CN108169498A - 一种叶酸定量检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种适合各种全自动生化分析仪使用的叶酸定量检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、校准品和质控品，所述的试剂R1中包括叶酸结合白蛋白溶液，所述试剂R2中包括叶酸抗体胶乳颗粒悬浮液。本发明所述的叶酸定量检测试剂盒能够在十分钟内快速定量检测全血、红细胞和血清中叶酸的含量，且特异性高、灵敏度高、操作简单，另外，该试剂盒制作成本合理，能够在临床中批量使用。

Description

一种叶酸定量检测试剂盒
技术领域
本发明属于医疗检测试剂盒领域，尤其是涉及一种适合各种全自动生化分析仪使用的叶酸定量检测试剂盒。
背景技术
叶酸即维生素B11，是一种人体必须生长元素，具有重要的生理功能。一是在体内作为甲基供体参与各种甲基化反应；二是参与合成嘌呤和胸腺嘧啶，即合成核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)；三是参与氨基酸代谢。人体自身不能合成叶酸，必须通过外源性补充。缺乏叶酸将引起巨红细胞贫血和白细胞减少症，特别是孕妇孕前三个月叶酸摄入不足，则胎儿易患先天性神经管畸形等严重疾病。大量国内外研究证实，血清叶酸缺乏症逐年增多，尤其以老年人和孕产妇最为明显。因此，加强健康体检人群的叶酸检测变的越来越重要。目前市场上叶酸检测方法主要有微生物法、化学发光法、荧光法、色谱法、比色法、紫外分光光度法、层析法等。
以上检测方法各有其不足之处：如微生物法检测周期长，批件重复性差、菌种传代保存烦琐，一般用于检测食品和乳品中叶酸的含量；比色法、紫外分光光度法和层析法抗干扰能力弱，灵敏度低，一般用于检测纯品、维生素制剂或针剂中叶酸的含量；化学发光法、荧光法和色谱法由于灵敏度高、特异性好，现逐渐开始在临床实验性使用，但由于需要昂贵的专用设备，并且成本高，尚未广泛推广。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种适合各种全自动生化分析仪使用的叶酸定量检测试剂盒，以得到一种快速(在十分钟内)、特异性高、灵敏度高、合理成本、操作简单、适合临床批量检测的叶酸检测试剂盒。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种叶酸定量检测试剂盒，其特征在于：包括试剂R1、试剂R2、校准品和质控品，所述的试剂R1中包括叶酸结合蛋白溶液，所述试剂R2中包括叶酸抗体胶乳颗粒悬浮液。
进一步的，所述叶酸结合蛋白溶液的浓度为0.2-10μg/L；所述叶酸抗体胶乳颗粒悬浮液的重量百分比浓度为0.5-5％。
进一步的，所述叶酸抗体胶乳颗粒悬浮液由如下原料制备而成：
粒径为50-400纳米的乳胶微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、叶酸抗体、N-羟基硫代琥珀酰亚胺以及PH值为7-9的3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液。
进一步的，所述试剂R1中还包括缓冲液A、聚乙二醇辛基苯基醚X-100和叠氮化钠。
进一步的，所述试剂R2中还包括缓冲液B和叠氮化钠。
进一步的，所述缓冲液A的PH值为7-9，摩尔浓度为10-100mM；所述聚乙二醇辛基苯基醚X-100的重量百分数为0.1％；所述叠氮化钠的重量百分数为1‰。
进一步的，所述缓冲液B的PH值为7-9，摩尔浓度为10-100mM；所述叠氮化钠的重量百分数为0.1％。
进一步的，所述缓冲液A为3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲液)、Good’s缓冲液(两性离子缓冲液)、Hepes缓冲液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液)中一种或两种以上的混合物。
进一步的，所述缓冲液B为3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、Tris缓冲液、Good’s缓冲液、Heps缓冲液中一种或两种以上的混合物。
进一步的，所述叶酸结合蛋白的制备方法包括如下步骤：
步骤A：配制备用溶液
a1、配制pH值为10的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液；
a2、配制载体蛋白溶液：取50mg载体蛋白加入pH值为10的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中得到载体蛋白溶液；
步骤B：分别称量叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的分析纯试剂；
步骤C：活化
c1、在pH值为10的二甲基甲酰胺中依次加入叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的分析纯试剂，在室温下反应1小时得到混合溶液A；
c2、将步骤a2配制的载体蛋白溶液与步骤c1得到的混合溶液A混合得到混合溶液B，震荡均匀后，置恒温旋转仪，反应12小时；
