物質のGA濃度[L]から被験材料に設定したGA濃度[L]へ換算するための回帰式(回帰式VI)
を決定する工程;及び
工程F0:
GA認証標準物質のGA濃度[L]から換算したGA濃度[P] 及びGA認証標準物質のアルブミン濃度から換算したアルブミン濃度を設定した標準物質を用いて作成した検量線を用いて、被験材料のGA濃度[P]及びアルブミン濃度を測定し、工程A0)で決定した回帰式を用いてGA認証値にトレーサブルなGA値を決定する工程;
を含む、GA認証値にトレーサブルなGA値の測定方法にも関する。なお、「GA認証標準物質のGA濃度[L]から換算したGA濃度[P]」とは、「GA認証標準物質のGA濃度[L]に紐付いたGA濃度[P]」と同義である。
一方、GAの定義は、上述のとおり、「DOF−Lysを有するアルブミン」であり、1分子のアルブミンにつき59ヶ所あるリジン残基のどの部位が糖化されたものであってもよい。また、GAの標準測定操作法であるID−MS法は、59ヶ所あるリジン残基を全て断片化し測定を行う。一方、日常検査法であるGA酵素法ではプロテアーゼを用いるが、プロテアーゼ処理で全てのリジン残基を断片化することは困難である為、GAの場合、基準測定操作法と日常検査である酵素法との間で測定対象物は、1分子のアルブミンに対して1対1の関係にならず差異がある。この為、GAのトレーサビリティ体系の確立はHbA1cの場合と同様に実施することができなかった。
例えば、被験材料のGA濃度[P]と、アルブミン濃度を、それぞれ酵素法により測定し、これらからGA値を決定する。
上記GA値と回帰式III又は回帰式Vから、被験材料の、GA認証値にトレーサブルなGA値を、簡便に測定することができ(回帰式Vの場合、GA値をYに代入)、また
上記のGA濃度[P]と回帰式IV又は回帰式VIから、GA濃度[L]を求めることができ、さらにこの、GA濃度[L]をアルブミン濃度で割ることで、被験材料の、GA認証値にトレーサブルなGA値を、簡便に測定することができる。
回帰式III、回帰式IV、回帰式V及び回帰式VIからなる群から選択される回帰式;
GA測定用試薬;
アルブミン測定用試薬;及び
標準物質;
を含む、GA値測定用キットにも関する。この測定キットによれば、被験材料のGA濃度[P]と、アルブミン濃度を、それぞれ酵素法により測定し、被験材料の、GA認証値にトレーサブルなGA値を、簡便に測定することができる。上記キットに含まれる標準物質は、好ましくは、上記工程B)及び工程C)によって式II0、式II又は II1を用いてGA濃度[P] が設定された標準物質である。
b)以下の式1:
GA濃度[L](A)
=GA認証標準物質のGA認証値(B)×GA認証標準物質のアルブミン濃度(C) (式1)
を用いて、異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のGA濃度[L](A)を決定するステップ;
c)2種以上のGA認証標準物質におけるGA由来の吸光度(D)を入力するステップ;
を作成するステップ;
e0)切片をゼロとする以下の直線の式II0:
D=α0E (式II0)
を作成するステップ
(ここで、α0は、任意の正の値であり、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である);
f)式II0を用いて、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)を2種以上決定するステップ;
g)以下の式2:
GA値(F)=GA濃度[P](E)/アルブミン濃度(C) (式2)
を用いて、GA値(F)を2種以上決定するステップ;及び
h)2種以上のGA認証標準物質のGA認証値(B)と、対応する2種以上のGA値(F)とから回帰式III:
B=γF+δ (回帰式III)
を作成するステップ;
を実行する、プログラムであり得る。
また、一態様において、上記プログラムは、
ステップe0)が、下記に示すステップd)とステップe)であり、
ステップf)における式II0が式IIである、
プログラムでもあり得る。
d)2種以上のGA由来の吸光度(D)と、2種以上のGA濃度[L](A)とから、回帰式I:
D=αA+β (回帰式I)
を作成するステップ;
e)回帰式Iの切片をゼロとする式II:
D=αE (式II)
を作成するステップ。
また、一態様において、上記プログラムは、
ステップe0)が、下記に示すステップe1)であり、
ステップf)における式II0が式II1である、
プログラムでもあり得る。
e1)切片をゼロとする以下の式II1:
D=α1E (式II1)
を作成するステップ
(ここで、α1=[ステップc)において測定したGA認証標準物質のうちの1種のGA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)]/[ステップb)において決定した対応するGA認証標準物質のGA濃度[L](A)]である)。
本実施形態のプログラムは、同様に、上記の本実施形態の他の方法における各工程を実行するプログラムであり得る。
b)以下の式1:
GA濃度[L](A)
=GA認証標準物質のGA認証値(B)×GA認証標準物質のアルブミン濃度(C) (式1)
を用いて、異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のGA濃度[L](A)を決定するための手段;
c)2種以上のGA認証標準物質におけるGA由来の吸光度(D)を測定するための手段;
e0)切片をゼロとする以下の直線の式II0:
D=α0E (式II0)
を作成するための手段
(ここで、α0は、任意の正の値であり、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である);
f)式II0を用いて、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)を2種以上決定するための手段;
g)以下の式2:
GA値(F)=GA濃度[P](E)/アルブミン濃度(C) (式2)
を用いて、GA値(F)を2種以上決定するための手段;及び
