CN113008812B - 一种定量检测脂肪酶lps的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测脂肪酶LPS的试剂盒，其包括试剂R1以及试剂R2，所述试剂R1中包括缓冲液、表面活性剂1以及表面活性剂2；所述试剂R2中包括缓冲液、共脂肪酶、1，2‑邻‑二月桂宗甘油‑3‑戊二酸‑(6‑甲基试卤灵)‑酯、表面活性剂3、表面活性剂4以及蛋白。本发明通过在试剂R1中添加表面活性剂1以及表面活性剂2，同时在试剂R2中添加表面活性剂3、表面活性剂4以及蛋白的组合方式，一方面显著提升了试剂盒的检测性能，包括检测精密度以及线性范围等指标，另一方面避免了在试剂中引入胆酸盐类似物，最大程度的降低了不同检测项目间的交叉污染，保证了后续检测项目的检测准确性。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种定量检测脂肪酶LPS的试剂盒。
背景技术
现目前，生化检测试剂盒及全自动生化分析仪已在各级医院检验科大量应用，但在进行样本检测时，由于存在交叉污染，使检测结果的准确性以及可靠性受到影响，这一点越来越受到生化检验人员的重视。交叉污染的检验交叉污染的来源主要有两个方面：试剂针、搅拌棒以及比色杯污染；试剂间污染，常见类型包括：①试剂成分直接污染：上一个测定试剂中含有下一个测试所要测定的物质；②试剂成分参与反应：上一个试剂中含有的成分与下一个测试试剂某一组分会产生反应；③反应进程相同：上一个试剂所引导的反应对下一个项目的反应进程带来间接的干扰，下一项目所测定的是前后两个项目反应的总和结果；④影响反应条件：上一测试影响下一个项目的反应条件，如pH等，进而改变反应速率。
为了消除检验过程中存在的交叉干扰，一方面要不断提高检验人员的专业水平和操作技能，另一方面要从试剂研发本身出发，优化试剂成分，替换对其他项目有直接或间接污染的组分。
胆酸盐类物质是一类阴离子型甾族生物表面活性剂，鉴于其特殊的两亲性、独特的物理化学性质及其良好的生物相容性和环境友好性，在生化试剂中起到增溶、被蛋白包裹物质的解离、氧化剂等作用，尤其是在甲基试卤灵底物法的脂肪酶生化项目中，胆酸盐因其高负电荷的理化特性能够针对性的乳化样本中的脂肪酶，而不乳化样本中其它酶类，确保血清中的其它酶类不参与后续的反应，进而保证检测结果的准确性，正是因为这个原因，市面上几乎所有的甲基试卤灵低无法的脂肪酶检测试剂盒中，都添加有但酸盐类似物。而胆酸盐属于胆汁酸的一部分，同时其是两性离子类物质极难洗脱，若试剂盒中添加了胆酸盐或其类似物，胆酸盐极易残留在检测杯或搅拌棒上，将会对后续总胆汁酸(TBA)以及对胆酸盐敏感的生化项目等造成极大的干扰，严重影响检测结果的准确性。
发明内容
根据上述需求，发明人意外发现，通过在试剂R1中添加表面活性剂1和表面活性剂2，同时在试剂R2中添加表面活性剂3、表面活性剂4以及一种蛋白，一方面显著提升了试剂盒的检测性能(包括精密度以及线性范围等)，另一方面避免了在试剂中引入胆酸盐类似物，最大程度的降低了不同检测项目间的交叉污染。
本发明提供一种定量测定脂肪酶LPS的试剂盒，采用如下技术手段：一种定量检测脂肪酶LPS的试剂盒，包括试剂R1以及试剂R2，其特征在于，所述试剂R1中包括缓冲液、表面活性剂1以及表面活性剂2；所述试剂R2中包括缓冲液、共脂肪酶、1，2-邻-二月桂宗甘油-3-戊二酸-(6-甲基试卤灵)-酯、表面活性剂3、表面活性剂4以及蛋白。
优选地，所述表面活性剂1以及表面活性剂2选自TritonX-100、A90、Tween-80、B-66或LS-114中的两种，优选为LS-114以及A90的组合；所述表面活性剂3以及表面活性剂4选自Triton X-100、A90、Tween-20、Triton305或Brii 58中的两种，优选为Triton305以及Tween-20的组合；所述蛋白选自BSA、酪蛋白或血蓝素中的至少一种，优选为血蓝素。
优选地，所述试剂R1中表面活性剂1的含量为5-10g/L，表面活性剂2的含量为5-10g/L；所述试剂R2中表面活性剂3的含量为2-5g/L，表面活性剂4的含量为2-5g/L，血蓝素的含量为2-10g/L。
优选地，所述试剂R1中还包括无机盐离子、加速剂以及防腐剂。
优选地，所述试剂R2中还包括加速剂以及防腐剂。
优选地，所述试剂R1包含80-120mmol/L的缓冲液、8-12g/L无机盐离子、0.5-1g/L防腐剂以及20-30g/L加速剂。
优选地，所述试剂R2包含10-30mmol/L缓冲液、400-500U/L共脂肪酶、1-3g/L 6-甲基试卤灵、0.2-0.5g/L防腐剂以及20-30g/L加速剂。
