JP2006149230A - 糖化タンパク質割合の測定方法 - Google Patents
糖化タンパク質割合の測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006149230A JP2006149230A JP2004340877A JP2004340877A JP2006149230A JP 2006149230 A JP2006149230 A JP 2006149230A JP 2004340877 A JP2004340877 A JP 2004340877A JP 2004340877 A JP2004340877 A JP 2004340877A JP 2006149230 A JP2006149230 A JP 2006149230A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- specific
- glycated
- amino acid
- protein
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】特定タンパク質の糖化割合、中でもグリコアルブミン割合、グリコヘモグロビン割合、とりわけグリコヘモグロビン割合の中ではヘモグロビンA1cを測定するにあたって、簡便かつ精度良く測定できる測定方法、および糖化タンパク質割合測定用キットの提供を課題とする。
【解決手段】特定タンパク質量及び糖化された特定タンパク質量につき、これらの分解反応で生じる同一の特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドの量を絶対量として測定する方法を見出し、キャリブレーターや標準品を用いた補正を必要としない測定方法および糖化タンパク質割合測定用キットを提供する。
【選択図】選択図なし
【解決手段】特定タンパク質量及び糖化された特定タンパク質量につき、これらの分解反応で生じる同一の特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドの量を絶対量として測定する方法を見出し、キャリブレーターや標準品を用いた補正を必要としない測定方法および糖化タンパク質割合測定用キットを提供する。
【選択図】選択図なし
Description
本発明は、酵素を用いた特定タンパク質の測定方法、糖化された特定タンパク質の測定方法、及び糖化タンパク質割合の測定方法に関する。また、糖化タンパク質割合測定用キットに関するものである。より詳細には、アルブミン;ヘモグロビンの測定方法;グリコアルブミン;グリコヘモグロビン、特にヘモグロビンA1cの測定方法;及びグリコアルブミン割合;グリコヘモグロビン割合の測定方法、特にヘモグロビンA1c値の測定方法に関し、グリコアルブミン割合測定用キット;グリコヘモグロビン割合測定用キット、特にヘモグロビンA1c測定用キットに関するものである。
さらに詳しくは、臨床生化学検査における上記測定方法、上記キットに関するものである。
さらに詳しくは、臨床生化学検査における上記測定方法、上記キットに関するものである。
近年、糖尿病患者は爆発的に増加しており、ヘモグロビンA1c(以下、HbA1cということがある)、グリコアルブミン(以下、GAということがある)、グリコヘモグロビン、フルクトサミン、1.5アンヒドログルシトールなどの血糖コントロールマーカー測定の需要が増加している。そのなかでもHbA1cとGAが多用されている。HbA1c値、GA値はこれまで高速液体クロマトグラフ法で測定されてきた(特許文献1、2、3参照)が、近年、大量検体を迅速に処理することが可能な免疫法(特許文献4、5参照)や酵素法(特許文献7、8、9及び非特許文献1参照)が開発されてきた。
従来、酵素法を用いて糖化タンパク質割合を測定する場合は、分子となる糖化された特定タンパク質量の測定のみ酵素法を用い、分母となる特定タンパク質量の測定は、酵素法以外の方法で別途測定されていた。例えば、GA値を測定する際のアルブミン量の測定には、臨床検査で常用されるBCG法あるいはBCP法等が用いられていた。
このように、特定タンパク質量と糖化された特定タンパク質量とを別々に測定して、糖化タンパク質割合を求める方法では、特定タンパク質量及び糖化された特定タンパク質量はそれぞれの標準品あるいはキャリブレーターを用いて各々個別に補正する必要があった。
特許第2562576号公報
特開平1−257257号公報
特開平3−255360号公報
特開昭64−16964号公報
特開平5−87809号公報
特開平5−192193号公報
特開平6−46846号公報
特開2001−204495号公報
特開2001−54398号公報
T.Kouzuma et.al,Clinica Chimica Acta,324(2002)61-71
従来、酵素法を用いて糖化タンパク質割合を測定する場合は、分子となる糖化された特定タンパク質量の測定のみ酵素法を用い、分母となる特定タンパク質量の測定は、酵素法以外の方法で別途測定されていた。例えば、GA値を測定する際のアルブミン量の測定には、臨床検査で常用されるBCG法あるいはBCP法等が用いられていた。
このように、特定タンパク質量と糖化された特定タンパク質量とを別々に測定して、糖化タンパク質割合を求める方法では、特定タンパク質量及び糖化された特定タンパク質量はそれぞれの標準品あるいはキャリブレーターを用いて各々個別に補正する必要があった。
特定タンパク質の糖化割合、中でもグリコアルブミン割合、グリコヘモグロビン割合、特にヘモグロビンA1c値を測定するにあたって、従来技術に比べて簡便かつ精度良く測定できる測定方法、および糖化タンパク質割合測定用キットを提供する。
上記課題を解決するために、本発明者らは、特定タンパク質の糖化割合を測定するに際し、キャリブレーターや標準品を用いた補正を必要としない測定方法の検討に想到し、鋭意検討した。その結果、特定タンパク質量及び糖化された特定タンパク質量につき、これらの分解反応で生じる同一の特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドの量を絶対量として測定する方法を見出し、本発明を完成するに至った。具体的には、グリコアルブミン割合を測定する場合には、プロテアーゼの分解反応およびケトアミンオキシダーゼの酸化反応で生成されるリジンの量(モル数)を測定し、グリコヘモグロビン割合を測定する場合には、バリンの量(モル数)を測定し、ヘモグロビンA1c値を測定する場合には、バリルヒスチジンの量(モル数)を測定することで、上記課題を解決した。
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
(1)以下の試薬を含む糖化タンパク質割合測定用キット。
1)特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成し、且つ、糖化された特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチド、並びに糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドを生成するプロテアーゼを含有する試薬
2)該特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素を含有する試薬
3)該糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドに作用し、該特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成する酵素を含有する試薬
(2)特定アミノ酸がリジンであり、特定タンパク質がアルブミンである、上記(1)に記載の糖化タンパク質割合測定用キット。
(3)リジンに作用する酵素が、リジンオキシダーゼである上記(2)に記載のグリコアルブミン割合測定用キット。
(4)特定アミノ酸がバリンであり、特定タンパク質がヘモグロビンである、上記(1)に記載の糖化タンパク質割合測定用キット。
(5)特定ペプチドがバリルヒスチジンであり、特定タンパク質がヘモグロビンA1cである、上記(1)に記載の糖化タンパク質割合測定用キット。
(6)以下の試薬を含むキットを用いた糖化タンパク質割合の測定方法。
1)特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成し、且つ、糖化された特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチド、並びに糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドを生成するプロテアーゼを含有する試薬
2)該特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素を含有する試薬
