CN109307720A - 一种组合物和复合校准品及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物分子体外诊断技术领域，具体涉及一种组合物和复合校准品及其应用。本发明所提供的组合物，包括以下重量组分：甘油0.5～10份；二丁基羟基甲苯0.01～3份；增效剂0.01～1份；表面活性剂0.01～2份。甘油为稳定剂，具有保护液和脱水保护液的作用，能够对叶酸抗原起到很好的保护作用；二丁基羟基甲苯为抗氧化剂，能够与自动氧化过程中产生的链增长自由基反应，消灭自由基，避免叶酸的氧化；表面活性剂可以替代水与叶酸的亲水基团形成氢键，维持叶酸的空间结构稳定及避免凝聚；增效剂与抗氧化剂混合使用，可提高抗氧化效果，更好地阻止或延缓叶酸氧化。各组分协同增效，共同提高了叶酸的稳定性并延长贮存期。

Description

一种组合物和复合校准品及其应用

技术领域

本发明属于生物分子体外诊断技术领域，具体涉及一种组合物和复合校准品及其应用。

背景技术

叶酸(folic acid)也称维生素B9，是一种水溶性B族维生素，是肌体正常细胞生长和DNA合成的重要必需维生素，许多食物都含有叶酸，食物中叶酸进入人体后，被还原成具有生理作用的活性形式四氢叶酸(tetrahydrofolic acid，THFA)，它是体内生化反应中一碳基团的传递体。叶酸携带一碳基团形成N5-甲基THFA、亚甲基THFA等参与嘌呤和胸腺嘧啶的合成，进一步合成DNA和RNA。参与甘氨酸和丝氨酸之间、组氨酸和谷氨酸之间、半胱氨酸和蛋氨酸之间的相互转化，并参与许多重要物质的合成，如血红蛋白、肾上腺素、胆碱、肌酸等。叶酸缺乏会引起以巨幼红细胞性贫血为特征的临床综合征，当叶酸缺乏时，DNA合成障碍，从而使迅速分裂的造血系统和胃黏膜发生病变，可并发神经系统损伤。因而，叶酸检测对诊断巨幼细胞贫血的病因具有重要价值。

目前，存在多种叶酸检测方法，包括微生物法、放射免疫分析法、色谱分析法、酶联免疫法、化学发光免疫分析法、色谱一质谱检测法等。由于叶酸在人体内的含量极少，稳定性比较差，且其具有生物活性的化合物构成成分比较复杂，加大了叶酸准确分析的难度。化学发光免疫分析法因其具有较高的灵敏度和特异性，检测迅速，近年来已逐渐成为叶酸检测的主要方法之一。

现有基于化学发光免疫分析法的叶酸测定试剂盒一般包括校准品，用于校正并验证实验结果的准确程度。校准品常为液体或冻干品，其包括叶酸和基质，叶酸在液态下容易发生变性，导致检测结果不稳定。虽然能够通过加入一些保护液(比如蛋白、抗氧化剂或表面活性剂等)，来延长叶酸在液态下的保存时间，然而据统计，其在避光、2～8℃条件下的保质期也仅为3～4个月。为了提高校准品的稳定性，部分厂家采用冻干品的形式，冻干后的叶酸冻稳定时间长，但冻干工艺复杂，批次差异大，且大部分试剂盒使用的叶酸校准品，复溶后储存时间短，2～8℃条件下只能存放1天。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明实施例的主要目的在于提供一种组合物，以作为叶酸保护制剂，旨在解决现有叶酸校准品容易变质，贮存稳定性差等技术问题。

本发明实施例的次要目的在于提供一种复合校准品，以及提供上述组合物或复合校准品在叶酸检测中的应用，用于提高叶酸检测的稳定性，降低叶酸准确分析的难度。

为了实现上述发明目的，一方面，本发明提供了一种组合物，包括以下重量组分：

与现有技术相比，本发明组合物以甘油作为稳定剂，甘油具有保护液和脱水保护液的作用，能够对叶酸抗原起到很好的保护作用；二丁基羟基甲苯作为抗氧化剂，能够与自动氧化过程中产生的链增长自由基反应，消灭自由基，避免叶酸的氧化；表面活性剂可以替代水与叶酸的亲水基团形成氢键，维持叶酸的空间结构稳定及避免凝聚；增效剂与抗氧化剂混合使用，可提高抗氧化效果，更好地阻止或延缓叶酸氧化，提高叶酸的稳定性并延长贮存期。经实验检测，本发明甘油、二丁基羟基甲苯、增效剂和表面活性剂之间协同增效，将其作为一种叶酸保护制剂与叶酸混合保存，大大延长了叶酸的保存时间，提高了叶酸的贮存稳定性。