优选地，所述试剂R1中缓冲液选自Tris或磷酸盐缓冲液中的至少一种；所述无机盐离子选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述防腐剂选自Proclin-300、叠氮钠或庆大霉素中的至少一种；所述加速剂选自葡聚糖、PEG6000、PEG8000中的至少一种。
优选地，所述试剂R2中的缓冲液选自Tris或磷酸盐缓冲液中的一种；所述防腐剂选自Proclin-300、叠氮钠或庆大霉素中的至少一种；所述加速剂选自葡聚糖、PEG6000、PEG8000中的至少一种。
优选地，所述试剂R1的pH值为7.0-8.0，优选为7.5；所述试剂R2的pH值为5.0-6.0，优选为5.5。
本发明的有益效果在于：本发明通过在试剂R1中添加表面活性剂1以及表面活性剂2，同时在试剂R2中添加表面活性剂3、表面活性剂4以及一种蛋白的方式，例如：表面活性剂1为A90，表面活性剂2为LS-114，表面活性剂3为Triton305，表面活性剂4为Tween-20，蛋白为血蓝素，一方面显著提升了试剂盒的检测性能，包括检测精密度以及线性范围等指标，另一方面避免了在试剂中引入胆酸盐类似物，最大程度的降低了不同检测项目间的交叉污染，保证了后续检测的准确性。
附图说明
图1为根据本发明实施例2所提供的脂肪酶赋值样本理论浓度与A组试剂盒测定值的线性关系图；
图2为根据本发明实施例2所提供的脂肪酶赋值样本理论浓度与B组试剂盒测定值的线性关系图；
图3为根据本发明实施例2所提供的脂肪酶赋值样本理论浓度与C组试剂盒测定值的线性关系图；
图4为根据本发明实施例2所提供的脂肪酶测定值与临床值相关性图；
具体实施例
本文包括以下的实施例，用于以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方案。本领域技术人员根据本文的公开应当理解，可以在所公开的特定的实施方式中进行许多改变但是仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的思想和范围。本发明的具体实施方式仅用于解释本发明，而非意图通过任何方式限制本发明。
实施例1脂肪酶检测试剂盒的制备
本发明的脂肪酶检测试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分。
1.试剂R1的制备
按照下述配方进行配置，充分搅拌混匀后，放于2-8℃保存。
试剂R1：
2.试剂R2的制备
按照下述配方进行配置，充分搅拌混匀后，放于2-8℃保存。
试剂R2
3.试剂盒的使用方法
在本实施例中，使用全自动生化分析仪(日立7180)配合本发明试剂盒进行样本检测。
(1)仪器参数设置
(2)测定方案
(3)计算方式
使用多点非线性/半对数校准模式，以样条函数为计算模式，根据校准品的值与吸光度变化值作剂量/响应曲线，样品中脂肪酶的含量可根据其吸光度变化值在剂量/响应曲线上计算出。
其中，本发明的检测原理是采用甲基试卤灵底物法测定人血清中脂肪酶的含量。脂肪酶在共脂肪酶的作用下，可水解1，2-邻-二月桂宗甘油-3-戊二酸-(6-甲基试卤灵)-酯生成1，2-邻-二月桂基-消旋-甘油和戊二酸-(6-甲基试卤灵)-酯，后者在碱性条件下继续分解形成戊二酸和红色甲基试卤灵，此红色染料引起的吸光度上升与样本中的脂肪酶活力成正比。
实施例2脂肪酶检测试剂盒性能测试
为了验证本发明试剂盒的各项性能，共设置3组试剂盒进行性能验证：
A组：本发明实施例1制备得到的试剂盒；
B组：试剂R1包括下述原料：50mmol/L BICINE缓冲液(pH为8.0)、5mmol/L脱氧胆酸钠、1mg/L共脂肪酶、10mmol/L氯化钙、5g/L牛血清蛋白、1％brij-35、0.05％叠氮化钠；试剂R2包括下述原料：50mmol/L L-酒石酸缓冲液(pH为4.0)、3mmol/L牛黄脱氧胆酸钠、9％稳定剂(质量比为1∶2的巯基乙醇和甘露醇)、1g/L二月桂甘油硫酸酯、5ml/L乙酸乙酯、0.5％Triton X-114、0.2g/L 1，2-邻-二月桂宗甘油-3-戊二酸-(6-甲基试卤灵)-酯、0.05％叠氮化钠；
C组：试剂R1包括下述原料：100mmol/L Tris缓冲液(pH为7.2)、40mmol/L氯化钠、35mmol/L牛磺脱氧胆酸；试剂R2组成为：9.5mmol/L酒石酸缓冲液(pH为4.0)、500U/L共脂肪酶、0.2mmol/L1，2邻-二月桂宗甘油-3-戊二、酸-(6’-甲基试卤灵)-酯、0.01％4-FPBA、0.8mg/mL葡甘露聚糖、5mmol/L NaCl、20mg/mL丙二醇、1％曲拉通100、0.5g/L BSA；
(1)准确度验证
使用三组试剂盒分别对罗氏脂肪酶检测试剂盒赋值样本进行准确度测试，设2个重复，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号，计算测定均值与靶值的相对偏差进行准确度验证。检测结果如下表所示：