h)2種以上のGA認証標準物質のGA認証値(B)と、対応する2種以上のGA値(F)とから回帰式III:
B=γF+δ (回帰式III)
を作成するための手段;
を備える装置であり得る。
手段e0)が、下記に示す手段d)と手段e)であり、
手段f)における、式II0が式IIである、
装置でもあり得る。
d)2種以上のGA由来の吸光度(D)と、2種以上のGA濃度[L](A)とから、回帰式I:
D=αA+β (回帰式I)
を作成する手段;
e)回帰式Iの切片をゼロとする式II:
D=αE (式II)
を作成する手段。
また、一態様において、上記装置は、
手段e0)が、下記に示す手段e1)であり、
手段f)における、式II0が式II1である、
装置でもあり得る。
e1)切片をゼロとする以下の式II1:
D=α1E (式II1)
を作成する手段
(ここで、α1=[手段c)において測定したGA認証標準物質のうちの1種のGA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)]/[手段b)において決定した対応するGA認証標準物質のGA濃度[L](A)]である)。
本実施形態の装置は、同様に、上記の本実施形態の他の方法における各工程を実施するための手段を備える装置であり得る。
式III、式IV、式V及び式VIからなる群から選択される式が設定された演算部;
式II0、式II又は式II1によってGA濃度[P]が設定された標準物質を用いて検量線を作成する検量線作成部、若しくは式II0、式II又は式II1が演算に組み込まれている検量線作成部;及び
GA値を測定する測定部;
を含む、糖化アルブミン(GA)認証値にトレーサブルなGA値の測定装置にも関する。
ここで、各式は、上記の任意の方法を用いて決定することができる。
1)上記工程e0)で作成された式II0、工程e)で作成された式II又は工程e1)で作成された式II1によってGA濃度[P]が設定された標準物質;及び
2)式III、式IV、式V及び式VIからなる群から選択される式が組み込まれた演算プログラム。
ここで、2)における各式は、上記の任意の方法を用いて決定することができる。
1)糖化アルブミン認証標準物質
一般社団法人 検査医学標準物質機構が製造・販売しているグリコアルブミン測定用常用参照標準物質(JCCRM 611−1)を用いた。認証値(糖化アルブミン値)が低い方から順に、M、H及びHHである。
2)アルブミン認証標準物質
一般社団法人 検査医学標準物質機構が販売している、IFCC血漿タンパク 国際標準物質(ERM−DA 470k/IFCC)を用いた。
3)測定試薬
アルブミン(ALB)(改良BCP法)及び糖化アルブミンの吸光度を測定する試薬は、ルシカGA―L(旭化成ファーマ(株))を用いた。
ルシカGA−Lの糖化アルブミン試薬は、第一試薬(前処理液)と第二試薬(酵素液)で構成され、ALB試薬は、第一試薬(前処理液)と第二試薬(発色液)で構成されている。
4)標準物質
標準物質は、GA−Lキャリブレーター(旭化成ファーマ(株))を高値標準物質として用いた。
5)測定装置
吸光度測定、及び吸光度から濃度への換算を行う装置として、7180形日立自動分析装置(日立ハイテクフィールディング(株))を使用した。
6)糖化アルブミン測定方法
上記5の測定装置を用い、サンプル4.5μL、第一試薬180μL、第二試薬45μLの10分モードで測定を行った。測光0ポイントでサンプルと第一試薬のサンプリング及び撹拌を行い、測定を開始し、第一反応を行った。その後、16ポイントで第二試薬のサンプリング及び撹拌後、第二反応を行った。トータルで34ポイントまで測定した。
その他の操作は、各々の添付文書や取扱説明書に従い行った。
7)糖化アルブミン吸光度の計算方法
糖化アルブミン吸光度(測定サンプルの測定吸光度変化)は、33及び34ポイントの平均吸光度と第二試薬添加前の15及び16ポイントの平均吸光度を用いて、下記計算式により求めた。
ΔmAbs=(Ab1−(Ab2×0.8))/10
ΔmAbs:糖化アルブミン吸光度変化量
Ab1:33及び34ポイントの平均吸光度
Ab2:15及び16ポイントの平均吸光度
式中「0.8」は、次の計算式により算出した値である。
第一試薬量(180μL)/(第一試薬量(180μL)+第二試薬量(45μL))=0.8
8)アルブミン測定方法
上記5)の測定装置を用い、サンプル3.0μL、第一試薬220μL、第二試薬110μLの10分モードで測定を行った。0ポイントでサンプルと第一試薬のサンプリング及び撹拌を行い、測定を開始し、第一反応を行った。その後、16ポイントで第二試薬のサンプリング及び撹拌後、第二反応を行った。トータルで34ポイントまで測定した。
その他の操作は、各々の添付文書や取扱説明書に従い行った。
9)アルブミン(ALB)吸光度の計算方法
ALB吸光度(測定サンプルの測定吸光度変化)は、33及び34ポイントの平均吸光度と第二試薬添加前の13及び14ポイントの平均吸光度を用いて、下記計算式により求めた。
ΔmAbs=(Ab1−(Ab2×0.67))/10
ΔmAbs:ALB吸光度変化量
Ab1:33及び34ポイントの平均吸光度
Ab2:13及び14ポイントの平均吸光度
式中「0.67」は次の計算式により算出した値である。
第一試薬量(220μL)/(第一試薬量(220μL)+第二試薬量(110μL))=0.67
<糖化アルブミン認証標準物質のアルブミン濃度の決定>
1)ルシカGA−Lを用い、アルブミン認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(M)及び糖化アルブミン認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(K)を測定した。
2)アルブミン認証標準物質のアルブミン認証値(3.72g/dL)をモルへ換算した。換算に使用した分子量は66438を用いた(Geisow MJ et. Al. In: Villafranca JJ, ed. Techniques in proteinchemistry. San Diego, CA: Academic Press, 1991: 576−572)結果、アルブミンモル認証値(L)は559.9μmol/Lであった。
