CN111175242A - 一种脂蛋白磷脂酶a2检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒及其应用,属于生物化学技术领域。所述的试剂盒包括R1和R2双试剂,用于测定脂蛋白磷脂酶A2的活性。本试剂盒稳定性好,使用前无需配制,且有效期长,可用于冠心病或脑卒中等不良心血管事件的风险的预测,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域,具体涉及一种脂蛋白磷脂酶A2活性的检测试剂盒,以及在临床检测中的应用。
背景技术
脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)是丝氨酸依赖的磷脂酶,属于磷脂酶家族,由441个氨基酸组成,主要由炎症细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞等)分泌。研究证明,Lp-PLA2在心血管疾病检测方面具有重要意义:①Lp-PLA2是血管炎症特异性标志物,其含量增加可以提示心血管疾病风险性的增加;②各种动脉粥样硬化相关的心脑血管栓塞性疾病的风险评估,包括脑卒中、冠心病等不良心血管事件的风险评估;③各种动脉粥样硬化相关的心脑血管栓塞性疾病治疗效果评估。
目前,对于Lp-PLA2的检测主要是利用免疫学上抗原-抗体的反应原理,测定Lp-PLA2的质量,并不能确定其中Lp-PLA2的酶活。有研究显示,Lp-PLA2促动脉粥样硬化的作用来源于其酶活而不是质量。对于Lp-PLA2发生氨基酸突变的人群,如果突变的氨基酸影响了Lp-PLA2的酶活,那么质量检测与酶活检测结果就不一致,因而可能与临床不符。所以,临床上需要对Lp-PLA2的活性进行检测。虽然市面上已有Lp-PLA2活性检测的试剂,但是试剂的稳定性差,在使用前需现配现用,不便于临床使用。
发明内容
为此,需要提供一种快速、方便、稳定的脂蛋白磷脂酶A2活性检测试剂盒,便于临床推广使用。
本发明提供的技术方案如下:
一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒,所述的试剂盒包括R1和R2双试剂;其中R1试剂的成分包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液;R2试剂的成分包括1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆碱、1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰乙醇胺、1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰甘油或1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷酸,其中的一种以上。
进一步的,所述的R1试剂的配方为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)100-150mM,NaCl0.8-1.0%,EDTA·Na25-10mM,pH 7.4-7.6。
所述的R2试剂的配方为柠檬酸20-30mM,NaCl 0.8-1.0%,EDTA·Na2 5-10mM,3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)5-10mM,正壬烷磺酸钠5-10mM,pH2.4-2.6,1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆碱(DNGP)15-25mM,二甲基亚砜(DMSO)30-40%。
进一步的,所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒在检测血液中脂蛋白磷脂酶A2活性中的应用。
进一步的,所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒在预测冠心病或脑卒中风险中的应用。
区别于现有技术,上述技术方案的有益效果在于:本试剂盒测定脂蛋白磷脂酶A2的活性,且为双试剂,稳定性好,使用前无需配制,即开即用。本试剂盒可以在全自动生化分析仪上使用,有效期长,可达12个月。本试剂盒可用于冠心病或脑卒中等不良心血管事件风险的评估。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、所实现目的及效果,以下结合具体实施例详予说明。
实施例1
样本中的脂蛋白磷脂酶A2水解不同缓冲液下的底物,会生成在405nm波长处可检测到吸光值的产物4-硝基苯酚,其吸光值高低与样本中脂蛋白磷脂酶A2活性成正比。通过在400nm-450nm波长范围内测定反应试剂吸光度值,参照标准曲线即可计算出样本中脂蛋白磷脂酶A2的活性。
1.试剂配制
R1:125mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸,0.9%NaCl,5mM EDTA·Na2,pH 7.45;
R2a:25mM柠檬酸,0.9%NaCl,5mM EDTA·Na2,5mM 3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐,5mM正壬烷磺酸钠,pH 2.5;
DNGP溶液:固体DNGP溶解于50%乙醇-二甲基亚砜中,制备60mM DNGP溶液。
R2分为以下五组分别配制,筛选最优配方:
配方A:1.3mL 60mM DNGP+4.7mL R2a;
配方B:1.3mL 60mM DNGP+0.7mL DMSO+4.0mL R2a;
配方C:1.3mL 60mM DNGP+1.4mL DMSO+3.3mL R2a;
配方D:1.3mL 60mM DNGP+2.1mL DMSO+2.6mL R2a;
配方E:1.3mL 60mM DNGP+2.8mL DMSO+1.9mL R2a;
2.检测方法