表1准确度验证
由上述实验结果可知，三组试剂盒测试值1与靶值1的相对偏差分别为0.45％、-4.59％以及0.27％，测试值2与靶值2的相对偏差分别为-0.48％、-6.94％以及-0.21％。其中本发明实施例1制备得到的试剂盒(A组)以及对比试剂盒-2(C组)检测准确度优于对比试剂盒-1(B组)。
(2)精密度验证
选取临床脂肪酶低值样本、中值样本以及高值样本，使用3组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定10次，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号，分别计算测定均值和标准差，计算变异系数进行精密度考察。检测结果如下表所示：
表2精密度验证
由上述实验结果可知，三组试剂盒在低值样本检测时的变异系数分别为0.95％、3.70％以及1.77％，中值样本检测时的变异系数分别为0.77％、4.23％以及1.06％，高值样本检测时的变异系数分别为0.32％、2.16％以及0.70％，实验结果说明，三组试剂盒的在低值、中值以及高值样本的检测中，CV值均小于10％，精密度都较好，而A组试剂盒的精密度较B组以及C组试剂盒更高。
(3)线性范围验证
选择罗氏的脂肪酶检测试剂盒(比色法)在全自动生化分析仪(日立7180)对超高值样本赋值，其中高值样本的理论浓度值为1130.46U/L，低值样本的理论浓度值为4.13U/L，随后利用高值样本以及低值样本按比例配置各浓度梯度样本，使用三组试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定2次，通过全自动生化分析仪(日立7180)读取信号，分别计算测定均值进行线性范围考察。检测结果如下表所示：
表3线性范围验证
由上述实验结果可知，本发明实施例1制备得到的试剂盒(A组)以及对照试剂盒-1(B组)在样本浓度为4-1130U/L范围内，检测值与理论值的相对偏差均小于2％，而对照试剂盒-2(C组)在样本浓度为848-1130U/L时，其检测值与理论值的相对偏差均大于10％。同时，将三组试剂盒的检测结果与样本浓度理论值进行相关性分析(如附图1-3所示)，A组以及C组检测值与理论值的相关性显著优于B组，其中A组检测值与理论值的相关性R2为0.9999，B组R2为0.9999，C组R2为0.9750。
(4)临床评价
采集临床样本100份，用本发明实施例1的试剂盒和罗氏脂肪酶检测试剂盒(比色法)两种方法同时进行检测比较。将两种方法的检测结果进行线性分析，结果如附图4所示，其R2＝0.9986，因此本发明脂肪酶检测试剂盒与罗氏脂肪酶检测试剂盒(比色法)的相关性很好，符合临床分析要求，适合用于临床检测。
(5)试剂盒残留测试
为验证胆酸盐类物质对TBA检测项目的干扰，共设置3组实验进行验证：
①采用TBA检测试剂(重庆中元汇吉生物技术有限公司，200901)针对15例临床样本，在全自动生化分析仪(日立7180)上进行检测；检测完成后，使用A组试剂盒针对相同样本在同一仪器以及同一检测位上进行脂肪酶检测；检测完成后，再次使用TBA检测试剂(重庆中元汇吉生物技术有限公司，200901)针对相同样本在同一仪器以及同一检测位上进行检测
②将实验组①中使用的仪器(反应杯、搅拌棒)彻底清洗干净后，采用实验组①中所述方法，唯一区别仅在于第二步中采用B组试剂盒进行脂肪酶检测。
③将实验组②中使用的仪器(反应杯、搅拌棒)彻底清洗干净后，采用实验组①中所述方法，唯一区别仅在于第二步中采用C组试剂盒进行脂肪酶检测。
汇总三组实验中TBA检测试剂前后两次针对30例样本的检测结果，计算绝对偏差，并统计前后两次阴阳性样本的数量。实验结果如下表所示：
表4残留测试
实验结果说明，本发明实施例1制备得到的试剂盒(①组)不会对后续的TBA检测结果造成干扰，而对照试剂盒-1(②组)以及对照试剂盒-2(③组)对后续的TBA检测结果造成了严重干扰，使得检测结果严重偏高，在临床上，极易造成假阳性的产生。推测是由于对照试剂盒-1以及对照试剂盒-2中包含有胆酸盐类似物造成的，虽然每次检测后仪器都会进行清洗，但由于胆酸盐类似物易残留，难清洗的特性，极易对后续的检测项目造成干扰，尤其是TBA，本发明采用特殊组分的配比使用，一方面代替了胆酸盐类似物在生化试剂中的功能，在保持了试剂良好性能的同时(例如精密度以及线性范围)，另一方面避免了胆酸盐类似物易残留、干扰性强的弊端。
实施例4
本实施例中共设置5组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂R1中的表面活性剂1A90以及表面活性剂2LS-114浓度不相同，其余试剂盒的制备方法均与实施例1相同。同时采用所述五种试剂盒进行检测，检测结果如下表所示：
表5
