CN104745673A

CN104745673A - 一种稳定的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒

Info

Publication number: CN104745673A
Application number: CN201510205932.4A
Authority: CN
Inventors: 甘宜梧; 董雯; 谭柏清; 王�琦; 王春艳; 肖慧
Original assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Current assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Priority date: 2015-04-28
Filing date: 2015-04-28
Publication date: 2015-07-01

Abstract

本发明公开了一种5'-核糖核苷酸磷酸水解酶比色法检测试剂盒，属于临床体外检测试剂技术领域。本发明试剂盒包括试剂R1、试剂R2。通过在试剂组分1中加入了由4-FPBA、NaCl、甘露醇、曲拉通100、BSA五种成分组成的复合稳定剂，解决了酶长期保存不稳定这一难题，在试验中它能增加酶的稳定时间，而不会影响酶的活性，从而有效地增强了试剂盒的稳定性，却不会对试剂的准确度和分析灵敏度产生影响，有利于该试剂在市场中进一步的推广。

Description

一种稳定的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒

技术领域

本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒。

背景技术

5'-核苷酸酶全称5'-核糖核苷酸磷酸水解酶（5'-Nucleoticlase, 5'-NU或5'-NT），广泛分布在肝、胆、胰、肠、心、脑、肺、肾、垂体、甲状腺、前列腺、睾丸等脏器和组织中，定位在细胞膜上，在肝内主要存在于胆小管和窦状间隙内。

正常人血清中5'-核糖核苷酸磷酸水解酶参考值范围是0-10U/L，在5’-次黄嘌呤核苷酸分解代谢过程中起到很重要的催化作用，可催化5’-次黄嘌呤核苷酸降解为次黄嘌呤核苷，之后再经核苷酸磷化酶催化生成次黄嘌呤，最终氧化为代谢产物尿酸。

5'-NT活性增高常见于原发性和转移性肝癌、胆道癌、胰腺癌、胆道阻塞、胆管炎、急、慢性肝炎、肝硬化、药物性肝损伤。其活性增高可达2～6倍，且与病情严重程度呈正相关。

5'-NT是诊断肝肿瘤非常灵敏的酶学指标，在病变早期，当肝功能、肝扫描和有关肝病检查阴性时本酶活性已明显增高。对于AFP阴性病例，其与AFP互补诊断肝癌的阳性率可达94％。

特异性高，能协助判断碱性磷酸酶（ALP）增高是肝胆系统疾病还是骨髓系统疾病（如骨癌、骨肉瘤、骨转移癌、佝偻病等）。ALP在肝胆系统疾病和骨骼系统疾病时均可增高。5'-NT除肝胆系统疾病增高外，骨骼系统疾病一般均不升高。

有助于鉴别诊断肝细胞性黄疸和阻塞性黄疸。

由于5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒（比色法）中存在多种酶，会使该试剂的稳定性受到影响，不利于试剂的长期保存，从而造成浪费的不良后果。

发明内容

针对于常规的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒（比色法）存在的问题，，本发明提供了一种稳定性强的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒（比色法），该试剂盒与常规的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒（比色法）相比，稳定性比常规的检测试剂盒要好，而且准确度和分析灵敏度不受影响，有利于提高试剂的稳定性。

为实现上述目的，一种稳定性强的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒（比色法）组成为：甘氨酸缓冲液（Goods缓冲液）、4-氨基安替比林溶液、嘌呤核苷酸磷化酶（PNP）、黄嘌呤氧化酶（XOD）、过氧化物酶（POD）、4－甲酰苯基硼酸（4-FPBA）、氯化钠（NaCl）、甘露醇、曲拉通100、牛血清白蛋白（BSA）、5’-次黄嘌呤核苷酸、（EHSPT）。

一种稳定性强的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，应用时体积比为R1：R2=180:90。各组分的含量如下：

R1试剂组分：

Goods缓冲液（PH7.6） 100mmol/L

4-AA 2.3mmol/L

PNP 0.2U/mL

XOD 0.3U/mL

POD 0.5U/mL

4-FPBA 0.01%

NaCl 5mmol/L

甘露醇 5g/L

曲拉通100 1%

BSA 0.1-1g/L

R2试剂组分：

Goods缓冲液（PH7.6） 100mmol/L

5’-次黄嘌呤核苷酸 13mmol/L

EHSPT 4mmol/L 。

本发明所采用的技术方案是：

5’-NT催化底物中次黄嘌呤核苷酸反应产生次黄苷和磷酸，再经过一系列催化反应最终生成红色醌类。在波长550nm处检测其吸光度，其变化程度与样本中的5’-NT活性成正比。