另一方面，本发明提供了一种复合校准品，包括：叶酸和叶酸保护制剂；所述叶酸保护制剂包括以下重量组分：

本发明提供的复合校准品可应用于叶酸测定试剂盒中，可提高叶酸测定试剂盒的贮存稳定性，降低成本，并在一定程度上提高叶酸检测的稳定性和灵敏度。

又一方面，本发明还提供了前述组合物或上述复合校准品在叶酸检测中的应用。

附图说明

图1为测试例2中叶酸保护液A、叶酸保护液B、叶酸保护液C和叶酸保护液D之间的稳定性对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一方面，本发明所提供的组合物，包括以下重量组分：

在上述技术方案中，甘油作为稳定剂，其具有保护液和脱水保护液的作用，能够对叶酸抗原起到很好的保护作用。本发明实施例对甘油的来源不作具体限定，其可直接从市场上购买获得，也可以通过本领域熟知的技术手段制备得到。

二丁基羟基甲苯作为抗氧化剂，能够与自动氧化过程中产生的链增长自由基反应，消灭自由基，避免叶酸的氧化。本发明实施例对二丁基羟基甲苯的来源不作具体限定，其可直接从市场上购买获得，也可以通过本领域熟知的技术手段制备得到。

表面活性剂可以替代水与叶酸的亲水基团形成氢键，维持叶酸的空间结构稳定及避免凝聚。

作为优选，本发明实施例的表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠(AES)和表面活性剂S9中的至少一种。

AES为碱性阴离子表面活性剂；表面活性剂S9也称Tetronic 1307，为两性表面活性剂，其HLB值大于24，分子量为18600。AES和表面活性剂S9这两种表面活性剂具良好的有抗硬水能力和发泡能力。添加该表面活性剂的体系能获得很好的平衡表面张力和动态表面张力，提高体系的稳定性。

本发明实施例对脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠和Tetronic 1307的来源不作具体限定，其可直接从市场上购买获得，也可以通过本领域熟知的技术手段制备得到。

增效剂与抗氧化剂混合使用，可提高抗氧化效果，更好地阻止或延缓叶酸氧化，提高叶酸的稳定性并延长贮存期。

作为优选，本发明实施例的增效剂为一水柠檬酸、柠檬酸、柠檬酸二钠中的至少一种。

一水柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸二钠与二丁基羟基甲苯混合使用，均能提高二丁基羟基甲苯的抗氧化效果，且这类增效剂价格便宜，容易获得。

本发明实施例对一水柠檬酸、柠檬酸、柠檬酸二钠的来源不作具体限定，其可直接从市场上购买获得，也可以通过本领域熟知的技术手段制备得到。

作为本发明的一个优选实施方式，除了甘油、二丁基羟基甲苯、增效剂和表面活性剂，本发明实施例的组合物还包括：缓冲液和防腐剂；

其中，防腐剂为0.01～0.5份。

缓冲液可提供一个较为稳定的pH，避免叶酸的凝聚。作为优选，本发明实施例的缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液或MOPS缓冲液。

进一步优选的，当缓冲液为磷酸缓冲液时，磷酸的浓度为10～200mM；当缓冲液为Tris-HCl缓冲液时，Tris的浓度为10～200mM；当缓冲液为MES缓冲液时，MES的浓度为10～200mM；当缓冲液为HEPES缓冲液时，HEPES的浓度为10～200mM；当缓冲液为TAPS缓冲液时，TAPS的浓度为10～200mM；当缓冲液为MOPS缓冲液时，MOPS的浓度为10～200mM。当缓冲液低于10mM时或者高于200mM时，叶酸容易分解。

防腐剂对细菌和霉菌均有抑制生长作用，能够提高叶酸的稳定性。当防腐剂用量低于0.01份时，抑菌效果较差；当防腐剂用量大于0.5份时，抑制进行化学发光检测时叶酸与抗体或者结合蛋白的结合。

作为优选，本发明实施例的防腐剂为山梨酸钾、亚硝酸钠、苯甲酸钠和生物防腐剂中的至少一种。山梨酸钾、亚硝酸钠、苯甲酸钠等防腐剂为酸性防腐剂，易溶于水，具有较高的抗菌性能，可抑制霉菌的生长繁殖。使用时，这类防腐剂主要通过抑制微生物体内的脱氢酶系统，从而达到抑制微生物的生长和起防腐作用，对细菌、霉菌、酵母菌均有抑制作用；同时，山梨酸钾、亚硝酸钠、苯甲酸钠等防腐剂的最佳抑菌pH值和叶酸储存缓冲体系的pH值接近。