注：本实施例中A组试剂R1中的表面活性剂1为1g/L的A90，表面活性剂2为1g/L的LS-114；B组为2g/L的A906以及LS-114；C组为5g/L的A90以及LS-114；D组为10g/L的A90以及LS-114；E组为15g/L的A90以及LS-114，其余组分以及制备工艺均与实施例1相同。
实验结果表明，在试剂R1中表面活性剂1A90的浓度范围为5-10g/L，以及表面活性剂2LS-114的浓度范围为5-10g/L时，试剂盒的检测精密度更高。
实施例5
本实施例中共设置5组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂R1中的表面活性剂1以及表面活性剂2的种类不相同，其余试剂盒的制备方法均与实施例1相同。同时采用所述五种试剂盒进行中值样本的精密度检测，检测结果如下表所示：
表6
注：本实施例中A组试剂R1中的表面活性剂1为8g/L的Triton X-100，表面活性剂2为8g/L的A90；B组为8g/L的A90以及LS-114；C组为8g/L的Tween-80以及B-66；D组为8g/L的B-66以及LS-114；E组为8g/L的LS-114以及TritonX-100。其余组分以及制备工艺均与实施例1相同。
实验结果显示在试剂R1中表面活性剂1以及表面活性剂2采用上述5种表面活性剂的组合时，试剂盒的检测精密度都较高，尤其是在表面活性剂1为A90，表面活性剂2为LS-114时，检测精密度最高，达到了0.98％。
实施例6
本实施例中共设置5组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂R2中的表面活性剂3 Triton305以及表面活性剂4 Tween-20浓度不相同，其余试剂盒的制备方法均与实施例1相同。同时采用所述五种试剂盒进行检测，检测结果如下表所示：
表7
注：本实施例中A组试剂R2中的表面活性剂3为0.5g/L的Triton305，表面活性剂4为0.5g/L的Tween-20；B组为1g/L的Triton305以及Tween-20；C组为2g/L的Triton305以及Tween-20；D组为为5g/L的Triton305以及Tween-20；E组为10g/L的Triton305以及Tween-20，其余组分以及制备工艺均与实施例1相同。
实验结果表明，在试剂R2中表面活性剂3 Triton305的浓度范围为2-5g/L，以及表面活性剂4Brij 58的浓度范围为2-5g/L时，试剂盒的检测精密度更高。
实施例7
本实施例中共设置5组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂R2中的表面活性剂3以及表面活性剂4的种类不相同，其余试剂盒的制备方法均与实施例1相同。同时采用所述五种试剂盒进行中值样本的精密度检测，检测结果如下表所示：
表8
注：本实施例中A组试剂R1中的表面活性剂3为5g/L的Triton X-100，表面活性剂4为5g/L的A90；B组为5g/L的A90以及Tween-20；C组为5g/L的Tween-20以及Triton305；D组为5g/L的Triton305以及Brij 58；E组为5g/L的Brij 58以及Triton X-100。其余组分以及制备工艺均与实施例1相同。
实验结果显示在试剂R2中表面活性剂3以及表面活性剂4采用上述5种表面活性剂的组合时，试剂盒的检测精密度都较高，尤其是在表面活性剂3为Triton305，表面活性剂4为Tween-20时，检测精密度最高，达到了0.88％。
实施例8
本实施例中共设置5组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂R2中的蛋白(血蓝素)浓度不相同，其余试剂盒的制备方法均与实施例1相同。同时采用所述五种试剂盒进行检测，检测结果如下表所示：
表7
注：本实施例中A组试剂R2中的血蓝素浓度为1g/L；B组为2g/L；c组为5g/L；D组为10g/L；E组为20g/L，其余组分以及制备工艺均与实施例1相同。
实验结果表明，在试剂R2中蛋白(血蓝素)的浓度范围为2-10g/L时，试剂盒的检测精密度更高。
实施例9
本实施例中共设置4组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例1的区别仅在于试剂R2中的蛋白种类不相同，其余试剂盒的制备方法均与实施例1相同。同时采用所述三种试剂盒进行中值样本的精密度检测，检测结果如下表所示：
表8
注：本实施例中A组试剂R2中的蛋白为5g/L的血蓝素；B组为5g/L的酪蛋白；C组为5g/L的BsA；D组未添加蛋白，其余组分以及制备工艺均与实施例1相同。