步骤D：透析
用质量浓度为1.2％氯化钠溶液透析步骤c1得到的混合溶液B，换液5次得到偶联后的叶酸结合蛋白溶液；
步骤E：偶联效果检测
用190nm到400nm波长分别扫描叶酸溶液、载体蛋白溶液、偶联后叶酸结合白蛋白溶液得到扫面图并比较；
步骤F：选择偶联效果较好的叶酸结合蛋白溶液冻存待用。
优选地，所述的载体蛋白为牛血清白蛋白。
进一步的，所述叶酸抗体胶乳颗粒悬浮液的制备方法包括如下步骤：
步骤A：配制溶液
配制pH值为7-9的缓冲液B；
步骤B：称量50-400纳米乳胶微球以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠的分析纯试剂、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的分析纯试剂、叶酸抗体；
步骤C：活化
在pH值为7-9的缓冲液B中依次加入量取好的粒径为50-400纳米的乳胶微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠的分析纯试剂、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的分析纯试剂，在室温活化1小时得到活化液；
步骤D：偶联
在活化液中加入叶酸抗体，在室温偶联1小时得到偶联液；
步骤E：分离
偶联液在12000转/分钟条件下高速离心分离45分钟，弃上清液，沉淀用20KHZ超声波重新乳化，重复分离清洗乳化1-3次得到乳化液；
步骤F：乳化液加入稳定剂和pH值为7-9的缓冲液B中得到叶酸抗体胶乳颗粒悬浮液，贮存待用。
进一步的，所述校准品中叶酸的浓度分别为2μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、80μg/L，160μg/L所述质控品中叶酸的浓度分别为3μg/L、9μg/L、27μg/L。
本发明还公开了上述叶酸定量检测试剂盒的用途：用于筛查或辅助诊断孕妇和中老年人的叶酸缺乏症。
本发明的检验原理：样本中的叶酸和试剂R1中叶酸结合白蛋白竞争性与试剂R2中的标记在纳米乳胶微球上的叶酸抗体发生集凝反应。在546-600nm波长检测其吸光度的变化，其变化程度与样本中的叶酸浓度成反比。对照标准曲线，可以计算求得样品中的叶酸浓度。
相对于现有技术，本发明所述的叶酸定量检测试剂盒具有以下优势：
本发明所述的叶酸定量检测试剂盒能够快速(十分钟)定量检测血清中叶酸的含量，且特异性高、灵敏度高、操作简单，另外，该试剂盒制作成本合理，能够在临床中批量使用。
附图说明
图1为实施例3中奥林巴斯2700全自动生化分析仪上的参数设定示意图；
图2为实施例3的测试进程图。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
实施例1
试剂盒中试剂的制备
1、叶酸结合白蛋白的制备
步骤A：配制备用溶液
a1、配制pH值为10的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液；a2、配制载体蛋白溶液：取50mg载体蛋白加入pH值为10的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中得到载体蛋白溶液；
步骤B：分别称量叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的分析纯试剂；
步骤C：活化
c1、在pH值为10的二甲基甲酰胺中依次加入叶酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的分析纯试剂，在室温下反应1小时得到混合溶液A；c2、将步骤a2配制的载体蛋白溶液与步骤c1得到的混合溶液A混合得到混合溶液B，震荡均匀后，置恒温旋转仪，反应12小时；
步骤D：透析
用质量浓度为1.2％氯化钠溶液透析步骤c2得到的混合溶液B，换液5次得到偶联后的叶酸结合白蛋白溶液；
步骤E：偶联效果检测
用190nm到400nm波长分别扫描叶酸溶液、载体蛋白溶液以及重复步骤A-D得到多组偶联后叶酸结合蛋白溶液得到扫面图并比较；
步骤F：选择偶联效果较好的叶酸结合白蛋白溶液冻存待用。
其中，载体蛋白为牛血清白蛋白。
2、叶酸抗体胶乳颗粒悬浮液的制备
步骤A：配制溶液
配制pH值为7.2的3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液；
步骤B：称量100纳米乳胶微球以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠的分析纯试剂、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的分析纯试剂、叶酸抗体；
步骤C：活化
在pH值为7.2的3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中依次加入量取好的100纳米乳胶微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠的分析纯试剂、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的分析纯试剂，在室温活化1小时得到活化液；