3)前記単位換算後のアルブミンモル認証値(L)を横軸、アルブミン由来の吸光度(M)を縦軸にプロットすることにより、回帰直線式(式5)y=0.3351xを作成した(図2)。
4)前記回帰直線式(式5)に糖化アルブミン認証標準物質のアルブミン吸光度(K)を代入することで、糖化アルブミン認証標準物質のアルブミン濃度(C)を決定した。
1)糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン認証値(B)は、低い方から順にM:230、H;365、HH:564mmol/molであった。各々の糖化アルブミン認証値に前記で決定した、アルブミン濃度(C)をかけることにより、糖化アルブミン濃度[L](A)を決定した。
1)ルシカGA−Lを用い、糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン由来の吸光度(D)を測定した。
測定値と認証値を一致させる為に、2段階の回帰直線式の設定を検討した。
1)前記回帰直線式(I)を切片が0となるように平行移動し、直線式(II)y=0.2344xを設定した(図4)。
1)前記で算出した、直線式(II)に、前記糖化アルブミン由来の吸光度(D)を代入し、糖化アルブミン濃度[P](E)を算出した。
2)前記糖化アルブミン濃度[P](E)を、前記アルブミン濃度(C)で割り、1000をかけることにより、糖化アルブミン値(F)を算出した。
<直線式(II)を用いた、標準物質への値の設定>
1)標準物質の糖化アルブミン由来の吸光度(G)を測定し、前記直線式(II)に代入し、標準物質の糖化アルブミン濃度[P](H)を算出した。
2)前記糖化アルブミン認証標準物質のアルブミン濃度(C)を横軸、前記糖化アルブミン認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(K)を縦軸にプロットし、回帰直線式(式3)y=0.3351xを設定した(図6)。
3)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定し、前記回帰直線式(式3)に代入し、標準物質のアルブミン濃度(J)を算出した。
<直線式(II)を用いて糖化アルブミン濃度及びアルブミン濃度を決定した標準物質を用いて算出した測定値について、さらに回帰直線式(III)を用いて、糖化アルブミン認証標準物質の認証値にトレーサブルな値を得る工程>
1)実施例3において値を設定した標準物質を用い検量線を作成し、糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン濃度[P](N)を測定した。
2)実施例3において値を設定した標準物質を用い検量線を作成し、糖化アルブミン認証標準物質のアルブミン濃度(O)を測定した。
3)前記糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン濃度[P](N)をアルブミン濃度(O)で割り、1000をかけることにより、糖化アルブミン値(P)を算出した。
4)糖化アルブミン値(P)を、回帰直線式(III)に代入することにより、糖化アルブミン値(Q)を得た。
<アルブミン認証標準物質の検量線を用いた、標準物質へのアルブミン濃度の設定>
1)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定し、前記回帰直線式(式5)に代入し、標準物質のアルブミン濃度(J’)を算出した。
前記アルブミン濃度(J)の代わりにアルブミン濃度(J’)を標準物質に設定し、実施例4と同様にして、トレーサビリティ体系を確立できることを確認した。
<回帰直線式(I)の切片を0とする直線式(II(d))の設定>
1)前記回帰直線式(I)の傾きを、実施例1で得られた糖化アルブミン認証標準物質HHの糖化アルブミン濃度[L](A)330.0μmol/Lを基準に、切片が0となるように変更し、直線式(II(d))y=0.2103xを設定した(図7)。
1)直線式(II(d))に、前記糖化アルブミン由来の吸光度(D)を代入し、糖化アルブミン濃度[P](E(d))を算出した。
2)前記糖化アルブミン濃度[P](E(d))を、前記アルブミン濃度(C)で割り、1000をかけることにより、糖化アルブミン値(F(d))を算出した。
<直線式(II(d))を用いた、標準物質への値の設定>
1)標準物質の糖化アルブミン由来の吸光度(G)を測定し、直線式(II(d))に代入し、標準物質の糖化アルブミン濃度[P](H(d))を算出した。
2)実施例3に記載の方法を用い、標準物質のアルブミン濃度(J)を算出した。
<直線式(II(d))を用いて糖化アルブミン濃度及びアルブミン濃度を決定した標準物質を用いて算出した測定値について、さらに回帰直線式(III(d))を用いて、糖化アルブミン認証標準物質の認証値にトレーサブルな値を得る工程>
1)実施例7において値を設定した標準物質を用い検量線を作成し、糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン濃度[P](N(d))を測定した。
2)前記糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン濃度[P](N(d))を実施例4で得たアルブミン濃度(O)で割り、1000をかけることにより、糖化アルブミン値(P(d))を算出した。
4)糖化アルブミン値(P(d))を、回帰直線式(III(d))に代入することにより、糖化アルブミン値(Q(d))を得た。
糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン濃度を用いた、回帰式の設定によるトレーサビリティ体系の確立について検討した。
<回帰直線式(IV)の設定>