3)該糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドに作用し、該特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成する酵素を含有する試薬
(7)特定タンパク質がアルブミンであり、糖化タンパク質がグリコアルブミンである上記(6)に記載のグリコアルブミン割合の測定方法。
(8)特定タンパク質がヘモグロビンであり、糖化タンパク質がグリコヘモグロビンである上記(6)に記載のグリコヘモグロビン割合の測定方法。
(9)糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素と試料を反応させる際、プロテアーゼインヒビターによりプロテアーゼを不活化する上記(6)〜(8)のいずれかに記載の糖化タンパク質割合の測定方法。
(10)あらかじめ試料中の特定アミノ酸及び/又は特定ペプチド、並びに糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドを消去してから糖化タンパク質割合の測定を行う上記(6)〜(9)のいずれかに記載の糖化タンパク質割合の測定方法。
(11)以下の工程を含む糖化タンパク質割合の測定方法。
1)試料中の特定タンパク質及び糖化された特定タンパク質にプロテアーゼを反応させ、特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成し、糖化された特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチド、並びに糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドを生成させる工程
2)1)の工程で生成した糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドに、酵素を反応させて生成した反応生成物を測定して、試料中の糖化された特定アミノ酸残基量を測定する工程
3)1)及び2)の工程で生成した特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素を反応させて生成した反応生成物を測定して、試料中の特定アミノ酸残基量と糖化された特定アミノ酸残基量の総和を測定する工程
4)2)の測定結果と3)の測定結果から糖化タンパク質割合を算出する工程
(12)特定タンパク質がアルブミンであり、糖化された特定タンパク質がグリコアルブミンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドがリジンであり、糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドが糖化リジンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素が少なくともリジンに作用する酵素である上記(11)に記載のグリコアルブミン割合の測定方法。
(13)特定タンパク質がヘモグロビンであり、糖化された特定タンパク質がグリコヘモグロビンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドがバリンであり、糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドが糖化バリンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素が少なくともバリンに作用する酵素である上記(11)に記載のグリコヘモグロビン割合の測定方法。
(14)特定タンパク質がヘモグロビンであり、糖化された特定タンパク質がヘモグロビンA1cであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドがバリルヒスチジンであり、糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドが糖化バリルヒスチジンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素が少なくともバリルヒスチジンに作用する酵素である上記(11)に記載のグリコヘモグロビンA1c値の測定方法。
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
(1)以下の試薬を含む糖化タンパク質割合測定用キット。
1)特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成し、且つ、糖化された特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチド、並びに糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドを生成するプロテアーゼを含有する試薬
2)該特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素を含有する試薬
3)該糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドに作用し、該特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成する酵素を含有する試薬
(2)特定アミノ酸がリジンであり、特定タンパク質がアルブミンである、上記(1)に記載の糖化タンパク質割合測定用キット。
(3)リジンに作用する酵素が、リジンオキシダーゼである上記(2)に記載のグリコアルブミン割合測定用キット。
(4)特定アミノ酸がバリンであり、特定タンパク質がヘモグロビンである、上記(1)に記載の糖化タンパク質割合測定用キット。
(5)特定ペプチドがバリルヒスチジンであり、特定タンパク質がヘモグロビンA1cである、上記(1)に記載の糖化タンパク質割合測定用キット。
(6)以下の試薬を含むキットを用いた糖化タンパク質割合の測定方法。
1)特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成し、且つ、糖化された特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチド、並びに糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドを生成するプロテアーゼを含有する試薬
2)該特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素を含有する試薬
3)該糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドに作用し、該特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成する酵素を含有する試薬
(7)特定タンパク質がアルブミンであり、糖化タンパク質がグリコアルブミンである上記(6)に記載のグリコアルブミン割合の測定方法。
(8)特定タンパク質がヘモグロビンであり、糖化タンパク質がグリコヘモグロビンである上記(6)に記載のグリコヘモグロビン割合の測定方法。
(9)糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素と試料を反応させる際、プロテアーゼインヒビターによりプロテアーゼを不活化する上記(6)〜(8)のいずれかに記載の糖化タンパク質割合の測定方法。
(10)あらかじめ試料中の特定アミノ酸及び/又は特定ペプチド、並びに糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドを消去してから糖化タンパク質割合の測定を行う上記(6)〜(9)のいずれかに記載の糖化タンパク質割合の測定方法。
(11)以下の工程を含む糖化タンパク質割合の測定方法。
1)試料中の特定タンパク質及び糖化された特定タンパク質にプロテアーゼを反応させ、特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成し、糖化された特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチド、並びに糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドを生成させる工程
2)1)の工程で生成した糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドに、酵素を反応させて生成した反応生成物を測定して、試料中の糖化された特定アミノ酸残基量を測定する工程
3)1)及び2)の工程で生成した特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素を反応させて生成した反応生成物を測定して、試料中の特定アミノ酸残基量と糖化された特定アミノ酸残基量の総和を測定する工程