步骤D：偶联
在活化液中加入叶酸抗体，在室温偶联1小时得到偶联液；
步骤E：分离
偶联液在12000转/分钟条件下高速离心分离45分钟，弃上清液，沉淀用20KHZ超声波重新乳化，重复分离清洗乳化1-3次得到乳化液；
步骤F：乳化液加入pH值为7.2的3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液中得到叶酸抗体胶乳颗粒悬浮液，贮存待用。
实施例2叶酸定量检测试剂盒的组件
叶酸定量检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、校准品和质控品；其中：
(1)试剂R1包括如下组分：
(2)试剂R2包括如下组分：
3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液PH7.2 50mM
叶酸抗体胶乳颗粒悬浊液 1.2％
叠氮化钠 1‰；
试剂盒内试剂的包装规格为试剂R1 60ml×1和试剂R2 15ml×1，试剂盒2-8℃避光密封贮存，避免冷冻、污染，自生产之日起可稳定12个月。开盖后请在30天内使用完毕。
(3)校准品和质控品的制备
①精确称量叶酸色谱纯(Sigma)样品1毫克，加入900毫升左右纯化水搅拌溶解完全。在室温下，缓慢移液到1升容量瓶，添加1‰的防腐剂，再加100毫升左右纯化水精确定容至1升。计算，可以求得溶液中叶酸浓度为1/1＝1毫克/升。
②将以上1毫克/升的叶酸溶液用合适的缓冲液稀释到160、80、40、20、10、2微克/升的校准品，待用。
③将以上1毫克/升的叶酸溶液用合适的缓冲液稀释到27、9和3微克/升的质控品，待用。
④取1份该校准品和9份已知浓度血清样品混匀为分析样品，测定，计算，回收率(％)＝(分析样品测定值*10-样品原值*9)/(标准浓度*1)×100％，回收率在95％－105％之间。
⑤采用高效液相(HPLC)内标法测定，其校准品测定值应在理论值的±5％范围内，其质控液测定值应在理论值的±10％范围内。
⑥留样，2-8℃保存，连续测定30天。该校准品和质控品在30天内变异系数小于10％。
⑦将校准品和质控品在2-8℃保存待用。
实施例3血清样本中叶酸的检测
按照图1所示的参数表设定奥林帕斯2700全自动生化分析仪，标准品浓度和位置根据实际使用情况输入。本实施例中定量检测叶酸浓度还可使用目前现有技术中的各种全自动生化分析仪，如日立7080、7600；奥林帕斯400；贝克曼CX9、LX20；东芝40；杜邦RXL；雅培C8000等全自动生化分析仪。
将待测血液样本采集后进行离心处理，取血清待用；使用奥林帕斯2700全自动生化分析仪，将200μL的试剂R1分别加入空白管、标准管和测定管中，十秒内向测定管中加入10μL待测血清，向空白管中加入10μL的蒸馏水，向标准管中加入10μL校准品；将空白管、标准管和测定管置于37℃孵育5分钟；然后向空白管、标准管和测定管分别加入50μL的试剂R2，充分搅拌混匀；1分钟后，读取各管中的吸光度数值，并记录，5分钟后再次读取各管的吸光度，并计算吸光度差值。通过数学模型(非线性)如Logit-log(4p)或spline拟合多点定标的校准曲线。血液样本A中叶酸的浓度值通过与标准曲线对照，计算得血液样本A中叶酸浓度为5μg/L。测试过程中的主波长：600nm；反应方法：终点法；反应方向：正。
实施例4叶酸定量检测试剂盒技术参数的确定试验
1、准确度评估
用参考物质定标,测定国家标准物质质控,当样本测定,重复测定3次，分别计算测定结果的均值，按下式求出偏差(d)。
式中：为测定结果均值,为靶值。
测定结果均在靶值范围内,与中国临检中心规定要求。
2、检测范围(即线性范围)
在[0.0-200.0μg/L]范围内，取高值血清标本用蒸馏水稀释成5个不同浓度的标本，并对测定值与预期值作回归分析。
所得结果在0.0-200.0μg/L范围内r≥0.990；线性良好。
3、批内精密度(批内差)
依据美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)EP5-A规程,取高中低两个水平的质控血清标本，用同一批号试剂平行测定同一标，计算测定值的平均值和标准差，按下式计算批内变异系数。
式中：S为标准差，计算公式为
dn为同水平各次所测值的偏差，计算公式为
xn为同水平各次所测值；
为平均值，计算公式为
根据以上实验数据,批内变异系数(CV)符合产品要求。
4、批间精密度(批间差)
取2个批号的试剂，分别测定同一质控血清标本或血清标本3次。分别计算每个批号试剂3次测定结果的均值和2个批号试剂测定结果的总均值按下式求出2个批号试剂测定均值的批间差(％)。
式中：为中的最大值；
为中的最小值。
产品检测结果符合产品标准要求。
5、检测灵敏度
检测灵敏度即最小检测限，一般定义为水的测定浓度-(n＝20)均值X+2SD；
依据实验结果，规定产品标准中检测灵敏度为≤0.2μg/L。
6、开盖实验
在开盖机器实际储存条件下，连续测定质控。
依据实验结果，产品检测结果符合产品标准要求。
通过试验得出以下结论：
(1)本发明的试剂盒的批内批间精密度基本符合要求，批内和批间的变异系数在10％以下。
(2)本发明的试剂盒的线性范围高到200μg/L，相关系数大于0.99.