1)前記糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン濃度[L](A)を縦軸、前記糖化アルブミン濃度[P](E)を横軸にプロットし、回帰直線式(IV)y=0.9998x+33.783を設定した(図9)。
1)実施例3で直線式(II)により値を設定した標準物質を用いて検量線を作成し、前記糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン由来の吸光度(D)を用い、糖化アルブミン濃度[P](N)を測定した。
2)糖化アルブミン濃度[P](N)を回帰直線式(IV)に代入することにより、糖化アルブミン濃度[L](R)を得た。
3)前記糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン濃度[L](R)を前記アルブミン濃度(O)で割り、1000をかけることにより、糖化アルブミン値(Q1’)を算出した。
1)被験材料
GA−L 管理血清L、H(旭化成ファーマ(株))を用いた。
濃度の低い順にL、Hで構成されている。
被験材料を用いた、回帰式の設定によるトレーサビリティ体系の確立について検討した。
<被験材料への各種値の設定>
1)被験材料の糖化アルブミン由来の吸光度(S)を測定し、前記回帰直線式(I)に代入し、被験材料の糖化アルブミン濃度[L](T)を決定した。
2)被験材料のアルブミン由来の吸光度(U)を測定し、前記回帰直線式(式5)に代入し、被験材料のアルブミン濃度(V)を決定した。
1)前記被験材料の糖化アルブミン由来の吸光度(S)を、前記直線式(II)に代入し、被験材料の糖化アルブミン濃度[P](X)を算出した。
2)前記糖化アルブミン濃度[P](X)を、前記アルブミン濃度(V)で割り、1000をかけることにより、糖化アルブミン値(Y)を算出した。
1)実施例3で直線式(II)を用いて値を設定した標準物質を用い検量線を作成し、被験材料の糖化アルブミン濃度[P](N’)を測定した。
2)実施例5で回帰直線式(式5)を用いて値を設定した標準物質を用い検量線を作成し、被験材料のアルブミン濃度(O’)を測定した。
3)前記被験材料の糖化アルブミン濃度[P](N’)をアルブミン濃度(O’)で割り、1000をかけることにより、糖化アルブミン値(P’)を算出した。
4)糖化アルブミン値(P’)を、回帰直線式(V)に代入することにより、糖化アルブミン値(Q2’)を得た。
被験材料の糖化アルブミン濃度を用いた、回帰式の設定によるトレーサビリティ体系の確立について検討した。
1)前記被験材料の糖化アルブミン濃度[L](T)を縦軸、糖化アルブミン濃度[P](X)を横軸にプロットし、回帰直線式(VI)y=x+33.786を設定した(図11)。
1)実施例10において値を測定した被験材料の糖化アルブミン濃度[P](N’)を回帰直線式(VI)に代入することにより、糖化アルブミン濃度[L](R’)を得た。
2)前記被験材料の糖化アルブミン濃度[L](R’)を、実施例10で得たアルブミン濃度(O’)で割り、1000をかけることにより、糖化アルブミン値(Q3’)を算出した。
本実施例12では、高値標準物質(H)に加えてさらに、低値標準物質(L)として、Off the Clot Human Serum(Golden west Biologicals,Inc.)を用いた。
1)標準物質のアルブミン由来の吸光度(U−2)を測定し、前記回帰直線式(式3)に代入し、標準物質のアルブミン濃度(V−2)を算出した。
1)前記標準物質の糖化アルブミン由来の吸光度(S−2)を測定し、前記回帰直線式(I)に代入し、標準物質の糖化アルブミン濃度[L](T−2)を算出した。
2)前記標準物質の糖化アルブミン濃度[L](T−2)を横軸、糖化アルブミン由来の吸光度(S−2)を縦軸にプロットし、回帰直線式(I−2)y=0.2344x−7.9194を設定した(図12)。
1)前記で算出した、直線式(II−2)に、前記糖化アルブミン由来の吸光度(S−2)を代入し、糖化アルブミン濃度[P](X−2)を算出した。
2)前記糖化アルブミン濃度[L](T−2)を、前記アルブミン濃度(V−2)で割り、1000をかけることにより、糖化アルブミン値(W−2)(設定値)を算出した。
3)前記糖化アルブミン濃度[P](X−2)を、前記アルブミン濃度(V−2)で割り、1000をかけることにより、糖化アルブミン値(Y−2)(測定値)を算出した。
1)直線式(II−2)を用いて値を設定した標準物質を用い検量線を作成し、糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン濃度[P](N−2)を測定した。
2)回帰直線式(式3)を用いて値を設定した標準物質を用い検量線を作成し、糖化アルブミン認証標準物質のアルブミン濃度(O−2)を測定した。
3)糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン濃度[P](N−2)をアルブミン濃度(O−2)で割り、1000をかけることにより、糖化アルブミン値(P―2)(測定値)を算出した。
4)糖化アルブミン値(P−2)(測定値)を、回帰直線式(III−2)に代入することにより、糖化アルブミン値(Q−2)(換算値)を得た。
実施例1で用いた糖化アルブミン認証標準物質及びアルブミン認証標準物質と、以下を用いて試験を実施した。
1)測定試薬
アルブミン(ALB)及び糖化アルブミンの吸光度を測定する試薬は、糖化白蛋白測定試剤盒
を用いた。糖化白蛋白測定試剤盒の糖化アルブミン試薬は、第一試薬と第二試薬で構成され、ALB試薬(BCG法)は、第一試薬で構成されている。
2)標準物質
標準物質は、校准品
を用いた。
3)測定装置
吸光度測定、及び吸光度から濃度への換算を行う装置として、7180形日立自動分析装置(日立ハイテクフィールディング(株))を使用した。
4)糖化アルブミン測定方法
上記3の測定装置を用い、サンプル3.0μL、第一試薬160μL及び第二試薬40μLの10分モードで測定を行った。測光0ポイントでサンプルと第一試薬のサンプリング及び撹拌を行い、測定を開始し、第一反応を行った。その後、16ポイントで第二試薬をサンプリング及び撹拌後、第二反応を行った。トータルで34ポイントまで測定した。