实验结果显示在试剂R2中的蛋白为血蓝素时，试剂盒的检测精密度显著提升，达到了0.98％。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变形。
Claims (10)
1.一种定量检测脂肪酶LPS的试剂盒，包括试剂R1以及试剂R2，其特征在于，所述试剂R1中包括缓冲液、表面活性剂1以及表面活性剂2；所述试剂R2中包括缓冲液、共脂肪酶、1，2-邻-二月桂宗甘油-3-戊二酸-(6-甲基试卤灵)-酯、表面活性剂3、表面活性剂4以及蛋白；所述表面活性剂1以及表面活性剂2为LS-114以及A90的组合；所述表面活性剂3以及表面活性剂4为Triton305以及Tween-20的组合；所述蛋白为血蓝素。
2.根据权利要求1所述的一种定量检测脂肪酶LPS的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中表面活性剂1的含量为5-10g/L，表面活性剂2的含量为5-10g/L；所述试剂R2中表面活性剂3的含量为2-5g/L，表面活性剂4的含量为2-5g/L，血蓝素的含量为2-10g/L。
3.根据权利要求2所述的一种定量检测脂肪酶LPS的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中还包括无机盐离子、加速剂以及防腐剂。
4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的一种定量检测脂肪酶LPS的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中还包括加速剂以及防腐剂。
5.根据权利要求4所述的一种定量检测脂肪酶LPS的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1包含80-120mmol/L的缓冲液、8-12g/L无机盐离子、0.5-1g/L防腐剂以及20-30g/L加速剂。
6.根据权利要求4所述的一种定量检测脂肪酶LPS的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2包含10-30mmol/L缓冲液、400-500U/L共脂肪酶、1-3g/L6-甲基试卤灵、0.2-0.5g/L防腐剂以及20-30g/L加速剂。
7.根据权利要求5所述的一种定量检测脂肪酶LPS的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中缓冲液选自Tris或磷酸盐缓冲液中的至少一种；所述无机盐离子选自氯化钠或氯化钾中的至少一种；所述防腐剂选自Proclin-300、叠氮钠或庆大霉素中的至少一种；所述加速剂选自葡聚糖、PEG6000、PEG8000中的至少一种。
8.根据权利要求6-7任一项所述的一种定量检测脂肪酶LPS的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的缓冲液选自Tris或磷酸盐缓冲液中的一种；所述防腐剂选自Proclin-300、叠氮钠或庆大霉素中的至少一种；所述加速剂选自葡聚糖、PEG6000、PEG8000中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的一种定量检测脂肪酶LPS的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的pH值为7.0-8.0；所述试剂R2的pH值为5.0-6.0。
10.根据权利要求9所述的一种定量检测脂肪酶LPS的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的pH值为7.5；所述试剂R2的pH值为5.5。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 400037 1st-4th floor, building 30, No.6 Taikang Road, Zone C, Jianqiao Industrial Park, Dadukou District, Chongqing Applicant after: Zhongyuan Huiji Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 400037 1st-4th floor, building 30, No.6 Taikang Road, Zone C, Jianqiao Industrial Park, Dadukou District, Chongqing Applicant before: CHONGQING ZHONGYUAN HUIJI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |