CN113390843A - 一种酪蛋白-金纳米簇的制备方法及在金霉素检测中应用 - Google Patents

一种酪蛋白-金纳米簇的制备方法及在金霉素检测中应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酪蛋白‑金纳米簇的制备方法及在金霉素检测中应用，具体步骤如下：S1、称量一定量的酪蛋白，加入750μL水溶解，再加入氢氧化钠溶液调节溶液pH，37℃‑90℃水浴加热15‑20分钟，得到溶液A；S2、将氯金酸加入到步骤S1得到的溶液A中，37℃‑90℃水浴加热0‑5小时，得到溶液B；S3、将步骤2得到的溶液B，保存在4℃条件下，得到酪蛋白‑金纳米簇。本发明的荧光金纳米簇具有独特的光物理特性、制备简单、几乎无毒和优异的生物相容性，检测金霉素方法快速简单、检测灵敏度高，检测限低，是应用于生物和医学领域的理想荧光纳米材料。

Description

一种酪蛋白-金纳米簇的制备方法及在金霉素检测中应用
技术领域
本发明涉及金纳米簇合成技术领域，具体为一种酪蛋白-金纳米簇的制备方法及在金霉素检测中应用。
背景技术
酪蛋白是一种含磷钙的结合蛋白，既有亲水性氨基酸残基又有疏水性氨基酸残基的两亲性共聚物。对幼儿而言，酪蛋白既是氨基酸的来源，也是钙和磷的来源。同时，酪蛋白具有防治骨质疏松与佝偻病，调节血压，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效，还能促进常量元素如钙、镁与微量元素如铁、锌、铜等的高效吸收。酪蛋白具有多种氨基酸，尤其是含有相当多的脯氨酸残基，因而有望成为合成金纳米簇的模板。
金属纳米团簇具有类分子的性质，能够光致荧光，具有稳定性良好，合成条件温和，毒性低、生物相容性高等优点。由于蛋白质含有许多活性位点如硫醇、氨基、羧基和羟基，能聚集和还原金离子，通常以稳定剂和还原剂的形式作用于金属中心，蛋白保护的金属纳米簇在适当配体作用下表现出较强的荧光，而蛋白的二级结构和生物功能一般不会显著改变，蛋白的结构稳定可保证其荧光性能不会因发生聚集而被淬灭。制备形成的金纳米簇具有超小尺寸，荧光强且可调，斯托克斯位移较大，量子效率高，稳定性好等优点，是应用于分析和生物领域的理想荧光材料。
金霉素是一种广谱的四环素类抗生素，对革兰阳性菌和阴性菌均有抑制作用，常用做动物传染性疾病的治疗，同时也作为促进生长剂用于动物饲料中；但使用剂量不当，在动物肉、蛋、奶等食品中的残留造成了严重副作用，如环境污染、细菌产生耐药性等。但是针对金霉素的传统检测方法具有稳定性差、灵敏度低、耗时长等局限性，因而急需开发一种快捷高效的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酪蛋白-金纳米簇的制备方法及在金霉素检测中应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种酪蛋白-金纳米簇的制备方法，具体步骤如下：
S1、称量一定量的酪蛋白，加入750μL水溶解，再加入氢氧化钠溶液调节溶液pH，37℃-90℃水浴加热15-20分钟，得到溶液A；
S2、将氯金酸加入到步骤S1得到的溶液A中，37℃-90℃水浴加热0-5小时，得到溶液B；
S3、将步骤2得到的溶液B，保存在4℃条件下，得到酪蛋白-金纳米簇。
优选的，所述S1中，酪蛋白浓度为30mg ml-1。
优选的，所述S1中，加热温度为70℃，加热时间为20分钟。
优选的，所述S2中，加热温度为70℃，加热时间为3小时。
优选的，一种酪蛋白保护金纳米簇在金霉素检测中的应用，用磷酸缓冲液稀释酪蛋白-金纳米簇，加入不同浓度的金霉素混合均匀，并在室温条件下孵育，激发波长条件下，随着金霉素浓度的逐渐增加，酪蛋白-金纳米簇的荧光强度逐渐增强，实现比率型检测。
优选的，在室温条件下孵育5分钟，在360nm激发波长条件下，实现检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明以酪蛋白为模板，采用一步合成法在水溶液中制备酪蛋白-金纳米簇，具有独特的光物理特性、几乎无毒且具有优异的生物相容性。
(2)本发明制备的酪蛋白-金纳米簇，检测金霉素方法快速简单、检测灵敏度好，检测限低，是应用于生物和医学领域的理想荧光纳米材料。
附图说明
图1是酪蛋白-金纳米簇的激发光谱和发射光谱图；
图2是不同反应时间合成酪蛋白-金纳米簇的荧光光谱图；
图3是不同浓度酪蛋白条件下合成酪蛋白-金纳米簇的荧光光谱图；
图4是不同温度合成酪蛋白-金纳米簇的荧光光谱图；
图5是优化后酪蛋白-金纳米簇的形貌及尺寸分布图；
图6是加入不同浓度的金霉素后，酪蛋白-金纳米簇的荧光发射光谱图及其线性响应关系图；
图7是酪蛋白-金纳米簇的细胞毒性测试结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供如下技术方案：一种酪蛋白-金纳米簇的制备方法，包括以下步骤：