本发明的有益效果：

本发明提供的稳定性强的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒（比色法），通过在组分1中加入了由4-FPBA、NaCl、甘露醇、曲拉通100、BSA五种成分组成的复合稳定剂，解决了酶长期保存不稳定这一难题，在试验中它能增加酶的稳定时间，而不会影响酶的活性，从而有效地增强了试剂盒的稳定性，却不会对试剂的准确度和分析灵敏度产生影响，有利于该试剂在市场中进一步的推广。

附图说明

图1 实施例2试剂检测数据与实施例1试剂检测数据结果对比。

图2实施例3试剂检测数据与实施例1试剂检测数据结果对比。

图3实施例4试剂检测数据与实施例1试剂检测数据结果对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步详细描述本发明。

实施例1：

本实施案例所描述的一种常规的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒，它包括试剂组分是由试剂R1和试剂R2组成的，组分含量如下：

实施例1：

试剂R1组分：

Goods缓冲液（PH7.6） 100mmol/L

4-AA 2.3mmol/L

PNP 0.2U/mL

XO 0.3U/mL

POD 0.5U/mL

试剂R2组分：

Goods缓冲液（PH7.6） 100mmol/L

5’-次黄嘌呤核苷酸 13mmol/L

EHSPT 4mmol/L

本实施例描述的一种常规的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒（比色法）使用方法是采用具有双试剂功能的自动生化分析仪，如东芝120自动分析仪，操作如表1。

表1一种 5’-核糖核苷酸磷酸水解酶检测试剂盒使用方法

实施例2：

本实施案例所描述的一种稳定的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒，它包括试剂组分是由试剂R1和试剂R2组成的，组分含量如下：

试剂R1组分：

Goods缓冲液（PH7.6） 100mmol/L

4-AA 2.3mmol/L

PNP 0.2U/mL

XOD 0.3U/mL

POD 0.5U/mL

4-FPBA 0.01%

NaCl 5mmol/L

甘露醇 5g/L

曲拉通100 1%

BSA 0.1g/L

试剂R2组分：

Goods缓冲液（PH7.6） 100mmol/L

5’-次黄嘌呤核苷酸 13mmol/L

EHSPT 4mmol/L 。

本实施例一种稳定的5’-核糖核苷酸磷酸水解酶检测试剂盒（比色法）使用方法同实施例1。

实施例3：

试剂R1组分：

Goods缓冲液（PH7.6） 100mmol/L

4-AA 2.3mmol/L

PNP 0.2U/mL

XOD 0.3U/mL

POD 0.5U/mL

4-FPBA 0.01%

NaCl 5mmol/L

甘露醇 5g/L

曲拉通100 1%

BSA 0.5g/L

试剂R2组分：

Goods缓冲液（PH7.6） 100mmol/L

5’-次黄嘌呤核苷酸 13mmol/L

EHSPT 4mmol/L 。

实施例4：

试剂R1组分：

Goods缓冲液（PH7.6） 100mmol/L

4-AA 2.3mmol/L

PNP 0.2U/mL

XOD 0.3U/mL

POD 0.5U/mL

4-FPBA 0.01%

NaCl 5mmol/L

甘露醇 5g/L

曲拉通100 1%

BSA 1g/L

试剂R2组分：

Goods缓冲液（PH7.6） 100mmol/L

5’-次黄嘌呤核苷酸 13mmol/L

EHSPT 4mmol/L 。

实施例5

准确度验证实验

应用实施例2、3、4的试剂盒与实施例1试剂盒进行对比，对40个样本进行检测，检测的结果见图1、图2、图3。

通过图1、图2、图3可知，实施例2、3、4检测试剂盒与实施例1检测试剂盒的检测结果相关性分别为0.9951、0.9985、0.9971，均大于要求的0.990，相关性比较好，表明本发明的试剂盒与常规的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒（比色法）有高度一致性，证明其准确性不受影响。