4)2)の測定結果と3)の測定結果から糖化タンパク質割合を算出する工程
(12)特定タンパク質がアルブミンであり、糖化された特定タンパク質がグリコアルブミンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドがリジンであり、糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドが糖化リジンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素が少なくともリジンに作用する酵素である上記(11)に記載のグリコアルブミン割合の測定方法。
(13)特定タンパク質がヘモグロビンであり、糖化された特定タンパク質がグリコヘモグロビンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドがバリンであり、糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドが糖化バリンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素が少なくともバリンに作用する酵素である上記(11)に記載のグリコヘモグロビン割合の測定方法。
(14)特定タンパク質がヘモグロビンであり、糖化された特定タンパク質がヘモグロビンA1cであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドがバリルヒスチジンであり、糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドが糖化バリルヒスチジンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素が少なくともバリルヒスチジンに作用する酵素である上記(11)に記載のグリコヘモグロビンA1c値の測定方法。
本発明の測定方法は、標準品あるいはキャリブレーターを用いた補正を必要としない画期的な測定方法であり、測定操作が非常に簡便となると同時に、キャリブレーションの影響や、異なる測定法にもとづく測定誤差の影響を回避することができる。従って、従来と同等もしくはそれ以上の精度で特定タンパク質の糖化割合を計算しうる方法である。従って本発明のキットは、例えば、医療診断に必要な測定を患者近傍で行うベットサイド診断用の分析(POC)等に特に有用である。
以下、この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
本発明に使用しうる試料としては、特定タンパク質が糖化されたタンパク質、好ましくはグリコアルブミン、及び/又はグリコヘモグロビンを含有するものであればいかなる試料を用いてもよいが、たとえば血液(血漿、血清、赤血球、溶血液等)、尿、体液、食品、タンパク質製剤などの医薬品などが挙げられる。
本発明に使用しうる試料としては、特定タンパク質が糖化されたタンパク質、好ましくはグリコアルブミン、及び/又はグリコヘモグロビンを含有するものであればいかなる試料を用いてもよいが、たとえば血液(血漿、血清、赤血球、溶血液等)、尿、体液、食品、タンパク質製剤などの医薬品などが挙げられる。
本発明における特定タンパク質としては、前記試料中に含有されるものであり、その糖化割合等を測定することが臨床的に意義のあるものであればいかなるタンパク質でもよいが、アルブミンやヘモグロビン等が好適な例として挙げられる。
本発明における糖化タンパク質割合としては、上記臨床的意義のあるものであればいかなる糖化タンパク質割合でもよいが、グリコアルブミン割合やグリコヘモグロビン割合等が好適な例として挙げられ、グリコヘモグロビン割合の中では特にヘモグロビンA1c値が好適な例として挙げられる。
ここで、糖化タンパク質割合とは、特定アミノ酸残基量(X)(試料中の特定タンパク質に存在する特定アミノ酸残基量と糖化された特定タンパク質に存在する特定アミノ酸残基量の総和)と糖化された特定タンパク質に存在する糖化された特定アミノ酸残基量(Y)の総和(X+Y)を分母にとり、糖化された特定タンパク質に存在する糖化された特定アミノ酸残基量(Y)を分子にとり、100倍した数値をいう。
ここで、糖化タンパク質割合とは、特定アミノ酸残基量(X)(試料中の特定タンパク質に存在する特定アミノ酸残基量と糖化された特定タンパク質に存在する特定アミノ酸残基量の総和)と糖化された特定タンパク質に存在する糖化された特定アミノ酸残基量(Y)の総和(X+Y)を分母にとり、糖化された特定タンパク質に存在する糖化された特定アミノ酸残基量(Y)を分子にとり、100倍した数値をいう。
本発明に使用しうるプロテアーゼとしては、臨床検査に使用できるものであり、試料(被検液)に含まれる特定タンパク質が糖化されたタンパク質及び特定タンパク質に有効に作用し、かつ当該特定タンパク質由来の特定のアミノ酸及び/又は特定ペプチド(以下、アミノ酸等ということがある)、及び糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチド(以下、糖化アミノ酸等ということがある)を有効に生成するものであればいかなるプロテアーゼを用いてもよい。例えばトリプシン(Tripsin)、キモトリプシン(Chymotripsin)等の動物由来のプロテアーゼ、パパイン(Papain)、ブロメライン(Bromelain)等の植物由来のプロテアーゼ、又は微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
微生物由来のプロテアーゼの例としては、ズブチリシン(Subtilisin)や中性プロテアーゼ(Toyobo社製)等に代表されるバチルス(Bacillus)属由来プロテアーゼ、プロテアーゼタイプ-XIII(シグマ社製)等に代表されるアスペルギルス(Aspergillus)由来プロテアーゼ、PD酵素(キッコーマン社製)等に代表されるペニシリウム(Penicillium)由来プロテアーゼ、プロナーゼ(Pronase)等に代表されるストレプトマイセス(Streptomyces)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼLys-c(シグマ社製)等に代表されるリソバクター(Lysobacter)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼA(Proteinase A;シグマ社製) 等に代表される酵母(Yeast)由来プロテアーゼ、プロテイナーゼK(Proteinase K;シグマ社製)等に代表されるトリチラチウム(Tritirachium)由来プロテアーゼ、アミノペプチダーゼT(Aminopeptidase T;ベーリンガー・マンハイム社製)等に代表されるサーマス(Thermus)由来プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼAsp-N(EndoproteinaseAsp-N;和光純薬社製)等に代表されるシュードモナス(Pseudomonus)由来プロテアーゼ、リジルエンドペプチダーゼ(Lysylendopeptidase和光純薬社製)等に代表されるアクロモバクター(Achromobacter)由来プロテアーゼが挙げられる。これらの具体的な例は一例に過ぎず、本発明に使用しうるプロテアーゼはなんら限定されるものではない。
本発明に使用しうるプロテアーゼを含有する試薬としては、該プロテアーゼが有効に作用する試薬であり、少なくとも該プロテアーゼを含有するものであればよく、プロテアーゼ自体であってもよい。プロテアーゼ以外に含むものとしては、例えば、酵素の安定化剤、緩衝剤、等があげられる。また、特定タンパク質以外にはプロテアーゼが作用しないようなプロテアーゼ阻害剤を組み合わせ、特定のタンパク質のみを分解し、当該特定タンパク質の糖化割合を本発明の方法またはキットにより測定することもできる。
本発明に使用しうる糖化された特定アミノ酸等に作用する酵素としては、臨床検査に使用できるものであり、前記プロテアーゼの作用によって生成された糖化された特定アミノ酸等に作用して対応するアミノ酸等を有効に生成するものであればいかなる酵素を用いてもよい。糖化された特定アミノ酸等に作用する酵素としては、糖化リジンに良好に作用してリジンと過酸化水素を生成するケトアミンオキシダーゼ、糖化バリンに良好に作用してバリンと過酸化水素を生成するケトアミンオキシダーゼ、糖化バリルヒスチジンに良好に作用してバリルヒスチジンと過酸化水素を生成するケトアミンオキシダーゼ等が好適な例として挙げられる。糖化リジンに良好に作用してリジンと過酸化水素を生成するケトアミンオキシダーゼは、特にグリコアルブミン量、グリコアルブミン割合を測定する場合に有効である。また、糖化バリンに良好に作用してバリンと過酸化水素を生成するケトアミンオキシダーゼは、特にグリコヘモグロビン量、グリコヘモグロビン割合を測定する場合に有効である。さらに、糖化バリルヒスチジンに良好に作用してバリルヒスチジンと過酸化水素を生成するケトアミンオキシダーゼは、特にヘモグロビンA1c値を測定する場合に有効である。