称量一定量的酪蛋白，加入750μL水溶解，加入氢氧化钠溶液，水浴条件下加热20分钟；将氯金酸加入到上述溶液中，水浴加热0分钟；利用荧光光谱仪检测产物的激发光谱和发射光谱。增加反应时间，观察不同反应时间的荧光光谱，随着反应时间的增加，荧光强度逐渐增强，反应时间为3小时荧光强度达到最强；因此选择3小时作为制备酪蛋白-金纳米簇的最佳反应时间。
称量5mg的酪蛋白，加入750μL水溶解，加入氢氧化钠溶液，水浴条件下加热20分钟；将氯金酸加入到上述溶液中，水浴加热3小时；利用荧光光谱仪检测产物的激发光谱和发射光谱。增加酪蛋白的浓度，观察荧光光谱，随着酪蛋白浓度的增加，荧光强度逐渐增强，当使用30mg ml-1的酪蛋白时，荧光强度最强；因此选择30mg ml-1的酪蛋白作为制备酪蛋白-金纳米簇的最佳浓度。
称量30mg的酪蛋白，加入750μL水溶解，加入氢氧化钠溶液，37℃水浴条件下加热20分钟；将氯金酸加入到上述溶液中，37℃水浴加热3小时；利用荧光光谱仪检测产物的激发光谱和发射光谱。增加水浴加热温度，观察荧光光谱，随着温度的增加，荧光强度逐渐增强，当温度为70℃时，荧光强度最佳；因此选择70℃作为制备酪蛋白-金纳米簇的最佳温度。条件优化后制备的酪蛋白-金纳米簇尺寸大小分布均一，其平均粒径约为3.8nm。不同浓度的酪蛋白-金纳米簇(0-1mg ml-1)对细胞几乎均无毒性。
以酪蛋白-金纳米簇为荧光探针检测金霉素
用磷酸缓冲液稀释酪蛋白-金纳米簇，加入一定量的金霉素，混合液在室温下孵育5分钟，在360nm激发波长条件下，随着金霉素浓度的逐渐增加，酪蛋白-金纳米簇的荧光强度逐渐增强。
(一)酪蛋白-金纳米簇的制备及优化
实施例一：称量30mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；第二步，加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，在70℃水浴条件下反应20分钟；第三步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中，70℃水浴加热1小时，得到酪蛋白-金纳米簇。
实施例二：称量30mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；第二步，加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，在70℃水浴条件下反应20分钟；第三步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中，70℃水浴加热2小时，得到酪蛋白-金纳米簇。
实施例三：称量30mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；第二步，加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，在70℃水浴条件下反应20分钟；第三步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中，70℃水浴加热3小时，得到酪蛋白-金纳米簇。
实施例四：称量30mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；第二步，加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，在70℃水浴条件下反应20分钟；第三步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中，70℃水浴加热4小时，得到酪蛋白-金纳米簇。
实施例五：实施例一、实施例二、实施例三、实施例四得到的酪蛋白-金纳米簇，如图二所示，在360nm激发波长下，通过比较其荧光强度，确定反应时间为3小时，酪蛋白-金纳米簇的荧光发射强度最强。
实施例六：称量5mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；第二步，加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，在70℃水浴条件下反应20分钟；第三步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中，70℃水浴加热3小时，得到酪蛋白-金纳米簇。
实施例七：称量10mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；第二步，加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，在70℃水浴条件下反应20分钟；第三步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中，70℃水浴加热3小时，得到酪蛋白-金纳米簇。
实施例八：称量20mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；第二步，加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，在70℃水浴条件下反应20分钟；第三步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中，70℃水浴加热3小时，得到酪蛋白-金纳米簇。