在本发明的一个优选实施例中，生物防腐剂为ProClin150、ProClin200、ProClin300或ProClin5000。这类防腐剂可在更长的时间内根除细菌、真菌及酵母，从而延长产品的储存时间，且适用PH范围广，无干扰性惰性物质。

将上述组合物与叶酸混合，并放置于37℃环境中一段时间，分别在第7天和第15天的时候检测混合物中的叶酸含量，发现该混合物在放置7天后其叶酸含量仅降低0.7％，在放置第15天之后其叶酸含量仅降低3.05％，因而，本发明实施例所提供的组合物可大大提高叶酸的稳定性，延长了叶酸的保存时间。

另一方面，本发明实施例还提供了一种复合校准品，包括：叶酸和叶酸保护制剂；叶酸保护制剂包括以下重量组分：

在上述技术方案中，甘油作为稳定剂，其具有保护液和脱水保护液的作用，能够对叶酸抗原起到很好的保护作用。二丁基羟基甲苯作为抗氧化剂，能够与自动氧化过程中产生的链增长自由基反应，消灭自由基，避免叶酸的氧化。表面活性剂可以替代水与叶酸的亲水基团形成氢键，维持叶酸的空间结构稳定及避免凝聚。增效剂与抗氧化剂混合使用，可提高抗氧化效果，更好地阻止或延缓叶酸氧化，提高叶酸的稳定性并延长贮存期。

因而，将上述复合校准品应用于叶酸测定试剂盒中，可提高叶酸测定试剂盒的贮存稳定性，降低成本，并在一定程度上提高叶酸检测的稳定性和灵敏度。

作为优选，叶酸和叶酸保护制剂的质量比为(0.0001～0.2):1。

当叶酸和叶酸保护制剂的质量比大于0.2:1时，叶酸溶解度差，随着储存时间的延长，或者温度的变化，溶解在叶酸保护剂的叶酸会析出结晶，影响检测的稳定性；当叶酸和所述叶酸保护制剂的质量比小于0.0001:1时，复合校准品的批间差异大，不符合质控要求。

作为优选，表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠(AES)和表面活性剂S9中的至少一种。AES为碱性阴离子表面活性剂；表面活性剂S9也称Tetronic1307，为两性表面活性剂，其HLB值大于24，分子量为18600。AES和表面活性剂S9这两种表面活性剂具良好的有抗硬水能力和发泡能力。添加该表面活性剂的体系能获得很好的平衡表面张力和动态表面张力，提高体系的稳定性。

作为优选，增效剂为一水柠檬酸、柠檬酸、柠檬酸二钠中的至少一种。一水柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸二钠与二丁基羟基甲苯混合使用，均能提高二丁基羟基甲苯的抗氧化效果，且这类增效剂价格便宜，容易获得。

作为一个优选实施方式，上述叶酸保护制剂还包括：缓冲液和防腐剂；其中，防腐剂为0.01～0.5份。

作为优选，缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液或MOPS缓冲液，可提供一个较为稳定的pH环境，避免叶酸的凝聚。

作为进一步优选的，当缓冲液为磷酸缓冲液时，磷酸的浓度为10～200mM；当缓冲液为Tris-HCl缓冲液时，Tris的浓度为10～200mM；当缓冲液为MES缓冲液时，MES的浓度为10～200mM；当缓冲液为HEPES缓冲液时，HEPES的浓度为10～200mM；当缓冲液为TAPS缓冲液时，TAPS的浓度为10～200mM；当缓冲液为MOPS缓冲液时，MOPS的浓度为10～200mM。当缓冲液低于10mM时或者高于200mM时，叶酸容易分解。

防腐剂对细菌和霉菌均有抑制生长作用，能够提高叶酸的稳定性。当防腐剂用量低于0.01份时，抑菌效果较差；当防腐剂用量大于0.5份时，抑制进行化学发光检测时叶酸与抗体或者结合蛋白的结合。

作为优选，防腐剂为山梨酸钾、亚硝酸钠、苯甲酸钠和生物防腐剂中的至少一种。其中，山梨酸钾、亚硝酸钠、苯甲酸钠等防腐剂为酸性防腐剂，易溶于水，具有较高的抗菌性能，可抑制霉菌的生长繁殖。使用时，这类防腐剂主要通过抑制微生物体内的脱氢酶系统，从而达到抑制微生物的生长和起防腐作用，对细菌、霉菌、酵母菌均有抑制作用；同时，山梨酸钾、亚硝酸钠、苯甲酸钠等防腐剂的最佳抑菌pH值和叶酸储存缓冲体系的pH值接近。

作为进一步优选的，生物防腐剂包括：ProClin150、ProClin200、ProClin300和ProClin5000中的一种。这类防腐剂可在更长的时间内根除细菌、真菌及酵母，从而延长产品的储存时间，且适用PH范围广，无干扰性惰性物质。