その他の操作は、各々の添付文書や取扱説明書に従い行った。
5)糖化アルブミン吸光度の計算方法
糖化アルブミン吸光度(測定サンプルの測定吸光度変化)は、33及び34ポイントの平均吸光度と第二試薬添加前の15及び16ポイントの平均吸光度を用いて、下記計算式により求めた。
ΔmAbs=(Ab1−(Ab2×0.8)/10
ΔmAbs:糖化アルブミン吸光度変化量
Ab1:33及び34ポイントの平均吸光度
Ab2:15及び16ポイントの平均吸光度
式中「0.8」は、次の計算式により算出した値である:第一試薬量(160μL)/(第一試薬量(160μL)+第二試薬量(40μL))=0.8
6)アルブミン測定方法
上記3の測定装置を用い、サンプル2.0μL及び第一試薬200μLの5分モードで測定を行った。0ポイントでサンプルと第一試薬のサンプリング及び撹拌を行い、測定を開始し、反応を行った。トータルで17ポイントまで測定した。
その他の操作は、各々の添付文書や取扱説明書に従い行った。
7)アルブミン(ALB)吸光度の計算方法
ALB吸光度(測定サンプルの測定吸光度変化)は、8及び9ポイントの平均吸光度を用いて下記計算式により求めた。
ΔmAbs=(Ab1)/10
ΔmAbs:ALB吸光度変化量
Ab1:8及び9ポイントの平均吸光度
1)実施例1と同様に検討した結果の各値を表15に記載した。
1)前記回帰直線式(I(a))を切片が0となるように平行移動し、直線式(II(a))y=0.1372x(II(a))を設定した(図16)
1)実施例2と同様に検討した結果の各値を表16に記載した。
2)糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン認証値(B)を縦軸、前記糖化アルブミン値(F(a))を横軸にプロットし、回帰直線式(III(a))y=1.0065x+22.763を設定した。(図17)
実施例3と同様に検討した結果の各値を表17に記載した。
実施例4と同様に検討した結果の各値を表18に記載した。
実施例1で用いた糖化アルブミン認証標準物質及びアルブミン認証標準物質と、以下を用いて試験を実施した。
1)測定試薬
アルブミン(ALB)、糖化アルブミンの吸光度を測定する試薬は、Glycated serum albumin(IVDLab CO.,LTD)を用いた。
Glycated serum albuminの糖化アルブミン試薬は、第一試薬と、第二試薬で構成され、ALB試薬(BCG法)は、第一試薬で構成されている。
2)標準物質
標準物質は、Glycated albumin Calibrator(IVDLab CO.,LTD)を用いた。
3)測定装置
吸光度測定及び吸光度から濃度への換算を行う装置として、7180形日立自動分析装置(日立ハイテクフィールディング(株))を使用した。
4)糖化アルブミン測定方法
上記3の測定装置を用い、サンプル10.0μL、第一試薬200μL及び第二試薬50μLの10分モードで測定を行った。測光0ポイントでサンプルと第一試薬の、サンプリング及び撹拌を行い、測定を開始し、第一反応をった。その後、16ポイントで第二試薬をサンプリング及び撹拌後、第二反応を行った。トータルで34ポイントまで測定した。
その他の操作は、各々の添付文書や取扱説明書に従い行った。
5)糖化アルブミン吸光度の計算方法
糖化アルブミン吸光度(測定サンプル測定吸光度変化)は、33及び34ポイントの平均吸光度と第二試薬添加前の15及び16ポイントの平均吸光度を用いて下記計算式により求めた。
ΔmAbs=(Ab1−(Ab2×0.8))/10
ΔmAbs:糖化アルブミン吸光度変化量
Ab1:33及び34ポイントの平均吸光度
Ab2:15及び16ポイントの平均吸光度
式中「0.8」は、次の計算式により算出した値である。
第一試薬量(200μL)/(第一試薬量(200μL)+第二試薬量(50μL))=0.8
6)アルブミン測定方法
上記3の測定装置を用い、サンプル2.0μL及び第一試薬200μLの1分モードで測定を行った。0ポイントでサンプルと第一試薬のサンプリング及び撹拌を行い、測定を開始し、反応を行った。トータルで4ポイントまで測定した。
その他の操作は、各々の添付文書や取扱説明書に従い行った。
7)アルブミン(ALB)吸光度の計算方法
ALB吸光度(測定サンプル測定吸光度変化)は、3及び4ポイントの平均吸光度を用いて下記計算式により求めた。
ΔmAbs=(Ab1)/10
ΔmAbs:ALB吸光度変化量
Ab1:3及び4ポイントの平均吸光度
1)実施例1と同様に検討した結果の各値を表19に記載した。
1)前記回帰直線式(I(b))を切片が0となるように平行移動し、直線式(II(b))
y=0.2888x(II(b))を設定した(図19)。
1)実施例2と同様に検討した結果の各値を表20に記載した。
実施例3と同様に検討した結果の各値を表21に記載した。
実施例4と同様に検討した結果の各値を表22に記載した。
<回帰直線式(I)を用いた、標準物質への値の設定>
1)標準物質の糖化アルブミン由来の吸光度(G)を測定した。
2)前記回帰直線式(I)に前記糖化アルブミン吸光度(G)を代入し、標準物質の糖化アルブミン濃度[L](T(c))を算出した。
3)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定した。
4)実施例3の回帰直線式(式3)に前記アルブミン吸光度(I)を代入し、標準物質のアルブミン濃度(J)を算出した。
1)回帰直線式(I)を用い、値を設定した標準物質を用い、糖化アルブミン吸光度から糖化アルブミン濃度へ変換する検量線を作成し、糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン濃度[L](N(c))を測定した。
2)回帰直線式(I)を用い、値を設定した標準物質を用い、アルブミン吸光度からアルブミン濃度へ変換する検量線を作成し、糖化アルブミン認証標準物質のアルブミン濃度(O)を測定した。
