CN109490296A - 一种脂肪酶检测试剂盒及生产工艺 - Google Patents

一种脂肪酶检测试剂盒及生产工艺 Download PDF

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Abstract

本发明的一种脂肪酶检测试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，试剂R1包括如下成分：试剂R2包括如下成分：该脂肪酶检测试剂盒即开即用，无需配制，并且长期存放的稳定性较好。本发明还提出一种脂肪酶检测试剂盒的生产工艺。

Description

一种脂肪酶检测试剂盒及生产工艺
技术领域
本发明涉及一种脂肪酶检测试剂盒，属于诊断试剂盒技术领域。
背景技术
脂肪酶(Lipase,LPS)是一组特异性较低的脂肪水解酶类，主要来源于胰腺，其次为胃及小肠，能水解多种含长链脂肪酸的甘油酯。通常胰腺以等量分泌脂肪酶及共脂肪酶进入循环，但因共脂肪酶相对分子量较小，可以从肾小球滤出，急性胰腺炎时，共脂肪酶/脂肪酶比例下降。
血清LPS活性的测定是急性胰腺炎诊断的重要指标。急性胰腺炎时，血清淀粉酶增加的时间较短，而血清LPS活性上升可持续10-15天。另外，慢性胰腺炎、结石致胰腺管阻塞、肝脏疾病、手术或慢性肾脏病都会导致脂肪酶活性的增高。目前临床上常用的测定方法有滴定法、电极法、比浊法、分光光度计法及荧光光度计法。
现有的几种技术中对于血清LPS活性的测定需要比较复杂的配液过程，并且存放时间受环境条件影响较大，长期存放的稳定性差。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明提出一种脂肪酶检测试剂盒，其能即开即用，无需配制，并且长期存放的稳定性较好。
为实现上述目的，本发明的一种脂肪酶检测试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其中：
试剂R1包括如下成分：
试剂R2包括如下成分：
进一步地，试剂R1包括如下成分：
试剂R2包括如下成分：
进一步地，在试剂R1中，表面活性剂包括聚氧乙烯硬化蓖麻油、烯烃马来酐聚合物，聚氧乙烯硬化蓖麻油、烯烃马来酐聚合物的质量比为1:1。
进一步地，在试剂R2中，蛋白质变性剂采用脲。
进一步地，在试剂R1中，酶反应加速剂包括氯化钠、氯化钙，氯化钠的含量为1.2g/L，氯化钙的含量为1.110g/L，在试剂R2中，酶反应加速剂包括氯化钙。
进一步地，试剂R1中缓冲液采用N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲液。
进一步地，试剂R2中的缓冲液采用酒石酸钾钠缓冲液。
进一步地，试剂R1与试剂R2的体积比为2:1。
本发明检验血清脂肪酶的原理是：1,2-邻-二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸(6’-甲基试卤灵)酯在脂肪酶的作用下水解生成1,2-邻-二月桂基-消旋-甘油和戊二酸(6’-甲基试卤灵)酯。其中戊二酸(6’-甲基试卤灵)酯在脂肪酶的进一步作用下水解生成戊二酸和甲基试卤灵，甲基试卤灵在溶液中呈现出红色。在波长570nm处检测红色的甲基试卤灵生成速率，该生成速率和样本中的脂肪酶活性成正比，通过计算得出样品中的脂肪酶活性。
N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲液、酒石酸钾钠缓冲液是性质稳定的生物缓冲剂，为酶促反应提供稳定的、适宜的PH环境。当试剂储存时，为试剂提供一个良好的储存环境，保证试剂的有效储存，有助于延长试剂的存放期限。
氯化钙、氯化钠是本发明中的酶反应加速剂，可以激活酶的活性，并且提供反应所需的离子环境，同时能够增加试剂中盐离子效应。此外，Ca2+是脂肪酶的活化剂，可增加脂肪酶的活性。
聚氧乙烯硬化蓖麻油是一种非离子型表面活性剂，具有较强的乳化作用，提高各种原料的增融性和稳定性。烯烃马来酐聚合物能够与阴离子和非离子表面活性剂复配，具有优良扩散性提高试剂的稳定性。这两种表面活性剂单一加入时，可以提高共脂肪酶的稳定性。两种表面活性剂同时混合复配，产生协同增效作用，试剂的开瓶稳定性和长期存储稳定性较好。
去氧胆酸钠、牛黄脱氧胆酸钠，在反应中起稳定剂和加速剂的作用，加速脂酶反应，保证反应的高效进行。此外，胆酸盐附着于底物-水的界面，和辅脂酶形成聚合物，使辅脂酶的结构改变，并打开脂肪酶高亲和力的特异结合位点，从而形成脂肪酶-辅脂酶-胆酸盐聚合物，固定在底物表面，以促进发挥脂肪酶的脂解作用。
共脂肪酶是反应中所需要的反应的催化酶。
叠氮化钠作为防腐剂，作用是防止溶液中微生物生长，保持试剂的稳定性
脲是蛋白变性剂，去除杂蛋白对底物的影响，增强试剂的稳定性，并且有利于提升测试结果的准确度。
1,2-邻-二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸(6’-甲基试卤灵)酯是6’-甲基试卤灵反应底物，主要是用来生成甲基试卤灵，是比色法中的色原。
本发明还提出一种脂肪酶检测试剂盒的生产工艺，包括以下步骤：
S1：对试剂R1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；
S2：对试剂R2各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；
S3：半成品检验；
S4：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1和试剂R2；
S5：包装，成品检验，入库存储。
进一步地，步骤S1、步骤S2和步骤S4均在十万级净化车间内进行。
本发明的一种脂肪酶检测试剂盒，其能实现即开即用，无需配制，并且长期存放的稳定性较好。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步描写和阐述。
图1是本发明首选实施方式的脂肪酶检测试剂盒的测定值与理论值的线性范围示意图；
图2是本发明首选实施方式的脂肪酶检测试剂盒的测定值与理论值的样本相关性示意图。
具体实施方式
下面将结合附图、通过对本发明的优选实施方式的描述，更加清楚、完整地阐述本发明的技术方案。
实施例1：脂肪酶检测试剂盒的生产，包括以下步骤：
S1：对试剂R1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S2：对试剂R2各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S3：半成品检验；
S4：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1和试剂R2；
S5：包装，成品检验，入库存储。
其中步骤S1、步骤S2和步骤S4均在十万级净化车间内进行。
实施例2：脂肪酶检测试剂盒的生产，包括以下步骤：
S1：对试剂R1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S2：对试剂R2各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S3：半成品检验；
S4：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1和试剂R2；
S5：包装，成品检验，入库存储。
其中步骤S1、步骤S2和步骤S4均在十万级净化车间内进行。
实施例3：脂肪酶检测试剂盒的生产，包括以下步骤：
S1：对试剂R1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S2：对试剂R2各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S3：半成品检验；
S4：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1和试剂R2；
S5：包装，成品检验，入库存储。
其中步骤S1、步骤S2和步骤S4均在十万级净化车间内进行。
实施例4：脂肪酶检测试剂盒的生产，包括以下步骤：
S1：对试剂R1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S2：对试剂R2各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S3：半成品检验；
S4：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1和试剂R2；
S5：包装，成品检验，入库存储。
其中步骤S1、步骤S2和步骤S4均在十万级净化车间内进行。
实施例5：脂肪酶检测试剂盒的生产，包括以下步骤：
S1：对试剂R1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S2：对试剂R2各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：
S3：半成品检验；
S4：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1和试剂R2；
S5：包装，成品检验，入库存储。
其中步骤S1、步骤S2和步骤S4均在十万级净化车间内进行。
对比例1：一种脂肪酶检测试剂盒，与实施例1的区别在于，试剂R1中未添加聚氧乙烯硬化蓖麻油和烯烃马来酐聚合物。
对比例2：一种脂肪酶检测试剂盒，与实施例1的区别在于，试剂R1中未添加聚氧乙烯硬化蓖麻油。
对比例3：一种脂肪酶检测试剂盒，与实施例1的区别在于，试剂R1中未添加烯烃马来酐聚合物。
本发明的脂肪酶检测试剂盒适用且不限于日立7060、日立7080、日立7170、日立7600、日立7180、东芝400、岛津8000、罗氏P800、雅培2000、贝克曼CX、贝克曼DX、贝克曼LX、奥林巴斯400、奥林巴斯640、奥林巴斯2700、奥林巴斯5400等全自动生化分析仪。
本发明的脂肪酶检测试剂盒检测脂肪酶活性的测定方法如下：
全自动生化分析仪的主波长设置为570nm，副波长设置为700nm，采用速率法。加入样本、校准液或质控品3μl，之后再加入试剂R1 200μl混匀，于37℃孵育3min～5min后加入100μl的试剂R2混匀，于37℃孵育100s，在测定波长下连续检测120s各管吸光度变化，计算各管ΔA/min。
根据公式：LPS(U/L)＝标准品活性×ΔA/min样品/ΔA/min标准品，计算样品中的脂肪酶活性。
本发明的一种脂肪酶检测试剂盒性能测试如下：
试验中采用的校准液和质控品均采用朗道公司的产品，校准方法采用校准液两点定标线性处理，定标数据如表1。
表1：定标数据(单位U/L)：
浓度 0 79
OD1 66 232
OD2 48 230
OD均值 57 231
试验1：线性范围
取临床高值标本，将高值标本按0、1/8、1/4、2/4、3/4、1的稀释比例稀释，每个样品测3次，取平均值数据记录如表2。根据图1可见，本发明试剂盒的最高检测范围可达456U/L，判定依据R2≥0.990。
表2：线性范围验证结果(单位：U/L)：
稀释比例 LPS理论值 LPS实测均值
0 0 1.4
1/8 57 58.6
1/4 114 111.6
1/2 228 231.2
3/4 342 339.8
1 456 448.3
试验2：精密度试验
1、批内精密度
取一个低值的LPS样品和一个高值LPS样品各20次，测定本发明试剂盒的批内精密度，试验结果见表3。
表3：批内精密度试验结果(单位：U/L)
2、批间精密度
使用实施例1、实施例2和实施例3制得的脂肪酶检测试剂盒分别测定同一人的血清样品20次，数据记录如表4。
表4：批间精密度试验结果(单位：U/L)
试验3：稳定性试验
1、开瓶稳定性
将本发明试剂盒试剂开口放置2-8℃冰箱内，取2只高低值标本，分装放置-20℃保存，每10天取高低值各1只检测3次，取平均值记录如表5。
表5：开瓶稳定性试验结果(单位：U/L)
2、效期稳定性
将本发明试剂盒放置2-8℃，取2只高低值标本，分装放置-20℃保存，每3个月取高低值各1只检测3次，取平均值记录如表6。
表6：效期稳定性试验结果(单位：U/L)
试验4：样品相关性试验
取40例标本，标本浓度范围分布为低、中、高全覆盖，检测三次取平均值，记录如表7。
表7：样品相关性试验结果(单位：U/L)
综上所述，本发明的一种脂肪酶检测试剂盒，其能即开即用，无需配制，并且长期存放的稳定性较好。
上述具体实施方式仅仅对本发明的优选实施方式进行描述，而并非对本发明的保护范围进行限定。在不脱离本发明设计构思和精神范畴的前提下，本领域的普通技术人员根据本发明所提供的文字描述、附图对本发明的技术方案所作出的各种变形、替代和改进，均应属于本发明的保护范畴。本发明的保护范围由权利要求确定。