实施例九：实施例三、实施例六、实施例七、实施例八得到的酪蛋白-金纳米簇，如图三所示，在360nm激发波长下，通过比较其荧光强度，确定反应酪蛋白浓度为30mg ml-1时，酪蛋白-金纳米簇的荧光发射强度最强。
实施例十：称量30mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；第二步，加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，在37℃水浴条件下反应20分钟；第三步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中，37℃水浴加热3小时，得到酪蛋白-金纳米簇。
实施例十一：称量30mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；第二步，加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，在50℃水浴条件下反应20分钟；第三步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中，50℃水浴加热3小时，得到酪蛋白-金纳米簇。
实施例十二：称量30mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；第二步，加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，在60℃水浴条件下反应20分钟；第三步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中，60℃水浴加热3小时，得到酪蛋白-金纳米簇。
实施例十三：称量30mg的酪蛋白，加入750μL水溶解；第二步，加入50μL浓度为3M的氢氧化钠，在80℃水浴条件下反应20分钟；第三步，将300μL浓度为10mM的氯金酸加入到上述溶液中，80℃水浴加热3小时，得到酪蛋白-金纳米簇。
实施例十四：实施例三、实施例十、实施例十一、实施例十二、实施例十三得到的酪蛋白-金纳米簇，如图四所示，在360nm激发波长下，通过比较其各自荧光发射强度，确定反应温度为70℃时，荧光发射强度最强。
(二)酪蛋白-金纳米簇作为荧光探针检测金霉素
实施例十五：用磷酸盐缓冲液稀释酪蛋白-金纳米簇原液，然后加入终浓度为1～10μM的金霉素溶液，在室温下孵育5分钟后，用荧光光谱仪检测360nm激发波长下的荧光光谱。
(三)酪蛋白-金纳米簇的体外细胞毒性
实施例十六：将Hela细胞在96孔板中培养过夜后，用含不同浓度酪蛋白-金纳米簇(0-1mg ml-1)的培养液培养细胞24小时，每孔加入10μL噻唑兰继续培养4小时，终止培养，吸去培养液，每孔加入100μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡20分钟使结晶充分溶解，用酶联免疫检测仪在490nm处检测各样品的吸光度。
综上所述，本发明以酪蛋白为模板，采用一步合成法在水溶液中制备酪蛋白-金纳米簇，具有独特的光物理特性、几乎无毒且具有优异的生物相容性；本发明制备的酪蛋白-金纳米簇，检测金霉素方法快速简单、检测灵敏度好，检测限低，是应用于生物和医学领域的理想荧光纳米材料。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (6)

1.一种酪蛋白-金纳米簇的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
S1、称量一定量的酪蛋白，加入750μL水溶解，再加入氢氧化钠溶液调节溶液pH，37℃-90℃水浴加热15-20分钟，得到溶液A；
S2、将氯金酸加入到步骤S1得到的溶液A中，37℃-90℃水浴加热0-5小时，得到溶液B；
S3、将步骤2得到的溶液B，保存在4℃条件下，得到酪蛋白-金纳米簇。
2.根据权利要求1所述的一种酪蛋白-金纳米簇的制备方法，其特征在于：所述S1中，酪蛋白浓度为30mg ml-1。
3.根据权利要求1所述的一种酪蛋白-金纳米簇的制备方法，其特征在于：所述S1中，加热温度为70℃，加热时间为20分钟。
4.根据权利要求1所述的一种酪蛋白-金纳米簇的制备方法，其特征在于：所述S2中，加热温度为70℃，加热时间为3小时。
5.一种酪蛋白保护金纳米簇在金霉素检测中的应用，其特征在于：用磷酸缓冲液稀释酪蛋白-金纳米簇，加入不同浓度的金霉素混合均匀，并在室温条件下孵育，激发波长条件下，随着金霉素浓度的逐渐增加，酪蛋白-金纳米簇的荧光强度逐渐增强，实现比率型检测。
6.根据权利要求5所述的一种酪蛋白保护金纳米簇在金霉素检测中的应用，其特征在于：在室温条件下孵育5分钟，在360nm激发波长条件下，实现检测。
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