(3)本发明的试剂盒的准确度也较高，相对偏差都在3％以内。
(4)本发明的试剂盒检测灵敏度≤0.2μg/L。
(5)本发明的试剂盒开盖条件下变异系数在5％以内。
综上所述，通过对叶酸测定试剂盒的综合评价，说明该试剂盒性能良好，完全满足于临床的实际需求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种叶酸定量检测试剂盒，其特征在于：包括试剂R1、试剂R2、校准品和质控品，所述的试剂R1中包括叶酸结合蛋白溶液，所述试剂R2中包括叶酸抗体胶乳颗粒悬浮液。
2.根据权利要求1所述的叶酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述叶酸结合蛋白溶液的浓度为0.2-10μg/L；所述叶酸抗体胶乳颗粒悬浮液的重量百分比浓度为0.5-5％。
3.根据权利要求1或2所述的叶酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述叶酸抗体胶乳颗粒悬浮液由如下原料制备而成：
粒径为50-400纳米的乳胶微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、叶酸抗体、N-羟基硫代琥珀酰亚胺以及PH值为7-9的3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的叶酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中还包括缓冲液A、聚乙二醇辛基苯基醚X-100、叠氮化钠。
5.根据权利要求4所述的叶酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中还包括缓冲液B和叠氮化钠。
6.根据权利要求5所述的叶酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液A的PH值为7-9，摩尔浓度为10-100mM；所述聚乙二醇辛基苯基醚X-100的重量百分数为0.1％；所述叠氮化钠的重量百分数为1‰。
7.根据权利要求6所述的叶酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液B的PH值为7-9，摩尔浓度为10-100mM；所述叠氮化钠的重量百分数为0.1％。
8.根据权利要求7所述的叶酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述缓冲液A为3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、Tris缓冲液、Good’s缓冲液、Hepes缓冲液中一种或两种以上的混合物，所述缓冲液B为3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸缓冲液、Tris缓冲液、Good’s缓冲液、Heps缓冲液中一种或两种以上的混合物。
9.根据权利要求3所述的叶酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述叶酸抗体胶乳颗粒悬浮液的制备方法包括如下步骤：
步骤A：配制溶液
配制pH值为7-9的缓冲液B；
步骤B：称量50-400纳米乳胶微球以及1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠的分析纯试剂、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的分析纯试剂、叶酸抗体；
步骤C：活化
在pH值为7-9的缓冲液B中依次加入量取好的粒径为50-400纳米的乳胶微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸钠的分析纯试剂、N-羟基硫代琥珀酰亚胺的分析纯试剂，在室温活化1小时得到活化液；
步骤D：偶联
在活化液中加入叶酸抗体，在室温偶联1小时得到偶联液；
步骤E：分离
偶联液在12000转/分钟条件下高速离心分离45分钟，弃上清液，沉淀用20KHZ超声波重新乳化，重复分离清洗乳化1-3次得到乳化液；
步骤F：乳化液加入稳定剂和pH值为7-9的缓冲液B中得到叶酸抗体胶乳颗粒悬浮液，贮存待用。
10.根据权利要求1所述的叶酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述校准品中叶酸的浓度分别为2μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、80μg/L、160μg/L，所述质控品中叶酸的浓度分别为3μg/L、9μg/L、27μg/L。
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