CN104764703A - 一种测定次黄苷与次黄苷-5′-单磷酸钠相对含量的方法 - Google Patents
一种测定次黄苷与次黄苷-5′-单磷酸钠相对含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种测定次黄苷与次黄苷-5'-单磷酸钠相对含量的方法，利用由嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶组成的酶偶联体系将次黄苷-5'-单磷酸钠样品中的次黄苷转化为紫红色醌衍生物并测定特定波长下溶液吸光度值A1、加入含5'-核苷酸酶的缓冲液后继续反应一段时间后测定吸光度值A2、利用A1值和A2值计算出黄苷-5'-单磷酸钠底物中次黄苷与黄苷-5'-单磷酸钠相对含量，绿色、环保，无需校准品对照即可计算出次黄苷与黄苷-5'-单磷酸钠的相对含量，并且用普通的可见分光光度计就可以实现检测，灵敏度高，线性、精密度好，结果准确，且操作简便快速，并可用于各种类型的分析仪，达到大规模测定样本的要求。
Description
技术领域
本发明属于生物化学检测技术领域，具体涉及一种测定次黄苷与次黄苷-5'-单磷酸钠相对含量的方法。
背景技术
次黄苷-5'-单磷酸钠是酶化学法测定5'-核苷酸酶(5'-NT)的底物，以次黄苷-5'-单磷酸钠为主要原料之一的液体型5'-NT测定试剂具有稳定、抗干扰能力好、能实现自动化分析等特点，在临床得以广泛应用。次黄苷-5'-单磷酸钠在-20℃保存时具有良好的稳定性，受潮、受热后易分解产生次黄苷，次黄苷-5'-单磷酸钠中次黄苷与次黄苷-5'-单磷酸钠相对含量的高低显著影响5'-NT测定试剂的灵敏度与空白吸光度值，是控制5'-NT测定试剂批间差不可忽视的实验因素之一。
目前实验室测定次黄苷-5’-单磷酸钠样品中次黄苷与次黄苷-5'-单磷酸钠相对含量时均采用高效液相色谱(HPLC)法，该法需要专用大型仪器，需要标准品做对照，检测费时，检测时还需要使用有毒溶剂甲醇，易造成环境污染。
因此，寻求一种操作简便、灵敏度高、结果准确的方法，对次黄苷-5'-单磷酸钠样品中次黄苷与次黄苷-5'-单磷酸钠相对含量进行检测就显得尤为重要。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种测定次黄苷与次黄苷-5'- 单磷酸钠相对含量的方法,利用由嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、黄嘌呤氧化酶(XTO)、过氧化物酶(POD)组成的酶偶联体系将次黄苷-5'-单磷酸钠样品中的次黄苷转化为紫红色醌衍生物并测定特定波长下溶液吸光度值A1、加入含5'-核苷酸酶的缓冲液后继续反应一段时间后测定吸光度值A2、利用A1值和A2值计算出黄苷-5'-单磷酸钠底物中次黄苷与黄苷-5'-单磷酸钠相对含量。该法绿色、环保，无需校准品对照即可计算出次黄苷与黄苷-5'-单磷酸钠的相对含量，并且用普通的可见分光光度计就可以实现检测。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种测定次黄苷与次黄苷-5'-单磷酸钠相对含量的方法，包括如下步骤：
步骤1、配制含有MgCl2、PNP、XTO、POD、4-AAP、TOOS、乙二醇、、蔗糖的pH 7.4-7.8磷酸氢二钾-磷酸二氢钾(K2HPO4-KH2PO4)缓冲液，得试剂A；
步骤2、往步骤1所得的试剂A中加入含次黄苷和次黄苷-5'-单磷酸钠的待测样品，在37℃环境中，反应3.5-5min，直至样品中的次黄苷被转化为紫红色醌衍生物后，测定540-560nm波长下的吸光度A1；
步骤3、配制含5'-NT、乙二醇、蔗糖的pH 7.4-7.8K2HPO4-KH2PO4缓冲液，得试剂B；
步骤4、将步骤3所得的试剂B加入到步骤2所得溶液中，在37℃环境中，继续反应5-10min，直至样品中的次黄苷-5'-单磷酸钠被转化为紫红色醌衍生物后，测定540-560nm波长下的吸光度A2；
步骤5、通过以下公式计算出次黄苷与次黄苷-5’-单磷酸钠的相对含量：
样品液中次黄苷/次黄苷-5'-单磷酸钠(％)＝(A1-A0)×100％/(A2-A1×V1/V2)，
式中，A0为同体积的去离子水代替样品与试剂A反应所测得的吸光度值，A1为样品与试剂A反应所测得的吸光度值，A2为样品与试剂A反应后继续与试剂B反应所测得的吸光度值，V1为样品液和试剂A混合后的反应体积，V2为样品液与试剂A、试剂B混合后的总反应体积
作为优选，所述的步骤1中pH 7.4-7.8K2HPO4-KH2PO4缓冲液中K2HPO4-KH2PO4浓度为10-30mmol/L、MgCl2浓度为20-50mmol/L、PNP浓度为2-20KU/L、XTO浓度为5-30KU/L、POD的浓度为10-50KU/L、4-AAP的浓度为0.2-5mmol/L、TOOS的浓度为0.5-10mmol/L、乙二醇浓度为10-100ml/L、蔗糖浓度为5-50g/L。
作为优选，所述的步骤3中pH 7.4-7.8K2HPO4-KH2PO4缓冲液中K2HPO4-KH2PO4浓度为10-30mmol/L、5'-NT浓度为20-200KU/L、乙二醇浓度为10-100ml/L、蔗糖浓度为5-50g/L。
本发明具有以下有益效果：
灵敏度高，线性、精密度好，结果准确，且操作简便快速，并可用于各种类型的分析仪，达到大规模测定样本的要求。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
精确称取0.1克左右样品，用去离子水定容至样品终浓度为0.1g/L的样品液；配制含有MgCl2 20mmol/L、PNP浓度为2KU/L、XTO浓度5KU/L、POD浓度为10KU/L、4-AAP浓度为0.2mmol/L、TOOS 浓度为0.5mmol/L、乙二醇浓度为10ml/L、蔗糖浓度为5g/L的10mmol/L pH7.4 K2HPO4-KH2PO4缓冲液为试剂A；配制含有5’-NT浓度为20KU/L、乙二醇浓度为10ml/L、蔗糖浓度为5g/L的10mmol/L pH 7.4 K2HPO4-KH2PO4缓冲液为试剂B。将试剂A和试剂B用于测定样品液时，采用的仪器为奥林巴斯2700全自动生化分析仪，测定方法类型为终点法，温度为37℃，V样品为3μl，V1为300μl，V2为100μl，测定主/副波长为540/800nm，试剂A加入样本后在测定温度反应3.5分钟后读取吸光度A1，继续加入试剂B反应5分钟后读取吸光度A2。样品液中次黄苷与次黄苷-5’-单磷酸钠相对含量的计算公式为：样品液中次黄苷/次黄苷-5'-单磷酸钠(％)＝(A1-A0)×100％/(A2-A1×V1/V2)，其中A0为同体积的去离子水代替样品与试剂A反应所测得的吸光度值，A1为样品与试剂A反应所测得的吸光度值，A2为样品与试剂A反应后继续与试剂B反应所测得的吸光度值，V1为样品液和试剂A混合后的反应体积，V2为样品液和试剂A、试剂B混合后的总反应体积。用本法和HPLC法同时测定了11例样品液中次黄苷与次黄苷-5'-单磷酸钠相对含量。
表1为本实施例所述方法测定的结果与HPLC法测定测定结果对照表。
从表1可知，本实施例所述方法与HPLC法的相关系数r为0.9996，两者显示了极好的相关性。
实施例2
精确称取0.1克左右样品，用去离子水定容至样品终浓度为2.5g/L的样品液；配制含有MgCl2 35mmol/L、PNP浓度为10KU/L、XTO浓度20KU/L、POD浓度为30KU/L、4-AAP浓度为2.5mmol/L、TOOS浓度为5mmol/L、乙二醇浓度为50ml/L、蔗糖浓度为25g/L的20mmol/L pH 7.6 K2HPO4-KH2PO4缓冲液为试剂A；配制含有5’-NT浓度为100KU/L、乙二醇浓度为50ml/L、蔗糖浓度为25g/L的20mmol/L pH 7.6 K2HPO4-KH2PO4缓冲液为试剂B。将试剂A和试剂B用于测定样品液时，采用的仪器为日立7080全自动生化分析仪，测定方法类型为终点法，温度为37℃，V样品为3μl，V1为300μl，V2为100μl，测定主/副波长为546/800nm，试剂A加入样本后在测定温度反应5分钟后读取吸光度A1，继续加入试剂B反应5分钟后读取吸光度A2。样品液中次黄苷和次黄苷-5'-单磷酸钠相对含量的计算公式为：样品液中次黄苷/次黄苷-5'-单磷酸钠(％)＝(A1-A0)×100％/(A2-A1×V1/V2)，其中A0为同体积的去离子水代替样品与试剂A反应所测得的吸光度值，A1为样品与试剂A反应所测得的吸光度值，A2为样品与试剂A反应后继续与试剂B反应所测得的吸光度值，V1为样品液和试剂A混合后的反应体积，V2为样品液和试剂A、试剂B混合后的总反应体积。
实施例3
精确称取0.1克左右样品，用去离子水定容至样品终浓度为5g/L的样品液；配制含有MgCl2 50mmol/L、PNP浓度为20KU/L、XTO浓度30KU/L、POD浓度为50KU/L、4-AAP浓度为5mmol/L、TOOS浓度为10mmol/L、乙二醇浓度为100ml/L、蔗糖浓度为50g/L的30mmol/L pH 7.8 K2HPO4-KH2PO4缓冲液为试剂A；配制含有5’-NT浓度为200KU/L、乙二醇浓度为100ml/L、蔗糖浓度为50g/L的30mmol/L pH 7.8 K2HPO4-KH2PO4缓冲液为试剂B。将试剂A和试剂B用于测定样品液时，采用的仪器为UV2201紫外可见分光光度计，测定方法类型为终点法，温度为37℃，V样品为7.5μl，V1为750μl，V2为250μl，测定主/副波长为560/800nm，试剂A加入样本后在测定温度反应5分钟后读取吸光度A1，继续加入试剂B反应10分钟后读取吸光度A2。样品液中次黄苷与次黄苷-5’-单磷酸钠相对含量的计算公式为：样品液中次黄苷/次黄苷-5'-单磷酸钠(％)＝(A1-A0)×100％/(A2-A1×V1/V2)，其中A0为同体积的去离子水代替样品与试剂A反应所测得的吸光度值，A1为样品与试剂A反应所测得的吸光度值，A2为样品与试剂A反应后继续与试剂B反应所测得的吸光度值，V1为样品液和试剂A混合后的反应体积，V2为样品液和试剂A、试剂B混合后的总反应体积。
利用本发明所述测定次黄苷-5’-单磷酸钠样品中次黄苷与次黄苷-5'-单磷酸钠相对含量的方法，待测样品的浓度为0.1-5g/L，可以精确检测待测样品中次黄苷与次黄苷-5’-单磷酸钠相对含量的范围为0.1％-99.9％。
本发明所涉及的化学品均无毒、易得，符合发展绿色检测方法的要求。本检测方法与高效液相(HPLC)法相比较结果见表2。
| 检测方法 | HPLC | 本法 |
| 检测时间 | 60min | 8.5～15min |
| 标准品 | 需要 | 不需要 |
| 手工法/自动法 | 手工法 | 手工法或自动法均可 |
| 含有的有毒物质 | 甲醇 | 不含有毒物质 |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种测定次黄苷与次黄苷-5'-单磷酸钠相对含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、配制含有MgCl2、PNP、XTO、POD、4-AAP、TOOS、乙二醇、、蔗糖的pH 7.4-7.8磷酸氢二钾-磷酸二氢钾(K2HPO4-KH2PO4)缓冲液，得试剂A；
步骤2、往步骤1所得的试剂A中加入含次黄苷和次黄苷-5'-单磷酸钠的待测样品，在37℃环境中，反应3.5-5min，直至样品中的次黄苷被转化为紫红色醌衍生物后，测定540-560nm波长下的吸光度A1；
步骤3、配制含5'-NT、乙二醇、蔗糖的pH 7.4-7.8K2HPO4-KH2PO4缓冲液，得试剂B；
步骤4、将步骤3所得的试剂B加入到步骤2所得溶液中，在37℃环境中，继续反应5-10min，直至样品中的次黄苷-5'-单磷酸钠被转化为紫红色醌衍生物后，测定540-560nm波长下的吸光度A2；
步骤5、通过以下公式计算出次黄苷与次黄苷-5’-单磷酸钠的相对含量：
样品液中次黄苷/次黄苷-5'-单磷酸钠(％)＝(A1-A0)×100％/(A2-A1×V1/V2)，
式中，A0为同体积的去离子水代替样品与试剂A反应所测得的吸光度值，A1为样品与试剂A反应所测得的吸光度值，A2为样品与试剂A反应后继续与试剂B反应所测得的吸光度值，V1为样品液和试剂A混合后的反应体积，V2为样品液与试剂A、试剂B混合后的总反应体积 。
2.根据权利要求1所述的一种测定次黄苷与次黄苷-5'-单磷酸钠相对含量的方法，其特征在于，所述的步骤1中pH 7.4-7.8K2HPO4-KH2PO4缓冲液中K2HPO4-KH2PO4浓度为10-30mmol/L、MgCl2浓度为20-50mmol/L、PNP浓度为2-20KU/L、XTO浓度为5-30KU/L、POD的浓度为10-50KU/L、4-AAP的浓度为0.2-5mmol/L、TOOS的浓度为0.5-10mmol/L、乙二醇浓度为10-100ml/L、蔗糖浓度为5-50g/L。
3.根据权利要求1所述的一种测定次黄苷与次黄苷-5'-单磷酸钠相对含量的方法，其特征在于，所述的步骤3中pH 7.4-7.8K2HPO4-KH2PO4缓冲液中K2HPO4-KH2PO4浓度为10-30mmol/L、5'-NT浓度为20-200KU/L、乙二醇浓度为10-100ml/L、蔗糖浓度为5-50g/L。
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