微生物由来の糖化アミノ酸等に作用する酵素の由来としては、ギベレラ(Gibberella)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、カンジダ(Candida)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フサリウム(Fusarium)属、アクレモニウム(Acremonium)属、又はデバリオマイゼス(Debaryomyces)属由来のケトアミンオキシダーゼ等が挙げられる。
さらには、特にヘモグロビンA1c値の測定に有効な糖化アミノ酸等に作用する酵素としては、αアミノ基が糖化された糖化アミノ酸等に特異的に作用し、実質的にεアミノ基が糖化された糖化アミノ酸等には作用しない酵素であれば如何なる酵素でもよい。一例として、コリネバクテリウム(Corynebacterium)由来の酵素が挙げられる。
また、特にグリコアルブミン割合の測定に有効な糖化アミノ酸等に作用する酵素としては、εアミノ基が糖化された糖化アミノ酸等に作用し、実質的にαアミノ基が糖化された糖化アミノ酸等には作用しない酵素として、フルクトサミンオキシダーゼ(FODVII;旭化成ファーマ社製;PCT/JP02/0072)、又はその遺伝子操作によって反応の特異性を上げた酵素が挙げられる。
本発明に使用しうる糖化アミノ酸等に作用する酵素を含有する試薬としては、該糖化アミノ酸等に作用する酵素が有効に作用する試薬であり、少なくとも該糖化アミノ酸等に作用する酵素を含有するものであればよく、糖化アミノ酸等に作用する酵素自体であってもよい。
本発明に使用しうるアミノ酸等に作用する酵素としては、臨床検査に使用できるものであり、前記プロテアーゼの作用によって生成された糖化されていないアミノ酸等、さらには前記糖化アミノ酸等に作用する酵素の作用によって生成されたアミノ酸等に作用し、かつ当該アミノ酸等由来の測定可能な化合物等を有効に生成又は消費するものであればいかなる酵素を用いてもよい。アミノ酸等に作用する酵素としては、リジンに作用する酵素、バリンに作用する酵素、バリルヒスチジンに作用する酵素等が好適な例として挙げられる。
リジンに作用する酵素としては、リジンデヒドロゲナーゼ(EC 1.4.1.15)、リジン6−デヒドロゲナーゼ(EC 1.4.1.-)、アミノ酸オキシダーゼ(EC 1.4.3.2)、リジンオキシダーゼ(EC 1.4.3.14)、リジンα−オキシダーゼ(EC 1.4.3.-)、リジン2−モノオキシゲナーゼ(EC 1.13.12.2)、リジン6−アミノトランスフェラーゼ(EC 2.6.1.36)、リジンデカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.18)等が挙げられるが、中でもリジンを酸化したとき生成あるいは消費される物質を直接測定する方法が望ましい。
またバリンに作用する酵素としては、アミノ酸オキシダーゼ(EC 1.4.3.2)、バリンオキシダーゼ等が考えられるが、バリンを酸化したとき生成あるいは消費される物質を直接測定する方法が好ましい。
アミノ酸等由来の測定可能な化合物等の生成又は消費としては、NADHの生成、酸素の消費、過酸化水素の生成等が挙げられるが、これらは一例に過ぎず、反応の生成物あるいは消費物の変化量を適当な方法で測定できれば何ら限定されない。
該変化量の定量方法としては、直接測定する方法が望ましい。例えばデヒドロゲナーゼの場合、生成するNADHを直接あるいは蛍光法、発光法を用いて高感度に測定するか、ホルマザン等を用いて発色させて分光学的に測定すればよく、あるいは電極に酵素を固定化して電気化学的に測定すればよい。また、オキシダーゼの場合、酸素消費量を電気化学的に、あるいはマノメーター等を用いて測定すればよく、または生成する過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて電気化学的、あるいは発色基質を用いて発色させるか、ルシフェラーゼを用いた発光法等を用いて分光学的に測定すればよい。その他の酵素でも、それぞれの反応の生成物あるいは消費物の変化量を適当な方法で測定すればよくここに述べた方法はその一例に過ぎない。
該変化量の定量方法としては、直接測定する方法が望ましい。例えばデヒドロゲナーゼの場合、生成するNADHを直接あるいは蛍光法、発光法を用いて高感度に測定するか、ホルマザン等を用いて発色させて分光学的に測定すればよく、あるいは電極に酵素を固定化して電気化学的に測定すればよい。また、オキシダーゼの場合、酸素消費量を電気化学的に、あるいはマノメーター等を用いて測定すればよく、または生成する過酸化水素をペルオキシダーゼを用いて電気化学的、あるいは発色基質を用いて発色させるか、ルシフェラーゼを用いた発光法等を用いて分光学的に測定すればよい。その他の酵素でも、それぞれの反応の生成物あるいは消費物の変化量を適当な方法で測定すればよくここに述べた方法はその一例に過ぎない。
本発明におけるキットとしては、少なくとも1)プロテアーゼを含有する試薬、2)特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素を含有する試薬、3)糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドに作用する酵素を含有する試薬を含むキットであって、該試薬の組み合わせが、プロテアーゼの分解反応によって生じるアミノ酸等と、糖化アミノ酸等に作用する酵素によって生じるアミノ酸等が同一種類の特定アミノ酸等である糖化タンパク質割合測定用キットであればよい。特定アミノ酸としてはリジン、バリン等が好適な例として挙げられる。また、特定ペプチドとしては、バリルヒスチジン等が挙げられ、さらには、末端または非末端にリジン、バリン、バリルヒスチジンが存在するオリゴペプチドも挙げられる。また、特定アミノ酸及び特定ペプチドを生成するとは、上記特定アミノ酸と特定ペプチドの組み合わせを生成するものも含む意味である。例えば、アミノ酸であるリジン、リジンを末端に含むオリゴペプチド、リジンを非末端に含むオリゴペプチドを生成するプロテアーゼも本発明の前記1)のプロテアーゼに該当する。
プロテアーゼとそれによって生じる特定アミノ酸との関係について、より具体的には、以下のものが例示される。
特定タンパク質がアルブミンである場合に、糖化アルブミンからプロテアーゼによって生成される特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドとしては、「−ValProLysGluPhe−」、「ThrLysLysValPro−」、「−AlaAspLysArgAsp−」、「−AlaAspLysAlaAla−」で表されるペンタマーから得られる、Lysを含有する配列を有するアミノ酸及び/又はペプチドが挙げられ、特にLys(リジン)が挙げられる。
糖化ヘモグロビンからプロテアーゼによって生成される特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドとしては、バリン、バリルヒスチジンが挙げられ、さらには、末端または非末端にバリンが存在するオリゴペプチドであって、且つアスパラギン、ヒスチジン、又はセリンを末端に有する配列も挙げられる。特定タンパク質がヘモグロビンである場合には、これら全てを測定すればよい。また、特定タンパク質がヘモグロビンA1cである場合には、バリルヒスチジンのみを測定すればよい。
特定タンパク質がアルブミンである場合に、糖化アルブミンからプロテアーゼによって生成される特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドとしては、「−ValProLysGluPhe−」、「ThrLysLysValPro−」、「−AlaAspLysArgAsp−」、「−AlaAspLysAlaAla−」で表されるペンタマーから得られる、Lysを含有する配列を有するアミノ酸及び/又はペプチドが挙げられ、特にLys(リジン)が挙げられる。
糖化ヘモグロビンからプロテアーゼによって生成される特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドとしては、バリン、バリルヒスチジンが挙げられ、さらには、末端または非末端にバリンが存在するオリゴペプチドであって、且つアスパラギン、ヒスチジン、又はセリンを末端に有する配列も挙げられる。特定タンパク質がヘモグロビンである場合には、これら全てを測定すればよい。また、特定タンパク質がヘモグロビンA1cである場合には、バリルヒスチジンのみを測定すればよい。
グリコアルブミン割合測定用キットとしては、同一種類の特定アミノ酸又は特定ペプチドがリジンであること、すなわち、プロテアーゼの分解反応で生じるアミノ酸等、及び糖化アミノ酸等に作用する酵素によって生成するアミノ酸等が共にリジンであることが好ましい。この場合において、アミノ酸等に作用する酵素が少なくともリジンに作用する酵素であることが好ましく、リジンオキシダーゼであることがより好ましい。
グリコヘモグロビン割合測定用キットとしては、同一種類のアミノ酸等がバリン又はバリルヒスチジンであること、すなわち、プロテアーゼの分解反応、及び糖化アミノ酸等に作用する酵素によって生成するアミノ酸等がバリン又はバリルヒスチジンであることが好ましい。この場合において、アミノ酸等に作用する酵素が少なくともバリンに作用する酵素又は少なくともバリルヒスチジンに作用する酵素であることが好ましい。グリコヘモグロビン割合測定用キットとしては、同一種類の特定アミノ酸等としてバリンが生成する組み合わせであることが好ましい。別の態様として、バリルヒスチジンが生成する組み合わせが好ましい場合もある。
また、ヘモグロビンA1c値測定用キットとしては、同一種類の特定アミノ酸等としてバリルヒスチジンが生成する組み合わせであることが好ましい。
キット化された試薬において、互いに測定に悪影響を及ぼさないもの同士は一の試薬とし、キット数を減らすことができる。例えば、プロテアーゼとケトアミンオキシダーゼとリジンオキシダーゼを用いたアルブミンの測定の場合、プロテアーゼとケトアミンオキシダーゼ、或いはプロテアーゼとリジンオキシダーゼは、互いに悪影響を及ぼさないものを選択した場合には、同一の試薬とすることができる。
本発明の糖化タンパク質割合の測定方法は、糖化アミノ酸等に作用する酵素と試料を反応させるに先立ち、プロテアーゼと試料を反応させた後、糖化アミノ酸等に作用する酵素と試料を反応させて生成するアミノ酸等に、アミノ酸等に作用する酵素を反応させることを特徴とする測定方法であり、具体的には、以下の工程を含む方法が挙げられる。
1)試料中の特定タンパク質及び糖化された特定タンパク質にプロテアーゼを反応させ、特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成し、糖化された特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチド、並びに糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドを生成させる工程
2)1)の工程で生成した糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドに、酵素を反応させて生成した反応生成物を測定して、試料中の糖化された特定アミノ酸残基量を測定する工程
3)1)及び2)の工程で生成した特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素を反応させて生成した反応生成物を測定して、試料中の特定アミノ酸残基量と糖化された特定アミノ酸残基量の総和を測定する工程
4)2)の測定結果と3)の測定結果から糖化タンパク質割合を算出する工程
1)試料中の特定タンパク質及び糖化された特定タンパク質にプロテアーゼを反応させ、特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成し、糖化された特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチド、並びに糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドを生成させる工程
2)1)の工程で生成した糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドに、酵素を反応させて生成した反応生成物を測定して、試料中の糖化された特定アミノ酸残基量を測定する工程
3)1)及び2)の工程で生成した特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素を反応させて生成した反応生成物を測定して、試料中の特定アミノ酸残基量と糖化された特定アミノ酸残基量の総和を測定する工程
4)2)の測定結果と3)の測定結果から糖化タンパク質割合を算出する工程
プロテアーゼが、反応に関与する酵素に作用して測定に支障をきたす場合には、工程2)において、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素と同時にプロテアーゼインヒビターを添加し、プロテアーゼを不活化すればよい。
また、試料には内在性のアミノ酸等、糖化アミノ酸等が存在している場合がある。この場合には、アミノ酸等に作用する酵素と糖化アミノ酸等に作用する酵素を用いて前もって試料中のアミノ酸等、糖化アミノ酸等を酸化し、生成した過酸化水素をカタラーゼを用いて消去した後に、カタラーゼを失活させ、特定タンパク質の糖化割合を前述と同様の方法で測定すればよい。
さらに本発明に基づく酵素を用いた糖化タンパク質の検出には、界面活性剤、塩類、緩衝剤、pH調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加しても良い。
具体的な例として、アルブミンの糖化割合を測定する方法について説明する。アルブミンに特異的なプロテアーゼで試料中のアルブミンを分解すると、アルブミン及び糖化アルブミンから糖化されていないリジンがXmolと糖化リジンが生成される。さらに、生成された糖化リジンにケトアミンオキシダーゼを作用させて酸化すると、過酸化水素とリジンがYmolずつ生成される。本発明では、反応のそれぞれの段階で生成されるリジンを上記の方法に従って測定すればアルブミン中の糖化割合を算出することができる。アルブミンの糖化割合(以下、GA%ということがある)は以下の式で求めることができる。
GA(%)=100Y/(X+Y)
アルブミンを構成する59個のリジンの内、数個のリジンが糖化されていると言われており、アルブミンの分解で切り出されるリジンの数は、反応の条件、プロテアーゼの種類や使用量等により大きく変動するが、反応条件を均質化すれば安定した結果を出すことができる。
GA(%)=100Y/(X+Y)
アルブミンを構成する59個のリジンの内、数個のリジンが糖化されていると言われており、アルブミンの分解で切り出されるリジンの数は、反応の条件、プロテアーゼの種類や使用量等により大きく変動するが、反応条件を均質化すれば安定した結果を出すことができる。
プロテアーゼが、アミノ酸等と反応する酵素に作用して測定に支障をきたす場合には、アミノ酸等と反応する酵素であるケトアミンオキシダーゼと同時にプロテアーゼインヒビターを添加し、プロテアーゼを不活化すればよい。
また、測定したい試料には内在性のリジンあるいは糖化リジンが存在している場合がある。この時にはリジンオキシダーゼとケトアミンオキシダーゼを用いて前もって試料中のリジンおよび糖化リジンを酸化し、生成された過酸化水素をカタラーゼを用いて消去した後に、カタラーゼを失活させ、アルブミンの糖化割合を前述と同様の方法で測定すればよい。
また、測定したい試料には内在性のリジンあるいは糖化リジンが存在している場合がある。この時にはリジンオキシダーゼとケトアミンオキシダーゼを用いて前もって試料中のリジンおよび糖化リジンを酸化し、生成された過酸化水素をカタラーゼを用いて消去した後に、カタラーゼを失活させ、アルブミンの糖化割合を前述と同様の方法で測定すればよい。
本発明に使用しうる糖化アミノ酸等に作用する酵素濃度としては、0.1〜500U/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは0.5〜200 U/ml、最も好ましくは1.0〜100 U/mlであるがこれらの濃度に限定されるものではない。また、本発明に使用しうるプロテアーゼの濃度としては、0.1U〜1MU/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは1U〜500KU/ml、最も好ましくは5U〜100KU/mlであるが、これらの濃度に限定されるものではない。また、本発明に使用しうるアミノ酸及び/又はペプチドに作用する酵素濃度としては、0.05〜400U/mlの濃度で使用すれば良く、好ましくは0.5〜200U/ml、最も好ましくは1.0〜100U/mlであるが、これらの濃度に限定されるものではない。
これらの酵素類を電極等に固定化する場合には、十分な検出感度が得られる量が固定化できていれば良い。
これらの酵素類を電極等に固定化する場合には、十分な検出感度が得られる量が固定化できていれば良い。
また、近年、医療診断に必要な測定を患者近傍で行うベットサイド診断用の分析(POCと呼称される)が求められるようになっている。POC分析において分析・測定が必要とされる現場で血液成分を測定する場合には、安価で迅速且つ簡便な血液の前処理方法かあるいは血液そのもので血漿分離機構が組み込まれる場合も想定され、直接血漿成分を測定する方法が求められている。
さらに測定に用いる検体の量もできるだけ微量化することが患者への負担を軽減する上でも重要となり、特に最近は、半導体集積回路の作製技術を応用した微量あるいは極微量の試料を分析する技術領域が注目されており、このようなマイクロトータルアナリシスシステムと称されている分析システムに上述と同様の分析手法、例えば分光学的方法や電気化学的方法を組み入れることによりドライケミストリー化やチップ化、カード化も可能となり、小型の糖化タンパク質、特に糖化アルブミン分析用機器を提供することが可能になる。
次に、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれにより限定されるものではない。
〔実施例1〕リジンオキシダーゼを用いたリジンの測定
反応液1の組成
50mM トリス塩酸緩衝液(和光純薬社製)、pH7.6
3mM 4−アミノアンチピリン(和光純薬社製)
3mM TODB(同人化学研究所社製)
5u/mL ペルオキシダーゼ(シグマ社製)
0.2% トリトンX−100(シグマ社製)
5u/mL リジンオキシダーゼ(シグマ社製)
試料
リジン水溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mM
反応手順
反応液1を1mL取り、セルに分注し、37℃で5分間インキュベーションして波長555nmで測光した(A0)。次に、試料を0.01mL添加、攪拌し、37℃で5分
間インキュベーションして555nmで測光した(A1)。
各試料における吸光度変化を計算し(ΔA1=A1−A0)、その結果を表1に示す。
〔実施例1〕リジンオキシダーゼを用いたリジンの測定
反応液1の組成
50mM トリス塩酸緩衝液(和光純薬社製)、pH7.6
3mM 4−アミノアンチピリン(和光純薬社製)
3mM TODB(同人化学研究所社製)
5u/mL ペルオキシダーゼ(シグマ社製)
0.2% トリトンX−100(シグマ社製)
5u/mL リジンオキシダーゼ(シグマ社製)
試料
リジン水溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mM
反応手順
反応液1を1mL取り、セルに分注し、37℃で5分間インキュベーションして波長555nmで測光した(A0)。次に、試料を0.01mL添加、攪拌し、37℃で5分
間インキュベーションして555nmで測光した(A1)。
各試料における吸光度変化を計算し(ΔA1=A1−A0)、その結果を表1に示す。
〔実施例2〕ケトアミンオキシダーゼとリジンオキシダーゼを用いた糖化-Z-リジンの測定
反応液2の組成
50mM トリス塩酸緩衝液、pH7.6
3mM 4−アミノアンチピリン
3mM TODB
5u/mL ペルオキシダーゼ
0.2% トリトンX−100
5u/mL リジンオキシダーゼ
5u/mL ケトアミンオキシダーゼ(旭化成ファーマ社製)
試料
糖化-Z-リジン水溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mM
糖化リジンはHashibaらの方法により合成した。
参考文献:Hashiba H,J.Agric.Food Chem.24:70,1976
反応手順
反応液2を1mL取り、セルに分注し、37℃で5分間インキュベーションして、波長555nmで測光した(A0)。次に、試料を0.01mL添加、攪拌し、37℃で5分間インキュベーションして555nmで測光した(A2)。
各試料における吸光度変化を計算し(ΔA2=A2−A0)、その結果を表2に示す。
反応液2の組成
50mM トリス塩酸緩衝液、pH7.6
3mM 4−アミノアンチピリン
3mM TODB
5u/mL ペルオキシダーゼ
0.2% トリトンX−100
5u/mL リジンオキシダーゼ
5u/mL ケトアミンオキシダーゼ(旭化成ファーマ社製)
試料
糖化-Z-リジン水溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mM
糖化リジンはHashibaらの方法により合成した。
参考文献:Hashiba H,J.Agric.Food Chem.24:70,1976
反応手順
反応液2を1mL取り、セルに分注し、37℃で5分間インキュベーションして、波長555nmで測光した(A0)。次に、試料を0.01mL添加、攪拌し、37℃で5分間インキュベーションして555nmで測光した(A2)。
各試料における吸光度変化を計算し(ΔA2=A2−A0)、その結果を表2に示す。
〔実施例3〕プロテアーゼとケトアミンオキシダーゼを用いた糖化アルブミンの測定
反応液3−1の組成
50mM トリス塩酸緩衝液、pH7.6
6mM 4−アミノアンチピリン
2500u/mL プロテアーゼtypeXXIV(シグマ社製)
1% CHAPSO(同人化学研究所社製)
10u/mL アスコルビン酸オキシダーゼ(ロッシュ社製)
反応液3−2の組成
50mM トリス塩酸緩衝液、pH7.6
6mM TODB
10u/mL ペルオキシダーゼ
5u/mL ケトアミンオキシダーゼ
試料
糖化アルブミン水溶液 約8%、15%、21%、34%、40%
(糖化アルブミン水溶液;GA%をルシカGA(旭化成ファーマ社製)を用いて測定してGA%が0と53%に調製したものを混合した、アルブミン濃度は4.3g/dL。)
反応手順
反応液3−1を0.5mL取り、セルに分注し、次いで、糖化アルブミン水溶液0.01mLを添加、攪拌して37℃で10分間インキュベーションした。次に、反応液3−2を0.5mL添加、攪拌後、直ちに555nmで測光した(A3−1)。次に、37℃で5分間インキュベーションして555nmで測光した(A3−2)。
各試料における吸光度変化を計算し(ΔA3=A3−2−A3−1)、その結果を表3に示す。
反応液3−1の組成
50mM トリス塩酸緩衝液、pH7.6
6mM 4−アミノアンチピリン
2500u/mL プロテアーゼtypeXXIV(シグマ社製)
1% CHAPSO(同人化学研究所社製)
10u/mL アスコルビン酸オキシダーゼ(ロッシュ社製)
反応液3−2の組成
50mM トリス塩酸緩衝液、pH7.6
6mM TODB
10u/mL ペルオキシダーゼ
5u/mL ケトアミンオキシダーゼ
試料
糖化アルブミン水溶液 約8%、15%、21%、34%、40%
(糖化アルブミン水溶液;GA%をルシカGA(旭化成ファーマ社製)を用いて測定してGA%が0と53%に調製したものを混合した、アルブミン濃度は4.3g/dL。)
反応手順
反応液3−1を0.5mL取り、セルに分注し、次いで、糖化アルブミン水溶液0.01mLを添加、攪拌して37℃で10分間インキュベーションした。次に、反応液3−2を0.5mL添加、攪拌後、直ちに555nmで測光した(A3−1)。次に、37℃で5分間インキュベーションして555nmで測光した(A3−2)。
各試料における吸光度変化を計算し(ΔA3=A3−2−A3−1)、その結果を表3に示す。
〔実施例4〕プロテアーゼとケトアミンオキシダーゼおよびリジンオキシダーゼを用いたアルブミンの測定
反応液4−1の組成
50mM トリス塩酸緩衝液、pH7.6
6mM 4−アミノアンチピリン
2500u/mL プロテアーゼtypeXXIV
1% CHAPSO
10u/mL アスコルビン酸オキシダーゼ
反応液4−2の組成
50mM トリス塩酸緩衝液、pH7.6
6mM TODB
10u/mL ペルオキシダーゼ
5u/mL ケトアミンオキシダーゼ
反応液4−3の組成
50mM トリス塩酸緩衝液、pH7.6
500u/mL リジンオキシダーゼ
試料
糖化アルブミン水溶液 約8%、15%、21%、34%、40%
(糖化アルブミン水溶液;GA%をルシカGA(旭化成ファーマ社製)を用いて測定してGA%が0と53%に調製したものを混合した、アルブミン濃度は4.3g/dL。)
反応手順
反応液4−1を0.5mL取り、セルに分注し、次いで、糖化アルブミン水溶液0.01mLを添加、攪拌して37℃で10分間インキュベーションした。次に、反応液4−2を0.5mL添加、攪拌後、直ちに555nmで測光した(A4−1)。次に、37℃で5分間インキュベーションして555nmで測光した(A4−2)。さらに、反応液4−3を0.01mL添加、攪拌して37℃で5分間インキュベーションして555nmで測光した(A4−3)。各試料における吸光度変化を計算し、その結果を表4に示す。
ΔA4-1=A4−2−A4−1、ΔA4-2=A4−3−A4−2
反応液4−1の組成
50mM トリス塩酸緩衝液、pH7.6
6mM 4−アミノアンチピリン
2500u/mL プロテアーゼtypeXXIV
1% CHAPSO
10u/mL アスコルビン酸オキシダーゼ
反応液4−2の組成
50mM トリス塩酸緩衝液、pH7.6
6mM TODB
10u/mL ペルオキシダーゼ
5u/mL ケトアミンオキシダーゼ
反応液4−3の組成
50mM トリス塩酸緩衝液、pH7.6
500u/mL リジンオキシダーゼ
試料
糖化アルブミン水溶液 約8%、15%、21%、34%、40%
(糖化アルブミン水溶液;GA%をルシカGA(旭化成ファーマ社製)を用いて測定してGA%が0と53%に調製したものを混合した、アルブミン濃度は4.3g/dL。)
反応手順
反応液4−1を0.5mL取り、セルに分注し、次いで、糖化アルブミン水溶液0.01mLを添加、攪拌して37℃で10分間インキュベーションした。次に、反応液4−2を0.5mL添加、攪拌後、直ちに555nmで測光した(A4−1)。次に、37℃で5分間インキュベーションして555nmで測光した(A4−2)。さらに、反応液4−3を0.01mL添加、攪拌して37℃で5分間インキュベーションして555nmで測光した(A4−3)。各試料における吸光度変化を計算し、その結果を表4に示す。
ΔA4-1=A4−2−A4−1、ΔA4-2=A4−3−A4−2
〔実施例5〕実施例4の方法とルシカGAで測定した血清中のGA%の相関関係
試料として、糖化アルブミン水溶液の代わりに血清30検体を、実施例4の本発明の方法とルシカGAを用いた方法で測定し、2法間の相関を検討した結果を表5に示した。本発明は、キャリブレーターを使用しないにもかかわらず、得られた測定値はルシカGAを用いた測定値と良好な相関関係を示した(R2=0.96)。
上記結果より、現在、現場で用いられているアルブミンの糖化割合の測定方法(従来法という)を本発明の方法により直ちに置き換えて使用する場合は、従来法と本発明の方法による結果をあらかじめ求めた係数を用い、本発明の測定結果を従来法を用いた測定値に換算することで、従来法との連続性を持った測定が可能となることはいうまでもない。
本発明によるGA%は以下の式により計算して求めた。
GA(%)=100×ΔA4-1/ΔA4-2
試料として、糖化アルブミン水溶液の代わりに血清30検体を、実施例4の本発明の方法とルシカGAを用いた方法で測定し、2法間の相関を検討した結果を表5に示した。本発明は、キャリブレーターを使用しないにもかかわらず、得られた測定値はルシカGAを用いた測定値と良好な相関関係を示した(R2=0.96)。
上記結果より、現在、現場で用いられているアルブミンの糖化割合の測定方法(従来法という)を本発明の方法により直ちに置き換えて使用する場合は、従来法と本発明の方法による結果をあらかじめ求めた係数を用い、本発明の測定結果を従来法を用いた測定値に換算することで、従来法との連続性を持った測定が可能となることはいうまでもない。
本発明によるGA%は以下の式により計算して求めた。
GA(%)=100×ΔA4-1/ΔA4-2
本発明は、標準品あるいはキャリブレーターによる補正が不要であり、非常に簡便に従来と同等以上の精度で糖化タンパク質の割合を測定することが可能であり、臨床診断の分野で好適に利用できる。
Claims (14)
- 以下の試薬を含む糖化タンパク質割合測定用キット。
1)特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成し、且つ、糖化された特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチド、並びに糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドを生成するプロテアーゼを含有する試薬
2)該特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素を含有する試薬
3)該糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドに作用し、該特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成する酵素を含有する試薬 - 特定アミノ酸がリジンであり、特定タンパク質がアルブミンである、請求項1に記載の糖化タンパク質割合測定用キット。
- リジンに作用する酵素が、リジンオキシダーゼである請求項2に記載のグリコアルブミン割合測定用キット。
- 特定アミノ酸がバリンであり、特定タンパク質がヘモグロビンである、請求項1に記載の糖化タンパク質割合測定用キット。
- 特定ペプチドがバリルヒスチジンであり、特定タンパク質がヘモグロビンA1cである、請求項1に記載の糖化タンパク質割合測定用キット。
- 以下の試薬を含むキットを用いた糖化タンパク質割合の測定方法。
1)特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成し、且つ、糖化された特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチド、並びに糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドを生成するプロテアーゼを含有する試薬
2)該特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素を含有する試薬
3)該糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドに作用し、該特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成する酵素を含有する試薬 - 特定タンパク質がアルブミンであり、糖化タンパク質がグリコアルブミンである請求項6に記載のグリコアルブミン割合の測定方法。
- 特定タンパク質がヘモグロビンであり、糖化タンパク質がグリコヘモグロビンである請求項6に記載のグリコヘモグロビン割合の測定方法。
- 糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素と試料を反応させる際、プロテアーゼインヒビターによりプロテアーゼを不活化する請求項6〜8のいずれかに記載の糖化タンパク質割合の測定方法。
- あらかじめ試料中の特定アミノ酸及び/又は特定ペプチド、並びに糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドを消去してから糖化タンパク質割合の測定を行う請求項6〜9のいずれかに記載の糖化タンパク質割合の測定方法。
- 以下の工程を含む糖化タンパク質割合の測定方法。
1)試料中の特定タンパク質及び糖化された特定タンパク質にプロテアーゼを反応させ、特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドを生成し、糖化された特定タンパク質を分解して特定アミノ酸及び/又は特定ペプチド、並びに糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドを生成させる工程
2)1)の工程で生成した糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドに、酵素を反応させて生成した反応生成物を測定して、試料中の糖化された特定アミノ酸残基量を測定する工程
3)1)及び2)の工程で生成した特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素を反応させて生成した反応生成物を測定して、試料中の特定アミノ酸残基量と糖化された特定アミノ酸残基量の総和を測定する工程
4)2)の測定結果と3)の測定結果から糖化タンパク質割合を算出する工程 - 特定タンパク質がアルブミンであり、糖化された特定タンパク質がグリコアルブミンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドがリジンであり、糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドが糖化リジンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素が少なくともリジンに作用する酵素である請求項11に記載のグリコアルブミン割合の測定方法。
- 特定タンパク質がヘモグロビンであり、糖化された特定タンパク質がグリコヘモグロビンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドがバリンであり、糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドが糖化バリンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素が少なくともバリンに作用する酵素である請求項11に記載のグリコヘモグロビン割合の測定方法。
- 特定タンパク質がヘモグロビンであり、糖化された特定タンパク質がヘモグロビンA1cであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドがバリルヒスチジンであり、糖化された特定アミノ酸及び/又は糖化された特定ペプチドが糖化バリルヒスチジンであり、特定アミノ酸及び/又は特定ペプチドに作用する酵素が少なくともバリルヒスチジンに作用する酵素である請求項11に記載のグリコヘモグロビンA1c値の測定方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004340877A JP2006149230A (ja) | 2004-11-25 | 2004-11-25 | 糖化タンパク質割合の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004340877A JP2006149230A (ja) | 2004-11-25 | 2004-11-25 | 糖化タンパク質割合の測定方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006149230A true JP2006149230A (ja) | 2006-06-15 |
Family
ID=36628239
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004340877A Withdrawn JP2006149230A (ja) | 2004-11-25 | 2004-11-25 | 糖化タンパク質割合の測定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2006149230A (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008059874A1 (fr) * | 2006-11-16 | 2008-05-22 | Amano Enzyme Inc. | Nouvelle enzyme digestant les dipeptides, son procédé de préparation, procédé de dosage des protéines glyquées utilisant l'enzyme digestant les dipeptides et composition de réactif destinée à être utilisée dans ce procédé |
JP2011043396A (ja) * | 2009-08-21 | 2011-03-03 | Toyama Prefecture | 生体試料中のl−リジンの定量法 |
JP2013165708A (ja) * | 2012-01-20 | 2013-08-29 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | 糖化タンパク質及びタンパク質の測定方法 |
WO2018021098A1 (ja) * | 2016-07-28 | 2018-02-01 | 旭化成ファーマ株式会社 | 糖化アルブミンの測定方法 |
-
2004
- 2004-11-25 JP JP2004340877A patent/JP2006149230A/ja not_active Withdrawn
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008059874A1 (fr) * | 2006-11-16 | 2008-05-22 | Amano Enzyme Inc. | Nouvelle enzyme digestant les dipeptides, son procédé de préparation, procédé de dosage des protéines glyquées utilisant l'enzyme digestant les dipeptides et composition de réactif destinée à être utilisée dans ce procédé |
JP2011043396A (ja) * | 2009-08-21 | 2011-03-03 | Toyama Prefecture | 生体試料中のl−リジンの定量法 |
JP2013165708A (ja) * | 2012-01-20 | 2013-08-29 | Sanwa Kagaku Kenkyusho Co Ltd | 糖化タンパク質及びタンパク質の測定方法 |
WO2018021098A1 (ja) * | 2016-07-28 | 2018-02-01 | 旭化成ファーマ株式会社 | 糖化アルブミンの測定方法 |
KR20190017979A (ko) * | 2016-07-28 | 2019-02-20 | 아사히 가세이 파마 가부시키가이샤 | 당화알부민의 측정 방법 |
CN109477839A (zh) * | 2016-07-28 | 2019-03-15 | 旭化成制药株式会社 | 糖化白蛋白的测定方法 |
JPWO2018021098A1 (ja) * | 2016-07-28 | 2019-04-11 | 旭化成ファーマ株式会社 | 糖化アルブミンの測定方法 |
KR102194577B1 (ko) | 2016-07-28 | 2020-12-23 | 아사히 가세이 파마 가부시키가이샤 | 당화알부민의 측정 방법 |
CN109477839B (zh) * | 2016-07-28 | 2022-06-14 | 旭化成制药株式会社 | 糖化白蛋白的测定方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5222331B2 (ja) | 糖化アミンを測定するための試料の前処理方法および糖化アミンの測定方法 | |
US6352835B1 (en) | Method of measuring substance in sample using a redox reaction | |
EP0823943B1 (en) | Determination of glycated proteins | |
JP2008245657A (ja) | 糖化ヘモグロビンの選択的測定方法 | |
US8026078B2 (en) | Method of quantifying glycosylated protein using redox reaction and quantification kit | |
US20040063213A1 (en) | Assay method with the use of redox reaction | |
US7354732B2 (en) | Method of assay with sulfonic acid compound and nitro compound | |
EP1878801A1 (en) | Protein cleavage method and use thereof | |
JP2000333696A (ja) | 糖化アミンの測定方法 | |
JP2006149230A (ja) | 糖化タンパク質割合の測定方法 | |
US8637275B2 (en) | Postprandial hyperglycemia marker, method of measuring the same, and usage thereof | |
US8021855B2 (en) | Method of decomposing protein with sulfonic acid compound | |
JP4756116B2 (ja) | 糖化アミンを測定するための試料の前処理方法および糖化アミンの測定方法 | |
US7432072B2 (en) | Method of preventing wrong color formation of n-(carboxymethylaminocarbony)-4,4′-bis(dimethylamino) diphenylamine sodium, reagent solution for the method, and measurement method employing the method | |
JP2007147630A (ja) | スルホン酸化合物およびニトロ化合物を用いた測定方法 | |
KR910005633B1 (ko) | Ldh₁의 분석법 | |
JP2004344052A (ja) | ヘモグロビンA1c測定用プロテアーゼ | |
JP4260542B2 (ja) | 高分子中のケトアミンの測定方法 | |
JP3934498B2 (ja) | プロテアーゼ含有試薬を用いた定量方法および定量試薬 | |
US20070031910A1 (en) | Method of stabilizing sample | |
JP4565807B2 (ja) | 糖化タンパク質測定用プロテアーゼ | |
US20040209378A1 (en) | Method for measurement using sodium azide |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080205 |