3)上記、糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン濃度[L](N(c))をアルブミン濃度(O)で割り、1000をかけることにより、糖化アルブミン値(P(c))を算出した。
4)表24から分かるように、回帰直線式(I)から値を設定した標準物質を用いても、糖化アルブミン認証標準物質の糖化アルブミン値の測定値(P(c))は、糖化アルブミン認証標準物質に規定されている認証値(B)と一致しなかった。即ち、糖化アルブミン認証標準物質を上位基準とし、上記実施例の方法で値の設定を行った標準物質を用い、糖化アルブミン認証標準物質の認証値が算出されなかったことから、この方法では一連の連鎖的なトレーサビリティ体系を確立できなかった。
Claims (19)
- 以下の工程を含む、糖化アルブミン(GA)認証値にトレーサブルなGA値の測定方法:
A0)
被験材料のGA値の実測値をGA認証標準物質のGA認証値へ、
被験材料のGA濃度[P]の実測値をGA認証標準物質のGA濃度[L]へ、
被験材料のGA値の実測値をGA認証標準物質のGA認証値から被験材料に設定したGA値へ、又は
被験材料のGA濃度[P]の実測値をGA認証標準物質のGA濃度[L]から被験材料に設定したGA濃度[L]へ、
換算するための式を決定する工程であって、
前記被験材料のGA値の実測値が、GA濃度 [P] /アルブミン濃度で計算され、
前記GA認証標準物質のGA認証値から被験材料に設定したGA値が、GA濃度 [L] /アルブミン濃度で計算される、工程;及び
F0)
GA認証標準物質のGA濃度[L]から換算したGA濃度[P]及びGA認証標準物質のアルブミン濃度から換算したアルブミン濃度を設定した標準物質を用いて作成した検量線を用いて、被験材料のGA濃度[P]及びアルブミン濃度を測定し、工程A0)で決定した回帰式を用いてGA認証値にトレーサブルなGA値を決定する工程
(上記各工程において、GA濃度[L]は、グルコースが結合したリジン残基(DOF−Lys)の濃度であり、GA濃度[P]は、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度である)。 - 以下の工程を含む、糖化アルブミン(GA)認証値にトレーサブルなGA値の測定方法:
A1)以下のb)、c)及びe0)〜h)を含む工程により、回帰式IIIを決定する工程;
b)以下の式1:
GA濃度[L](A)
=GA認証標準物質のGA認証値(B)×GA認証標準物質のアルブミン濃度(C) (式1)
を用いて、異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のGA濃度[L](A)を決定する工程;
c)2種以上のGA認証標準物質におけるGA由来の吸光度(D)を測定する工程;
e0)切片をゼロとする以下の直線の式II0:
D=α0E (式II0)
を作成する工程
(ここで、α0は、任意の正の値であり、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である);
f)式II0を用いて、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)を2種以上決定する工程;
g)以下の式2:
GA値(F)=GA濃度[P](E)/アルブミン濃度(C) (式2)
を用いて、GA値(F)を2種以上決定する工程;及び
h)2種以上のGA認証標準物質のGA認証値(B)と、対応する2種以上のGA値(F)とから回帰式III:
B=γF+δ (回帰式III)
を作成する工程
(上記各工程において、GA濃度[L]は、グルコースが結合したリジン残基(DOF−Lys)の濃度であり、GA濃度[P]は、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度である)。 - さらに以下の工程を含む、請求項2に記載の方法:
B)標準物質におけるGA由来の吸光度(G)を測定し、式II0を用いて対応するGA濃度[P](H)を決定する工程;及び
C)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定することにより、標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程。 - 工程C)が以下の工程C1)〜C3)を含む、請求項3に記載の方法:
C1)GA認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(K)と、GA認証標準物質のアルブミン濃度(C)から、下記式3:
K=εC (式3)
を満たすεを決定する工程;
C2)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定する工程;及び
C3)吸光度(I)から、式3’:
I=εJ (式3’)
を用いて標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程。 - 工程b)に先立って、以下の工程a1)〜a3):
a1)以下の式4:
アルブミンモル認証値(L)
=アルブミン認証標準物質のアルブミン認証値/アルブミンの分子量 (式4)
を用いてアルブミンモル認証値(L)を決定する工程;
a2)アルブミン認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(M)を測定する工程;及び
a3)アルブミンモル認証値(L)と、吸光度(M)から、下記式5:
M=θL (式5)
を満たすθを決定する工程;
を含み、
工程C)が以下の工程C2)及びC4):
C2)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定する工程;及び
C4)吸光度(I)から、式5’:
I=θJ (式5’)
を用いて標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程;
を含む、請求項3に記載の方法。 - さらに以下の工程F1)〜F4)を含む、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法:
F1)GA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するGA濃度[P](N)を決定する工程;
F2)工程F1)で用いたGA認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(K)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するアルブミン濃度(O)を決定する工程;
F3)下記式6:
GA認証標準物質のGA値(P)=GA濃度[P](N)/アルブミン濃度(O) (式6)
を用いてGA値(P)を決定する工程;及び
F4)GA値(P)と前記回帰式IIIを用いて、工程F1)で用いたGA認証標準物質の認証値にトレーサブルなGA値(Q)を決定する工程。 - 以下の工程を含む、糖化アルブミン(GA)認証値にトレーサブルなGA値の測定方法:
A2)以下のb)、c)、e0)、f)及びi)を含む工程により、回帰式IVを決定する工程;
b)以下の式1:
GA濃度[L](A)
=GA認証標準物質のGA認証値(B)×GA認証標準物質のアルブミン濃度(C) (式1)
を用いて、異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のGA濃度[L](A)を決定する工程;
c)2種以上のGA認証標準物質におけるGA由来の吸光度(D)を測定する工程;
e0)切片をゼロとする以下の直線の式II0:
D=α0E (式II0)
を作成する工程
(ここで、α0は、任意の正の値であり、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例する比例するGA濃度[P](E)である);
f)式II0を用いて、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)を2種以上決定する工程;
i)2種以上のGA濃度[L](A)とGA濃度[P](E)とから、回帰式IV:
A=κE+λ (回帰式IV)
を作成する工程
(上記各工程中、GA濃度[L]は、グルコースが結合したリジン残基(DOF−Lys)の濃度であり、GA濃度[P]は、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度である)。 - さらに以下の工程を含む、請求項7に記載の方法:
B)標準物質におけるGA由来の吸光度(G)を測定し、式II0を用いて対応するGA濃度[P](H)を決定する工程;
C)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定することにより、標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程。 - さらに以下の工程を含む、請求項7又は8に記載の方法:
F1)GA認証標準物質のGA由来の吸光度(D)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応する酵素法によるGA濃度[P](N)を決定する工程;
F2)工程F1)で用いたGA認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(K)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するアルブミン濃度(O)を決定する工程;
F5)GA濃度[P](N)から回帰式IVを用いて、GA認証標準物質のGA濃度[L](R)を決定する工程;及び
F6)下記式7:
GA認証標準物質のGA値(Q1’)=GA濃度[L](R)/アルブミン濃度(O) (式7)
を用いて、工程F1)で用いたGA認証標準物質の認証値にトレーサブルなGA値(Q1’)を決定する工程。 - 以下の工程を含む、糖化アルブミン(GA)認証値にトレーサブルなGA値の測定方法:
A3)以下のb)〜e0)及びj)〜o)を含む工程により、回帰式Vを決定する工程;
b)以下の式1:
GA濃度[L](A)
=GA認証標準物質のGA認証値(B)×GA認証標準物質のアルブミン濃度(C) (式1)
を用いて、異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のGA濃度[L](A)を決定する工程;
c)2種以上のGA認証標準物質におけるGA由来の吸光度(D)を測定する工程;
d)2種以上のGA由来の吸光度(D)と、2種以上のGA濃度[L](A)とから、回帰式I:
D=αA+β (回帰式I)
を作成する工程;
e0)切片をゼロとする以下の直線の式II0:
D=α0E (式II0)
を作成する工程
(ここで、α0は、任意の正の値であり、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である);
j)2種以上の被験材料におけるGA由来の吸光度(S)を測定し、回帰式Iを用いて対応するGA濃度[L](T)を決定する工程;
k)2種以上の被験材料におけるアルブミン由来の吸光度(U)を測定し、アルブミン濃度(V)を決定する工程;
l)以下の式8:
GA値1(W)=GA濃度[L](T)/アルブミン濃度(V) (式8)
を用いて、2種以上の被験材料のGA値1(W)をGA濃度[L](T)から決定する工程;
m)2種以上の被験材料におけるGA由来の吸光度(S)から、式II0を用いて対応するGA濃度[P](X)を決定する工程;
n)以下の式9:
GA値2(Y)=GA濃度[P](X)/アルブミン濃度(V) (式9)
を用いて、2種以上の被験材料のGA値2(Y)をGA濃度[P](X)から決定する工程;
o)2種以上の被験材料のGA値1(W)と、対応する2種以上のGA値2(Y)とから回帰式V:
W=πY+φ (回帰式V)
を作成する工程
(上記各工程中、GA濃度[L]は、グルコースが結合したリジン残基(DOF−Lys)の濃度であり、GA濃度[P]は、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度である)。 - さらに以下の工程を含む、請求項10に記載の方法:
B)標準物質におけるGA由来の吸光度(G)を測定し、式II0を用いて対応するGA濃度[P](H)を決定する工程;
C)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定することにより、標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程。 - さらに以下の工程を含む、請求項10又は11に記載の方法:
F1’)被験材料のGA由来の吸光度(S)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するGA濃度[P](N’)を決定する工程;
F2’)工程F1’)で用いた被験材料のアルブミン由来の吸光度(U)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するアルブミン濃度(O’)を決定する工程;及び
F3’)下記式6’:
被験材料のGA値(P’)=GA濃度[P](N’)/アルブミン濃度(O’)(式6’)
を用いてGA値(P’)を決定する工程。
F4’)GA値(P’)と前記回帰式Vを用いて、工程F1’)で用いた被験材料に値付けた認証GA値1(W)にトレーサブルなGA値(Q2’)を決定する工程。 - 以下の工程を含む、糖化アルブミン(GA)認証値にトレーサブルなGA値の測定方法
A4)以下のb)〜e0)、j)、m)、及びp)を含む工程により、回帰式VIを決定する工程;
b)以下の式1:
GA濃度[L](A)
=GA認証標準物質のGA認証値(B)×GA認証標準物質のアルブミン濃度(C) (式1)
を用いて、異なるGA認証値を有する2種以上のGA認証標準物質のGA濃度[L](A)を決定する工程;
c)2種以上のGA認証標準物質におけるGA由来の吸光度(D)を測定する工程;
d)2種以上のGA由来の吸光度(D)と、2種以上のGA濃度[L](A)とから、回帰式I:
D=αA+β (回帰式I)
を作成する工程;
e0)切片をゼロとする以下の直線の式II0:
D=α0E (式II0)
を作成する工程
(ここで、α0は、任意の正の値であり、Eは、GA由来の吸光度(D)と比例するGA濃度[P](E)である);
j)2種以上の被験材料におけるGA由来の吸光度(S)を測定し、回帰式Iを用いて対応するGA濃度[L](T)を決定する工程;
m)2種以上の被験材料におけるGA由来の吸光度(S)から、式II0を用いて対応するGA濃度[P](X)を決定する工程;及び
p)2種以上の被験材料のGA濃度[L](T)とGA濃度[P](X)とから、回帰式VI:
T=ψX+ω (回帰式VI)
を作成する工程
(上記各工程中、GA濃度[L]は、グルコースが結合したリジン残基(DOF−Lys)の濃度であり、GA濃度[P]は、糖化アミノ酸又は糖化ペプチドの濃度である)。 - さらに以下の工程を含む、請求項13に記載の方法。
B)標準物質におけるGA由来の吸光度(G)を測定し、式II0を用いて対応するGA濃度[P](H)を決定する工程;及び
C)標準物質のアルブミン由来の吸光度(I)を測定することにより、標準物質のアルブミン濃度(J)を決定する工程。 - 工程b)に先立って、さらに以下の工程a1)〜a3):
a1)下記式4:
アルブミンモル認証値(L)
=アルブミン認証標準物質のアルブミン認証値/アルブミンの分子量 (式4)
を用いてアルブミンモル認証値(L)を決定する工程;
a2)アルブミン認証標準物質のアルブミン由来の吸光度(M)を測定する工程;
a3)アルブミンモル認証値(L)と、吸光度(M)から、下記式5:
M=θL (式5)
を満たすθを決定する工程;
を含み、工程A4)がさらに以下の工程k):
k)2種以上の被験材料におけるアルブミン由来の吸光度(U)を測定し、アルブミン濃度(V)を決定する工程;
を含み、工程A4)が、工程j)及びk)より後に、さらに以下の工程l):
l)以下の式8:
GA値1(W)=GA濃度[L](T)/アルブミン濃度(V) (式8)
を用いて、2種以上の被験材料におけるGA値1(W)をGA濃度[L](T)から決定する工程;
を含み、方法がさらに以下の工程:
F1’)被験材料のGA由来の吸光度(S)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応する酵素法によるGA濃度[P](N’)を決定する工程;
F2’)工程F1’)で用いた被験材料のアルブミン由来の吸光度(U)から、標準物質を用いて作成した検量線を用いて、対応するアルブミン濃度(O’)を決定する工程;
F5’)GA濃度[P](N’)から回帰式VIを用いて、被験材料のGA濃度[L](R’)を決定する工程;及び
F6’)下記式7’:
被験材料のGA値(Q3’)=GA濃度[L](R’)/アルブミン濃度(O’)(式7’)
を用い、工程F1’)で用いた被験材料に設定したGA認証値1(W)にトレーサブルなGA値(Q3’)を決定する工程;
を含む、請求項13又は14に記載の方法。 - 3種以上のGA認証標準物質を用いる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GA認証値が、同位体希釈質量分析(ID−MS)法によるGA認証値である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GA認証値が、同位体希釈質量分析(ID−MS)法によるGA認証値であり、前記GA認証標準物質がJCCRM 611である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項2の方法で決定された回帰式III、請求項7の方法で決定された回帰式IV、請求項10の方法で決定された回帰式V及び請求項13の方法で決定された回帰式VIからなる群から選択される回帰式;
GA測定用試薬;
アルブミン測定用試薬;及び
標準物質;
を含む、GA値測定用キット。
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