CN106884034A

CN106884034A - 一种稳定、抗干扰能力强的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂及检测方法

Info

Publication number: CN106884034A
Application number: CN201510943601.0A
Authority: CN
Inventors: 甘宜梧; 史秀明; 谢清华; 谭柏清
Original assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Current assignee: Biobase Biodustry Shandong Co Ltd
Priority date: 2015-12-16
Filing date: 2015-12-16
Publication date: 2017-06-23

Abstract

本发明涉及5’-NT检测技术领域，特别涉及一种5’-NT检测试剂，试剂R1中含有缓冲液，β-甘油磷酸钠，MgCl2，Toos，防腐剂；试剂R2中含有缓冲液，5’-IMP，EHSPT，PNP，XOD，POD，抗坏血酸氧化酶，4-AA，防腐剂。采用磷酸盐缓冲液，添加稳定剂β-甘油磷酸钠、抗坏血酸氧化酶，大大增强了试剂的稳定性；不仅显著改善测定的性能，而且增强了试剂的稳定性和抗干扰能力。

Description

一种稳定、抗干扰能力强的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂及检测方法

技术领域

本发明涉及5’-核糖核苷酸水解酶检测技术领域，特别涉及一种抗干扰能力强的5’-核糖核苷酸水解酶检测试剂，还涉及使用此检测试剂的检测方法。

背景技术

5’-核苷酸酶全称5’-核糖核苷酸磷酸水解酶（5’-Nucleoticlase或5’-NT），广泛分布在肝、胆、胰、肠、心、脑、肺、肾、垂体、甲状腺、前列腺、睾丸等脏器和组织中，定位在细胞膜上，在肝内主要存在于胆小管和窦状间隙内，是一种催化核苷5’-单磷酸水解生成核苷和无机磷酸盐的酶，最适pH为6.6-7.0，受Mg² ^＋或Mn² ^＋激活，为Ni² ^＋所抑制。众多研究资料表明，血清5’-NT活性升高主要见于肝胆胰系统疾病及某些恶性肿瘤，故有较特异的诊断价值。胆管结石或肿瘤所致之肝外胆管阻塞，以及氯丙嗪、肝癌或肝硬变引起肝内胆汁郁积时，病人血清5’-NT活性可升高2-6倍。原发性或继发性肝硬变时，病人血5’-NT升高较在慢性活动型肝炎时敏感。肝细胞损伤发生肝昏迷时，病人血清5’-NT活性多呈正常。原发性或继发性肝癌患者此酶活性升高的阳性率为88.4％-97.2％。急性胰腺炎病人血清5’-NT略有升高，慢性胰腺炎时血清酶活性正常。发生肝继发癌灶的胰体或胰尾癌病人血清酶活性明显升高，以肝内有继发病灶的胰头癌病人，血清5’-NT活性升高最为显著。原发性乳腺癌患者约有65％血清5’-NT活性升高，在发生全血性广泛转移的病人血清5’-NT活性全部升高。测定血液、体液中的5’-NT及其同工酶水平对某些疾病的诊断、鉴别诊断、治疗及免疫功能的研究越来越受到临床的重视。

目前，文献报道的5’-NT活性的测定方法有钼酸铵反应法、氨量测定法、化学发光法、NADPH测定法、尿素生成法等。这些方法准确性差、灵敏度低、仪器设备要求高、试剂成本高，难于全面推广应用。

鉴于此，本发明在5’-NT催化次黄嘌呤核苷酸水解生成氨和次黄嘌呤核苷反应的基础上，再依次偶联三个酶促反应，建立了一种既能用于手工操作，又能用于自动生化分析仪的四酶偶联测定5’-NT活性的新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测5’-NT的试剂及使用该试剂检测5’-NT含量的方法。该试剂盒采用四酶偶联法，可以有效检测5’-NT的含量，抗干扰能力强，稳定性好等优点。

基本原理：次黄嘌呤核苷酸在5’-NT作用下，生成次黄嘌呤核苷和磷酸，

5’-NT

次黄嘌呤核苷酸+ H2O 次黄嘌呤核苷 + 磷酸

次黄嘌呤核苷在嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）催化下，与磷反应生成次黄嘌呤和核糖1-磷酸

PNP

次黄嘌呤核苷+Pi 次黄嘌呤+核糖1-磷酸

次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶（XOD）催化氧化生成尿酸和H₂O₂：

XOD

次黄嘌呤+ 2H2O+O2 尿酸+2H2O2

再偶联由过氧化物酶催化的反应

POD

2H2O2 + 4-AA + EHSPT 4 H2O+醌染料

通过测定红色醌化合物在550nm处吸光度的变化速率（ΔA/min）可测得5’-NT活性。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种5’-NT检酸测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：

1）试剂R1的组分为：

缓冲液_{··········································································}100mmol/L

β-甘油磷酸钠_{····························································}6g/L

MgCl₂ _{··········································································}10g/L

Toos_{·············································································}0.5g/L

防腐剂_{·········································································}0.5g/L；

2）试剂R2的组分为：

缓冲液_{········································································}100mmol/L

5’-IMP_{·········································································}11mmol/L

PNP_{·············································································}0.3U/mL

XOD_{···········································································}0.4U/mL

POD_{············································································}0.1U/mL

抗坏血酸氧化酶_{························································}2.7U/mL

EHSPT _{····································································}4mmol/L

4-AA_{·············································································}4mmol/L；

以上试剂均用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液。

以上5’-NT检测试剂，所述防腐剂为NaN3。

注：EHSPT：N-乙基 -N-(2-羟基-3 硫代丙基)-3-甲基苯胺 4-AA：4-氨基氨替吡啉 POD：过氧化物酶。

所述的5’-NT检测试剂来检测5’-NT的检测方法，使用全自动生化分析仪利用速率法进行测定，检测主波长为550nm。

所述的检测方法，R1试剂和R2试剂的比例为2:1。

本发明的有益效果：

1）采用新的缓冲体系和稳定剂，显著改善了试剂的稳定性；

2）采用四酶偶联法，不仅显著改善测定的性能，而且增强了抗干扰能力，适宜批量试样全自动分析；

3）试剂的准确度和稳定性良好，使用方便，完全可以满足临床需要。

附图说明

图1为两种试剂的相关性曲线图，

图2为两种试剂效期稳定性曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例 1

5’-NT的检测试剂，包试剂R1和试剂R2：

1）试剂R1的组分为：

β-甘油磷酸钠_{····························································}12g/L

MgCl₂ _{··········································································}20g/L

2）试剂R2的组分为：

EHSPT _{·······································································}4mmol/L

3）本实施例试剂的使用方法：

本实施例描述的5’-NT检测试剂，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用速率法进行测定。将R1和R2按照2:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1：

表1 实施例1试剂检测方法

计算： 5 ’ -NT 含量（ U/L ）＝（ ∆A 测定÷ ∆A 标准）× C 标准。

实施例 2

干扰性试验：取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求。然后分别用实施例1所得试剂，与市场常见并认可的5’-NT试剂同时对比测定血清中5’-NT的含量，对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。相对偏差（%）=（干扰样本的测定均值-对照样本的测定均值）/对照样本的测定均值×100%。

由表2可以看出，实施例1试剂在抗坏血酸≤1704μmol/L、胆红素≤684μmol/L、血红蛋白≤10 g/L、甘油三酯≤22.6 mmol/L对测试结果没有明显干扰。而对照组试剂在上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，这说明实施例1试剂的抗干扰性能远远优于对比试剂。

表 2 实施例 1 试剂抗干扰性能比较

实施例 3

相关性实验：利用实施例1配方配制试剂，与市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的5’-NT试剂盒进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表3所示。并获得了两种试剂的相关性曲线（如图1所示），通过检测结果显示，两个试剂盒的相关系数为0.9929，说明了两者有极大的相关性。

表 3 实施例 1 试剂与市场常见并得到认可的 5 ’ -NT 测定试剂盒对比检测结果

实施例 4

试剂的稳定性对比试验：对实施例1中的试剂，均匀分装13组，每组的试剂量为R1为20mL，R2为10mL；并且取13组市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的5’-NT试剂盒作对照。放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天取出一组试剂检测5’-NT质控品，检测结果如图2所示，实施例1试剂在2-8℃储存条件下比市场常见的5’-NT测定试剂盒更加稳定。

通过验证，本试剂与同类检测试剂对比相关性好，临床检测样本结果一致，能够达到市场对产品的应用要求，并且抗干扰性能好，是一种更加稳定、良好的5’-NT检测试剂。

Claims

1. 一种5’-NT检测试剂，其特征在于包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：

1）试剂R1的组分为：

2）试剂R2的组分为：

EHSPT_{······································································}4mmol/L

4-AA_{········································································}4mmol/L。

2.根据权利要求1所述的5’-NT检测试剂，其特征在于试剂R1中缓冲液为25℃，pH为7.4的磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求1所述的5’-NT检测试剂，其特征在于试剂R2中缓冲液为25℃，pH为7.4的磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1所述的5’-NT检测试剂，其特征在于所述防腐剂为NaN₃。

5.一种使用权利要求1-4中任一项所述的腺苷脱氨酶检测试剂来检测5’-NT的检测方法，其特征在于使用全自动生化分析仪利用速率法进行测定，检测主波长为550nm。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于R1试剂和R2试剂的比例为2:1。