Claims (10)

1.一种脂肪酶检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，其中：
试剂R1包括如下成分：
试剂R2包括如下成分：
2.如权利要求1所述的一种脂肪酶检测试剂盒，其特征在于，
试剂R1包括如下成分：
试剂R2包括如下成分：
3.如权利要求1所述的一种脂肪酶检测试剂盒，其特征在于，在试剂R1中，所述表面活性剂包括聚氧乙烯硬化蓖麻油、烯烃马来酐聚合物，所述聚氧乙烯硬化蓖麻油、烯烃马来酐聚合物的质量比为1:1。
4.如权利要求1所述的一种脂肪酶检测试剂盒，其特征在于，在试剂R2中，所述蛋白质变性剂采用脲。
5.如权利要求1所述的一种脂肪酶检测试剂盒，其特征在于，在试剂R1中，所述酶反应加速剂包括氯化钠、氯化钙，所述氯化钠的含量为1.2g/L，所述氯化钙的含量为1.110g/L，在试剂R2中，所述酶反应加速剂包括氯化钙。
6.如权利要求1所述的一种脂肪酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中缓冲液采用N,N-二羟乙基甘氨酸缓冲液。
7.如权利要求1所述的一种脂肪酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的缓冲液采用酒石酸钾钠缓冲液。
8.如权利要求1所述的一种脂肪酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1与试剂R2的体积比为2:1。
9.一种用于生产权利要求1-8任意项所述脂肪酶检测试剂盒的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1：对试剂R1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；
S2：对试剂R2各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；
S3：半成品检验；
S4：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂R1和试剂R2；
S5：包装，成品检验，入库存储。
10.如权利要求9所述的一种脂肪酶检测试剂盒的生产工艺，其特征在于，所述步骤S1、步骤S2和步骤S4均在十万级净化车间内进行。
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