又一方面，本发明实施例还提供了上述组合物或上述复合校准品在叶酸检测中的应用。

上述组合物或上述复合校准品可作为叶酸测定试剂盒的一部分，主要应用于叶酸检测，进而提高叶酸测定试剂盒的贮存稳定性，降低成本，并在一定程度上提高叶酸检测的稳定性和灵敏度。其中，叶酸检测包括但不限于：微生物法、放射免疫分析法、色谱分析法、酶联免疫法、化学发光免疫分析法和色谱一质谱检测法等。

为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例组合物和复合校准品及其应用的进步性能显著地体现，以下通过实施例对本发明的实施进行举例说明。

实施例1

本实施例提供了一种叶酸保护制剂，包括以下重量组分：

在本实施例中，增效剂选为柠檬酸，表面活性剂选为Tetronic 1307；防腐剂选为山梨酸钾；缓冲液选为磷酸缓冲液，其磷酸浓度为100mM。

使用时，将叶酸与本发明实施例的叶酸保护制剂按质量比0.005:1进行混匀，得到复合校准品，并置于避光、2～8℃条件下保存。

实施例2

本实施例提供了一种叶酸保护制剂，包括以下重量组分：

在本实施例中，增效剂选为柠檬酸二钠，表面活性剂选为脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠；防腐剂选为苯甲酸钠；缓冲液选为Tris-HCl缓冲液，其中Tris浓度为150mM。

使用时，将叶酸与本发明实施例的叶酸保护制剂按质量比0.05:1进行混匀，得到复合校准品，并置于避光、2～8℃条件下保存。

实施例3

本实施例提供了一种叶酸保护制剂，包括以下重量组分：

在本实施例中，增效剂选为一水柠檬酸，表面活性剂选为脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠与Tetronic 1307的混合物；防腐剂选为生物防腐剂；缓冲液选为MES缓冲液，MES浓度为70mM。

使用时，将叶酸与本发明实施例的叶酸保护制剂按质量比0.2:1进行混匀，得到复合校准品，并置于避光、2～8℃条件下保存。

测试例1

取实施例1的复合校准品进行稳定性测试，将其置于37℃环境中一段时间，然后分别在第7天和第15天的时候检测混合物中的叶酸含量，计算其相对于原始含量的偏差(％)。

同时，取商品叶酸保护液与等量叶酸混匀作为对照品，在同等条件下进行稳定性测试。该商品叶酸保护液类似湖州英创生物科技有限公司的蛋白质稳定剂EL0002，含糖、表面活性剂和防腐剂。

检测结果如表1所示，与市场上同类保护液相比，采用本发明实施例的叶酸保护制剂的复合校准品具有很好的稳定性，说明本发明叶酸保护制剂可显著提高叶酸的稳定性。

表1

测试例2

按下述表2的配方分别制备叶酸保护液A、叶酸保护液B、叶酸保护液C和叶酸保护液D，然后将各个叶酸保护液与等量叶酸混合，进行37℃加速稳定性测试，测试结果如图1所示。

表2

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，包括以下重量组分：

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述增效剂为一水柠檬酸、柠檬酸、柠檬酸二钠中的至少一种；和/或

所述表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠和表面活性剂S9中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，还包括：缓冲液和防腐剂；

所述防腐剂为0.01～0.5份。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述防腐剂为山梨酸钾、亚硝酸钠、苯甲酸钠和生物防腐剂中的至少一种；和/或

所述缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液或MOPS缓冲液。

5.一种复合校准品，其特征在于，包括：叶酸和叶酸保护制剂；所述叶酸保护制剂包括以下重量组分：

6.根据权利要求5所述的复合校准品，其特征在于，所述叶酸和所述叶酸保护制剂的质量比为(0.0001～0.2):1。

7.根据权利要求5所述的复合校准品，其特征在于，所述增效剂为一水柠檬酸、柠檬酸、柠檬酸二钠中的至少一种；和/或

所述表面活性剂为脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠和表面活性剂S9中的至少一种。

8.根据权利要求5至7任一项所述的复合校准品，其特征在于，所述叶酸保护制剂还包括：缓冲液和防腐剂，所述防腐剂为0.01～0.5份。

9.根据权利要求6所述的复合校准品，其特征在于，所述防腐剂为山梨酸钾、亚硝酸钠、苯甲酸钠和生物防腐剂中的至少一种；和/或

所述缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、TAPS缓冲液或MOPS缓冲液。

10.权利要求1至4任一项所述的组合物或权利要求5至9任一项所述的复合校准品在叶酸检测中的应用。