实施例6

线性相关性验证实验

找到5’-核糖核苷酸水解酶高值样本为300U/L，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为300U/L、240U/L、180U/L、120U/L、60U/L、0U/L浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。分别对实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如表2所示。

由表2可以看出，实施例1、2、3、4检测结果相关性均大于0.990，达到产品标准要求，说明在试剂中加入复合稳定剂不会降低试剂检测的线性相关性。

表2实施例1-4线性相关性验证实验检测结果

理论浓度（U/L）	实施例1检测结果（U/L）	实施例2检测结果（U/L）	实施例3检测结果（U/L）	实施例4检测结果（U/L）
					0	0.30	0.20	0.20	0.20
60	62.76	60.91	58.88	58.08
					120	119.83	121.59	113.17	125.67
180	183.30	177.29	175.12	174.89
					240	224.08	226.67	247.29	249.16
300	311.80	281.65	304.79	308.32
					相关系数r	0.9968	0.9993	0.9992	0.9991

实施例7

稳定性验证实验

在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂，测定实施例1、2、3、4等四种试剂的稳定性。四种试剂每月选取同一样本测定其吸光度三次，取平均值，与新鲜的市场常见的试剂检测结果进行对比，从而确定试剂的稳定时间，检测数据如表3所示。

由表3可知，实施例1的检测试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定，而实施例2、3、4试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存24个月稳定，说明在试剂中加入复合稳定剂能有效的提高5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂盒的稳定性。

表3实施例1-4稳定性验证实验数据结果

时间	实施例1试剂检测结果	实施例2试剂检测结果	实施例3试剂检测结果	实施例4试剂检测结果	新鲜的实施例1试剂检测结果
						12个月	0.0267	0.0282	0.0281	0.0276	0.0274
13个月	0.0228	0.0227	0.0216	0.0232	0.0223
						14个月	0.0246	0.0240	0.0244	0.0245	0.0244
15个月	0.0201	0.0208	0.0202	0.0208	0.0198
						16个月	0.0101	0.0151	0.0152	0.0151	0.0147
17个月	0.0144	0.0228	0.0224	0.0226	0.0229
						18个月	0.0036	0.0237	0.0254	0.0243	0.0243
19个月	0.0002	0.0203	0.0206	0.0204	0.0208
						20个月	0.0001	0.0205	0.0203	0.0207	0.0203
21个月	0.0000	0.0234	0.0241	0.0247	0.0247
						22个月	0.0000	0.0234	0.0234	0.0241	0.0233
23个月	0.0000	0.0273	0.0268	0.0267	0.0277
						24个月	0.0000	0.0278	0.0273	0.0281	0.0284
25个月	0.0000	0.0177	0.0173	0.0180	0.0274
						26个月	0.0000	0.0065	0.0052	0.0047	0.0268
27个月	0.0000	0.0005	0.0002	0.0007	0.0244

Claims

1.一种稳定的5'-核糖核苷酸水解酶比色法检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂R1和试剂R2，其中试剂R1组成为：100mmol/L pH 7.6甘氨酸缓冲液（Goods缓冲液）、2.3mmol/L 4-氨基安替比林溶液（4-AA）、0.2U/mL嘌呤核苷酸磷化酶（PNP）、0.3U/mL黄嘌呤氧化酶（XOD）、0.5U/mL过氧化物酶（POD）、0.01% 4－甲酰苯基硼酸（4-FPBA）、5mmol/L氯化钠（NaCl）、5g/L甘露醇、1%曲拉通100、0.1-1g/L牛血清白蛋白（BSA）；试剂R2组成为：100mmol/L pH 7.6 Goods缓冲液、13mmol/L 5’-次黄嘌呤核苷酸、4mmol/L EHSPT。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，采用具有双试剂功能的自动生化分析仪，如东芝120自动分析仪，操作如下：

使用的方法如下：

。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，通过在组分1中加入了由4-FPBA、NaCl、甘露醇、曲拉通100、BSA五种成分组成的复合稳定剂，解决了酶长期保存不稳定这一难题，在试验中它能增加酶的稳定时间，而不会影响酶的活性，从而有效地增强了试剂盒的稳定性，却不会对试剂的准确度和分析灵敏度产生影响，有利于该试剂在市场中进一步的推广。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2在使用时的体积比例为R1：R2=180：90。