将R1和R2放置于全自动生化分析仪中进行检测。以东芝40全自动生化分析仪为例,设置参数如下:
主波长:405nm(也可选择400nm~450nm范围内的波长)
副波长:505nm
反应方法:速率法
反应方向:向上
温度:37℃
标本量:2μL
R1:240μL
R2:80μL
延迟时间:20s
测定时间:260s
3.检测结果
3.1 R2配方的筛选实验
对以上五组配方的R2试剂进行准确度实验,计算相对偏差。分别用0IU/L和530IU/L 2个浓度标准品进行线性定标,定标后测定已知样本的值,每个样本测两次,取平均值后,计算相对偏差,结果见表1。
表1不同R2配方对样本的测定结果
实验结果表明,配方D中检测值与样本实际值最接近,相对平均偏差最小,为2.96%,符合产品技术要求。所以选择配方D作为Lp-PLA2检测试剂盒中R2的配方。
综上,确定脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)检测试剂盒的配方为:
R1:125mM HEPES,0.9%NaCl,5mM EDTA·Na2,pH 7.45;
R2:25mM柠檬酸,0.9%NaCl,5mM EDTA·Na2,5mM CHAPS,5mM正壬烷磺酸钠,pH2.5,20mM DNGP,34%DMSO。
3.2精密度实验
下公式计算变异系数CV(%)值,结果见表2。
表2批内精密度实验结果
实验结果表明,本Lp-PLA2检测试剂盒的精密度良好,CV值小于2%,符合产品技术要求。
3.3分析灵敏度实验
按上述配方配制Lp-PLA2检测试剂盒,先用浓度530IU/L校准品进行定标,然后用浓度410IU/L样品进行检测,记录产生的吸光度变化,按如下公式换算成410IU/L浓度的吸光度差值(ΔA),ΔA即为分析灵敏度,结果见表3。
式中:ΔA校准品——校准品吸光度变化值;
C校准品——校准品浓度。
表3分析灵敏度实验结果
实验结果显示,Lp-PLA2检测试剂盒的分析灵敏度平均为0.043。
3.4线性范围实验
用接近线性范围上限的高Lp-PLA2活性血清样品,按下表用纯化水配制成9个稀释浓度。用Lp-PLA2检测试剂盒对每一稀释浓度样本平行测试3次,分别求得测定均值。以稀释浓度为自变量,以测定结果均值为因变量,求出线性回归方程和线性相关系数r,实验结果见表4。
表4线性范围实验结果
从上表可知,Lp-PLA2检测试剂盒的线性范围为:线性在[0-1500]IU/L范围内满足r>0.990;活性为[0-15]IU/L时,绝对偏差在±5IU/L范围内;活性为(15,1500]IU/L时,相对偏差在±5%范围内,符合产品技术要求。
3.5热稳定性实验
将Lp-PLA2检测试剂盒置于37℃存放7天后,进行精密度实验。方法同3.2,结果见表5。
表5热稳定性实验结果
实验结果表明,本Lp-PLA2检测试剂盒置于37℃7天后热稳定性良好,CV值小于3%,符合产品技术要求。
3.6临床血清实验
收集健康人和冠心病患者的血清样本,以市售脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒为比对试剂,与本Lp-PLA2检测试剂盒(配方见3.1)对同一样本进行检测,并计算相对偏差,结果见表6。其中,1-19号样本为健康人血清样本,20-40号样本为病人血清样本。
表6临床样本比对实验结果
实验结果表明,本试剂盒与市售试剂盒线性相关性好,偏差小,符合临床要求。市售试剂盒为R1、R2a、R2b三试剂,使用前需将R2a和R2b按比例混合,混合后的试剂有效期为7天,使用不方便,配制后试剂稳定性差,有效期短。本试剂盒为R1、R2双试剂,无需配制,即开即用,有效期长,可达12个月。
本Lp-PLA2检测试剂盒测得的19个健康人的Lp-PLA2值均小于680IU/L,21个冠心病患者Lp-PLA2值大于680IU/L,说明本试剂盒在冠心病辅助诊断与评估方面具一定的临床应用价值。
Claims (4)
1.一种脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒,其特征在于:所述的试剂盒包括R1和R2双试剂;其中R1试剂的成分包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液;R2试剂的成分包括1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆碱、1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰乙醇胺、1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰甘油或1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷酸,其中的一种以上。
2.根据权利要求1所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒,其特征在于:所述的R1试剂的配方为4-羟乙基哌嗪乙磺酸100-150mM,NaCl 0.8-1.0%,EDTA·Na2 5-10mM,pH 7.4-7.6。
3.根据权利要求1所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒,其特征在于:所述的R2试剂的配方为柠檬酸20-30mM,NaCl 0.8-1.0%,EDTA·Na2 5-10mM,3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐5-10mM,正壬烷磺酸钠5-10mM,pH 2.4-2.6,1-十四酰基-2-4-对硝基苯酚丁二酸酐-3-磷脂酰胆碱15-25mM,二甲基亚砜30-40%。
4.一种如权利要求1至3任意一项所述的脂蛋白磷脂酶A2检测试剂盒在检测血液中脂蛋白磷脂酶A2活性中的应用。
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