CN103443614A - 信号增强化合物在电化学发光检测中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用新型试剂组合物通过电化学发光来检测样品中的分析物的方法。本发明披露了用于测量电化学发光(ECL)的新型试剂组合物、试剂盒以及使用所述新型试剂组合物的电化学发光检测方法。具体而言，本发明涉及可用于所述测量中以提供改善的测定性能的新型化合物组合的用途。

Description

信号增强化合物在电化学发光检测中的用途
技术领域
本发明涉及使用新型试剂组合物通过电化学发光来检测样品中的分析物的方法。本申请披露了用于测量电化学发光(ECL)的新型试剂组合物、试剂盒和使用所述新型试剂组合物的电化学发光检测方法。具体而言，本发明涉及可用于所述测量以提供改进的测定性能的新型化合物组合的用途。
背景技术
测量电化学发光现象的方法已为人所知有些年。所述方法利用特异的金属络合物能够借助氧化实现激发态的能力，从该激发态衰退至基态，发出电化学发光。综述参见Richter,M.M.,Chem.Rev.104(2004)3003-3036。
目前，存在很多种利用电化学发光(ECL)进行分析测量的可商购仪器。可引起发出ECL的物质(ECL-活性物质)已经用作ECL标记物。ECL标记物的实例包括有机金属化合物，诸如三-联吡啶-钌(RuBpy)部分，其中金属例如是VII和VIII族金属，包括Re、Ru、Ir和Os。在ECL过程中，与ECL标记物反应的物质在本申请中称之为ECL共反应剂。用于ECL的常用共反应剂包括叔胺(例如三丙基胺(TPA))、草酸盐和过硫酸盐。光由ECL标记物或配体产生；结合试剂在结合相互作用中的参与可通过测量从ECL标记物发出的ECL来监控。作为选择，来自ECL-活性化合物的ECL信号可指示化学环境(参见例如，美国专利5,641,623和5,643,713，其描述了监控特异性ECL共反应剂的存在或破坏的ECL测定)。对于用于进行ECL测定的ECL、ECL标记物、ECL测定和仪器的更多背景知识，参见美国专利5,093,268；5,147,806；5,240,863；5,308,754；5,324,457；5,591,581；5,597,910；5,679,519；5,705,402；5,731,147；5,786,141；5,846,485；5,866,434；6,066,448；6,136,268和6,207,369以及EP0441875和公开的PCT WO97/36931；WO98/12539；WO99/14599；WO99/32662；WO99/58962；WO99/63347；WO00/03233和WO98/57154。
可商购的ECL仪器已经显示优异的性能。它们由于包括其优越的灵敏度、动态范围、精度和对复杂样品基质的耐受性等原因已经得到广泛应用。可商购的仪器使用基于流动细胞的设计，该设计具有持久可重复使用的流动细胞。
用于确定分析物的可用样品体积常常受到限制，并且越来越多的不同分析物必须从一个样品中确定出。还要求开发用于测定自动化的更快速的实验室设备和用于检测分析物的更灵敏方法。这导致需要高灵敏和特异性电化学发光测定和用于进行它们的方法。此外，还应考虑与危害安全物或者环境问题相关的改进。
然而，分析物的甚至更灵敏的检测是非常有利的。因此，本发明的目标是改进所述已知的方法和试剂组合物，其具体针对增强ECL信号和改善与电化学发光操作组合的分析物检测进行改进。期望的是，发现具有改善的电化学发光测定性能的新型信号增强试剂和/或化合物。
发明内容
本发明在一种实施方案中涉及通过电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法，包括以下步骤：a)将样品与用电化学发光基团标记的检测试剂一起孵育，b)使结合有分析物的经标记的检测试剂与不含分析物的经标记的检测试剂分离，c)将分离出的经标记的检测试剂与试剂组合物一起孵育，所述试剂组合物包含：i)至少一种共反应剂，和ii)选自式I和式II的碳酰胺(carbonic acid amide)的至少一种化合物，
式I
Figure BDA00003395690400021
式I中，R1=CH3、CH2F、CH2Cl、CH2CH3、CHClCH3、CH2CH2Cl、C(CH3)2CH3、CH2CH2CH3、CClHCH2CH3或CH2CH2CH2CH3，R2=H，且R3=H，
式II
Figure BDA00003395690400031
d)电化学触发发光的释放，以及e)确定电化学发光(ECL)信号，由此测量分析物。
本发明还涉及用于确定ECL的试剂组合物，其包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，和ii)至少一种共反应剂。
本发明还涉及试剂混合物，其包含用于确定ECL的试剂组合物，其包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，和ii)至少一种共反应剂、待研究样品和至少一种用电化学发光基团标记的检测试剂。
本发明还涉及用于测量ECL的试剂盒，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物和ii)至少一种共反应剂。
根据下面对某些优选实施方案的具体描述，将更完整地理解本发明以及其另外的目标、特征和优点。
具体实施方式
除非另外指出，本发明的实施会采用本领域技术内的分子生物学(包括重组体技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术。这类技术在以下文献中得到充分解释，诸如“Molecular Cloning:A LaboratoryManual”，第二版(Sambrook等,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编，1984)；“Animal Cell Culture”(R.l.Freshney编，1987)；“Methods inEnzymology”(Academic Press,Inc.)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等编，1987及定期更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis等编，1994)。
除非另外定义，本申请中使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。Singleton等人的Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，第2版，J.Wiley&Sons,New York(1994)；March,Advanced Organic Chemistry Reactions,Mechanisms andStructure，第4版，John Wiley&Sons,New York(1992)；Lewin,B.,Genes V,由Oxford University Press出版(1994),ISBN0-19-8542879)；Kendrew,J.等人(编)，The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell ScienceLtd.(1994),ISBN0-632-02182-9)；及Meyers,R.A.(ed.),Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers,Inc.出版(1995),ISBN1-56081-5698)向本领域技术人员提供了对本申请中使用的许多术语的一般性指导。
本申请中引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)通过引用的方式将其全部内容并入本申请。
定义
如本申请中使用的，下列每项术语在此部分中具有与其有关的含义。
冠词“一个”和“一种”在本申请中是指一个或超过一个(即至少一个)冠词语法对象。举例而言，“一个分析物”意味着一个分析物或超过一个分析物。术语“至少”用于指示任选地，可以存在一个或多个其它对象。举例而言，任选地，包含至少两个离散区域的阵列可以包含两个或更多个离散测试区。
表述“一个或多个”指1-50，优选1-20，还优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15。
“碳酰胺”及其化学结构的实例列于下表1中。
表1:碳酰胺具有以下常见结构，除非另外指出：
Figure BDA00003395690400041
Figure BDA00003395690400051
Figure BDA00003395690400061
Figure BDA00003395690400071
本申请所用的式I表示：
式I中R1=CH3、CH2F、CH2Cl、CH2CH3、CHClCH3、CH2CH2Cl、C(CH3)2CH3、CH2CH2CH3、CClHCH2CH3或CH2CH2CH2CH3，R2=H，且R3=H。
本申请所用的式II表示以下结构，称为2-吡咯烷酮，如表1中编号24所示。
本发明的实施方案可用于测试各种可能包含感兴趣的分析物或活性的样品。所述样品可以呈固体、乳液、混悬液、液体或气体形式。它们可以是，但是不限于包含以下物质的样品或者源于人或动物的样品：例如，细胞(存活或死亡)和细胞衍生产品、永生化细胞、细胞碎片、细胞级分(cell fraction)、溶胞产物、细胞器、细胞膜、杂交瘤、细胞培养上清液(包括来自抗体生成生物体如杂交瘤的上清液)、废水或饮用水、食品、饮料、药物组合物、血液、血清、血浆、头发、汗液、尿液、排泄物、粪便、唾液、组织、活组织检查、流出物、分离和/或分级的样品、分离和/或分级的液体、器官、植物、植物部分、植物副产品、土壤、水、供水、水源、从流体(气体和液体)滤出的残留物、味道平淡的低级啤酒、吸收性材料、凝胶、细胞骨架、未分级的样品、未分级的溶胞产物、细胞核、核级分、化学品、化学溶液、结构生物组分、骨骼(韧带、腱)组分、分离和/或分级的骨骼组分、头发组分和/或分离物、皮肤、皮肤样品、皮肤成分、真皮、内皮层、真核细胞、原核细胞、真菌、酵母、免疫细胞、药物、治疗药物、油、提取物、粘液、污水、环境样品、有机溶剂或空气。在一种实施方案中，样品可以进一步包括，例如，水、醇、乙腈、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基-吡咯烷酮、甲醇或其他有机溶剂。
本申请所用的“样品”针对体外评价的目的来获得。如熟练技术人员会领会的，任何所述评定都在体外进行。若样品是患者样品，则而后弃去患者样品。患者样品仅用于本发明的体外诊断方法，并且没有将患者样品的材料转移回到患者身体中。
可被测量的分析物包括但不限于，全细胞、细胞表面抗原、蛋白质复合物、细胞信号因子和/或组件、第二信使、第二信使信号因子和/或组件、亚细胞颗粒(例如细胞器或膜片段)、病毒、朊病毒、粉尘螨或其片段、类病毒、免疫因子、抗体、抗体片段、抗原、半抗原、脂肪酸、核酸(和合成类似物)、核糖体、蛋白质(和合成的类似物)、脂蛋白、多糖、抑制剂、辅助因子、半抗原、细胞受体、受体配体、脂多糖、糖蛋白、肽、多肽、酶、酶底物、酶产品、核酸加工酶(例如聚合酶、核酸酶、整合酶、连接酶、解旋酶、端粒末端转移酶等等)、蛋白质加工酶(例如蛋白酶、激酶、蛋白质磷酸酶、泛肽-蛋白质连接酶等等)、细胞代谢产物、内分泌因子、旁分泌因子、自分泌因子、细胞因子、激素、药剂、药物、治疗药物、合成有机分子、有机金属分子、镇静剂、巴比妥类药物、生物碱、甾族化合物、维生素、氨基酸、糖、凝集素、重组体或衍生蛋白、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素或样品中存在的无机分子。
全细胞可以是动物、植物或细菌的，并且可以是活的或死的。实例包括植物病原体诸如真菌和线虫。术语“亚细胞颗粒”意在包含，例如，亚细胞细胞器，如来自破坏细胞的膜颗粒、细胞壁碎片、核糖体、多酶复合物，和可源自活的生物体的其它颗粒。核酸包括，例如，染色体DNA、质粒DNA、病毒DNA，和源自多个来源的重组体DNA。核酸也包括RNA，例如信使RNA、核糖体RNA和转移RNA。多肽包括例如，酶、转运蛋白、受体蛋白，以及结构蛋白如病毒外壳蛋白。优选的多肽是酶和抗体。特别优选的多肽是单克隆抗体。激素包括例如，胰岛素和T4甲状腺激素。药物包括例如，强心苷。当然，在本发明的范围内包括在化学上与生物物质相似的合成物质，如合成多肽、合成核酸，以及合成膜、囊泡和脂质体。前述并不旨在是适用于本发明的生物物质的全面列表，而仅仅意在示例说明本发明的宽泛范围。
还通常的是，感兴趣的分析物以10-3以下的摩尔浓度存在，例如至少低达10-18的摩尔浓度。
根据本发明的术语“分析物特异性试剂”(ASR)必须理解为具有与分析物特异性结合能力的分子或生物分子(例如蛋白质或抗体)。“分析物特异性试剂”(ASR)是能用于鉴定和测量生物样本中的单独的化学物质的量的一类生物分子。ASR例如是抗体(多克隆或单克隆抗体)、特异性受体蛋白、配体、核酸序列以及类似试剂，所述类似试剂旨在通过与样本中的物质进行特异性结合或化学反应而用于诊断应用中以鉴定和定量生物样本中单独的化学物质或配体。简而言之，分析物特异性试剂是测定的活性成分。ASR将满足与分析物结合的亲合性标准以及特异性标准。
术语“抗体”以最广义使用，且明确涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段。术语“抗体”涵盖各种形式的抗体结构，包括完整抗体和抗体片段。本发明的抗体在一种实施方案中是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、源自其它动物如小鼠、山羊或绵羊的抗体、单克隆或多克隆抗体，或去T细胞抗原的抗体。抗体的基因工程例如描述于Morrison,S.L.,et al.,Proc.Natl.Acad Sci.USA81(1984)6851-6855；US5,202,238和US5,204,244；Riechmann,L.,et al.,Nature332(1988)323-327；Neuberger,M.S.,et al.,Nature314(1985)268-270；Lonberg,N.,Nat.Biotechnol.23(2005)1117-1125中。
可使用保持分析物特异性试剂的上述标准的任何抗体片段。抗体通过本领域的操作产生，例如，如Tijssen(Tijssen,P.,Practice and theory of enzymeimmunoassays,11,Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam，整本书，尤其是第43-78页)中所述的操作。此外，熟练技术人员熟知可用于特异性分离抗体的基于免疫吸附的方法。借助这些手段，抗体的品质进而其在免疫测定中的性能可得到提高(Tijssen,P.,同上，第108-115页)。
根据本发明的“检测试剂”包括用电化学发光基团标记的分析物特异性试剂(ASR)，或者用电化学发光基团标记的分析物同源物。根据测试形式，熟练技术人员已知必须选择何种检测试剂用于不同的测定形式(例如三明治式测定、双重抗原桥接测定(DAGS)、竞争测定、均相测定、非均相测定)。在非均相免疫测定中的检测试剂可以是例如抗体。本领域技术人员已知的是检测试剂可以在固相上固定化。在一种实施方案中，通过电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法可以以均相测定进行。在一种实施方案中，该方法可以以非均相测定进行。在一种实施方案中，该方法可以以三明治式测定形式进行。在一种实施方案中，该方法可以以竞争测定形式进行。还在一种实施方案中，该方法可以以双重抗原桥接测定(DAGS)形式进行。已知的免疫测定形式具体描述于书Price,C.P.and Newman,D.J.,Principles and Practiceof Immunoassay,2nd ed.(1997)中。
本申请所用术语“标记物”指任何能够产生可检测信号(无论是可见地或通过使用适合的仪器)的物质。适用于本发明的各种标记物包括但不限于色原、荧光的、化学发光的或电化学发光的化合物、催化剂、酶、酶底物、染料、胶体金属和非金属颗粒、以及有机聚合物胶乳颗粒。
术语“发光”指不从能源(例如，电磁辐射源、化学反应、机械能)的温度衍生能量的任何光发射。一般地，该来源引起原子的电子从较低的能量状态迁移到“激发的”较高能量状态；然后电子在其回落至较低能量状态时以发射光的形式释放该能量。这类光发射通常在电磁谱的可见或近可见范围中发生。术语“发光”包括但不限于这类光发射现象诸如磷光、荧光、生物发光、辐射发光、电致发光、电化学发光和热致发光。
术语“发光标记物”指生成发光信号的标记物，所述发光信号例如不从发射源的温度衍生能量的光发射。发光标记物可以是例如荧光分子、磷光分子、辐射发光分子、发光螯合剂、磷或含磷化合物或量子点。
“电化学发光测定”或“ECLA”是一种通过与检测试剂(靶分子)连接的标记物来检测结合的分析物分子的电化学测定。电极电化学启动与检测试剂连接的化学标记物的发光。通过光检测器测量由标记物发射的光，并且其指示结合的分析物分子/靶分子复合物的存在或量。ECLA方法记载于例如美国专利5,543,112；5,935,779；和6,316,607中。可以为了精确且灵敏的测量，针对不同分析物分子浓度使信号调控最大化。
在ECLA操作中，可以将微粒在样品中悬浮以有效结合分析物。例如，颗粒可以具有0.05μm-200μm、0.1μm-100μm或0.5μm-10μm的直径，和能够结合分析物分子的表面组分。在一种经常使用的ECLA系统(
Figure BDA00003395690400101
RocheDagnsotics,Germany)中，该微粒具有约3μm的直径。微粒可以由以下物质形成：交联的淀粉、葡聚糖、纤维素、蛋白质、有机聚合物、苯乙烯共聚物诸如苯乙烯/丁二烯共聚物、丙烯腈/丁二烯/苯乙烯共聚物、乙烯乙酰丙烯酸酯共聚物、氯乙烯/丙烯酸酯共聚物、惰性无机颗粒、二氧化铬、铁的氧化物、二氧化硅、二氧化硅混合物、蛋白质性物质或其混合物，包括但不限于琼脂糖珠、胶乳珠、壳芯颗粒等。优选地，微粒是单分散的，并且可以是磁性的，诸如顺磁性珠。参见例如美国专利4,628,037；4,965,392；4,695,393；4,698,302；和4,554,088。可以以范围为约1-10,000μg/ml，优选地5-1,000μg/ml的量使用微粒。
表述“感兴趣的”指应该分析或确定的可能关联的分析物或物质。
“检测”包括任何检测手段，包括直接和间接检测。术语“检测”以最广义使用，包括分析物的定性和定量测量两者，本申请中测量分析物。在一个方面，使用如本申请中描述的检测方法来鉴定样品中感兴趣的分析物的少量存在。在另一方面，可以使用所述方法来量化样品中分析物的量。
“降低”或“抑制”是与参照物相比，减少或降低活性、功能和/或量。降低或抑制意指引起优选地10%或更大，更优选地25%或更大，且最优选地50%、75%、90%、95%或更大的总体降低的能力。
"增强”例如“增强特异性信号”或者“增强ECL信号”是与参照物相比提高或提升活性、功能和/或量。提高或提升是指引起总体提高优选10%以上、更优选25%以上、最优选50%以上的能力。
术语“确定”在本申请中用于定性和定量检测分析物，并且可包括确定分析物的量和/或浓度。
术语“测量”在科学上是评估或确定数量(诸如长度或质量)相对于测量单位(诸如米或千克)的量级的过程。测量使用参照点，针对该参照点可评估其它事物。术语测量也可用于指从测量过程中获得的特异性结果(确定值)。它是比较的基础。熟练技术人员知道用于使测量信号或确定值与浓度关联的材料和方法。
根据本发明的“试剂组合物”或“ECL-试剂组合物”包括支持ECL-信号产生的试剂，例如共反应剂、用于pH控制的缓冲剂以及任选的其它组分。熟练技术人员知道电化学发光检测方法中的ECL信号产生所需的存在于试剂组合物中的组分。
本申请所用的“水溶液”是颗粒、物质或液体化合物溶于水中的均相溶液。水溶液也可包含有机溶剂。有机溶剂是本领域技术人员已知的，例如甲醇、乙醇或二甲基亚砜。如本申请所使用，还应理解水溶液可至多包含50%的有机溶剂。
在ECL过程中参与ECL标记的物质在本申请中称之为ECL“共反应剂”。用于ECL的常用的共反应剂包括叔胺(例如三丙基胺(TPA))、草酸盐和过硫酸盐。熟练技术人员知道有用于电化学发光检测方法的可用的共反应剂。
“固相”，也称为“固体支持物”，是不可溶的、官能化的聚合材料，可以对其附着或共价结合(经常经由连接基)文库成员或试剂以固定化或者容许它们由过量的试剂、可溶性反应副产物或溶剂容易地分开(通过过滤、离心、清洗等进行)。用于本发明方法的固相广泛记载于现有技术中(参见例如Butler,J.E.,Methods22(2000)4-23)。术语“固相”指非流体物质，并且包括由材料诸如聚合物、金属(顺磁性、铁磁性颗粒)、玻璃和陶瓷制成的颗粒(包括微粒和珠)；凝胶物质诸如硅胶、氧化铝凝胶和聚合物凝胶；可以由聚合物、金属、玻璃和/或陶瓷制成的毛细管；沸石和其它多孔物质；电极；微量滴定板；固体条；以及小池、管、芯片或其它分光计样品容器。测定的固相组分与测定可以接触的惰性固体表面的区别在于，“固相”在其表面上含有至少一种模块，该模块意图与捕捉抗体或捕捉分子相互作用。固相可以是固定的组分，诸如管、条、小池、芯片或微量滴定板，或者可以是不固定的组分，诸如珠和微粒。微粒也可以作为用于均相测定形式的固相。可以使用容许蛋白质和其它物质非共价或共价附着的多种微粒。这类颗粒包括聚合物颗粒诸如聚苯乙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)；金颗粒诸如金纳米颗粒和金胶体；以及陶瓷颗粒诸如硅土、玻璃和金属氧化物颗粒。参见例如Martin,C.R.等,AnalyticalChemistry-News&Features70(1998)322A-327A，其通过引用的方式并入本申请。
术语“芯片”、“生物芯片”、“聚合物芯片”或“蛋白质芯片”可交换使用，并且指在共享的基片(例如固相)上排列的大量探针、标志物或生物化学标志物的集合，所述基片可以是硅片、尼龙条、塑料条或玻璃载玻片的一部分。
方法:
在一种实施方案中，本发明涉及通过电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法，包括以下步骤：a)将样品与用电化学发光基团标记的检测试剂一起孵育，b)使结合有分析物的经标记的检测试剂与不含分析物的经标记的检测试剂分离，c)将分离出的经标记的检测试剂与试剂组合物一起孵育，所述试剂组合物包含：i)至少一种共反应剂，和ii)选自式I和式II的碳酰胺的至少一种化合物，
式I
Figure BDA00003395690400131
式I中R1=CH3、CH2F、CH2Cl、CH2CH3、CHClCH3、CH2CH2Cl、C(CH3)2CH3、CH2CH2CH3、CClHCH2CH3或CH2CH2CH2CH3，R2=H，且R3=H，
式II,
Figure BDA00003395690400132
d)电化学触发发光的释放，以及e)测定电化学发光(ECL)信号，由此测量分析物。
本发明的一方面涉及基于本发明的试剂组合物的改善的ECL方法，具体而言，特征为低检测限的ECL方法。所述试剂组合物出乎预料地增强特异性信号并降低背景信号。更具体地，本发明方法通过降低在没有ECL标记物情况下的背景电化学发光来提供在低检测水平改善的灵敏度。
本申请发明人出乎预料地发现使用来自碳酰胺的某些化合物提供大量优点，包括在ECL检测方法中改善的信号产生，进而改善的ECL测定性能。
本发明的一个特点是使用电化学发光标记物确定待研究样品中的分析物的方法，其中采用用于测量电化学发光现象的下列方法中的一种。
出乎预料的是，使用选自碳酰胺的化合物的方法比不含这些化合物的常规测试试剂发射更少的背景发光。这在低检测水平时是尤其有利的，其中提高信号与背景之比(=信噪比)大大改善了灵敏度。出乎预料地，本申请发明人发现使用本发明方法进行电化学发光检测导致ECL检测的信噪比改善10%至60%。
根据本发明的通过电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法在一种实施方案中可在水溶液中进行。
在一种实施方案中，在本发明方法中使用的碳酰胺选自乙酰胺、2-氟乙酰胺、2-氯乙酰胺、丙酰胺、2-氯丙酰胺、3-氯丙酰胺、丁酰胺和2-氯丁酰胺。
在一种优选的实施方案中，在本发明方法中使用的碳酰胺选自乙酰胺、2-氯乙酰胺、丙酰胺和丁酰胺。
在一种优选的实施方案中，在本发明方法中使用的碳酰胺选自乙酰胺、丙酰胺和丁酰胺。
在一种优选的实施方案中，在本发明方法中使用的碳酰胺的浓度为0.01M至0.25M。在一种进一步优选的实施方案中，使用的碳酰胺的浓度为0.01M至0.2M。在一种进一步优选的实施方案中，使用的碳酰胺的浓度为0.01M至0.1M。
在一种实施方案中，本发明方法特别适合于在感兴趣的样品中检测生物分子，如蛋白质、多肽、肽、肽片段、激素、肽激素、维生素、维生素原、维生素代谢物和氨基酸。
用于本发明方法的样品在一种实施方案中是液体样品，例如，全血、血清或血浆。样品，或更具体而言感兴趣的样品，在一种实施方案中，可以包含任何体液和粪便。在一种实施方案中，样品将是液体样品，如唾液、粪便提取物、尿液、全血、血浆或血清。在一种实施方案中，样品将是全血、血浆或血清。
本领域技术人员会知道在本发明方法中的步骤“a)将样品与用电化学发光基团标记的检测试剂一起孵育”和“b)使结合有分析物的经标记的检测试剂与不含分析物的经标记的检测试剂分离”可以在同一地点进行，例如在相同的反应器中进行。所述步骤(a)和(b)可以以通过控制装置控制的自动化过程进行。
非特异性样品组分和不含分析物的经标记的检测试剂可在本发明方法的步骤(b)中以分离方法除去。例如结合有分析物的和不含分析物的经标记的检测试剂可使用洗涤步骤分离。
支持分析物的电化学发光检测的其它测试组分也可用于本发明方法中。
本发明的一方面覆盖了有效防腐的需求，例如用于长期存储试剂混合物和试剂组合物。适宜的防腐剂应对ECL信号产生没有影响或者在理想的情形中对ECL信号产生有积极的影响。
作为适宜的防腐剂化合物，硼酸和/或硼酸盐鉴定为有效控制细菌和真菌生长并且出乎预料地增强了特异性ECL信号。使用包含硼酸和/或硼酸盐作为防腐剂的试剂组合物的ECL检测方法具有积极的出乎预料的作用，即增强所产生的特异性ECL信号。
在一种实施方案中，本发明涉及通过电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法，包括以下步骤：a)将样品与用电化学发光基团标记的检测试剂一起孵育，b)使结合有分析物的经标记的检测试剂与不含分析物的经标记的检测试剂分离，c)将分离出的经标记的检测试剂与试剂组合物一起孵育，所述试剂组合物包含：i)至少一种共反应剂，和ii)选自硼酸和硼酸盐的防腐剂，d)电化学触发发光的释放，以及e)测定电化学发光(ECL)信号，由此测量分析物。
在一种实施方案中，通过电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法的特征在于用于ECL信号产生的试剂组合物包含选自硼酸和硼酸盐的防腐剂，所述防腐剂的浓度为0.1%至5%，优选浓度为0.5%至4%，更优选浓度为0.5%至2%。
在一种实施方案中，通过电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法的特征在于用于ECL信号产生的试剂组合物包含硼酸作为防腐剂，所述防腐剂的浓度为0.1%至5%，优选浓度为0.5%至4%，更优选浓度为0.5%至2%。
在一种实施方案中，通过电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法的特征在于用于ECL信号产生的试剂组合物包含硼酸盐作为防腐剂，所述防腐剂的浓度为0.1%至5%，优选浓度为0.5%至4%，更优选浓度为0.5%至2%。
本申请发明人出乎预料地发现在一个试剂组合物中合并碳酰胺与硼酸和/或硼酸盐的作用的通过电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法能导致ECL检测中的信噪比的进一步改善。碳酰胺与硼酸和/或硼酸盐在一个试剂组合物中的累积作用导致ECL检测中信号产生改善至少10%、25%或50%。
在一种实施方案中，本发明涉及通过电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法，包括以下步骤：a)将样品与用电化学发光基团标记的检测试剂一起孵育，b)使结合有分析物的经标记的检测试剂与不含分析物的经标记的检测试剂分离，c)将分离出的经标记的检测试剂与试剂组合物一起孵育，所述试剂组合物包含：i)至少一种共反应剂，ii)选自式I和式II的碳酰胺的至少一种化合物，和iii)选自硼酸和硼酸盐的至少一种防腐剂，d)电化学触发发光的释放，以及e)测定电化学发光(ECL)信号，由此测量分析物。
在一种实施方案中，通过电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法的特征在于所述试剂组合物还包含洗涤剂和缓冲剂。
在一种实施方案中，通过电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法的特征在于所述试剂组合物还包含盐和/或消泡剂。
在一种实施方案中，本发明涉及进行电化学发光测定的方法，其中在本发明的试剂组合物的存在下引起电化学发光。
用于EDL免疫测定的典型ECL测量过程包括在ECL测量细胞(例如流动细胞)中液体和/或混合物的多个交换。典型的ECL测量过程由下面解释的几个步骤组成。
熟练技术人员会认识到ECL测量细胞在进行ECL检测步骤之前必须通过用本发明的试剂组合物淋洗ECL测量细胞且另外地施加电势来调理(conditioned)或再生。该步骤是使用ECL确定分析物的过程的一部分。已经在EP1051621中描述，该调理步骤期间在ECL测量细胞中测量分析物的过程中，在支持信号产生的测量电极的表面上形成一层。
对于典型的ECL测量过程，通过流体入口通道进入ECL测量细胞腔中，将试剂混合物引入洁净且经调理的ECL测量细胞中。该混合物是样品、试剂和磁性颗粒的孵育物。引入测量细胞中的所述混合物可能被本发明的试剂组合物包围，所述本发明的试剂组合物在所述混合物之前和之后流动。
在这样的ECL免疫测定中，包含用电化学荧光基团标记的并且其特征在于用于分析的复合物-分子的检测试剂通过一对特异性生物化学结合配偶体(例如链霉亲和素和生物素)与这些磁性颗粒结合。磁性颗粒例如包衣有链霉亲和素-聚合物，而生物素与复合物-分子结合。
在ECL测量细胞中，磁性颗粒和其结合的标记的复合物-分子一起在布置于所述电极附近的磁铁的磁场中被俘获至电极的表面上。在混合物的连续流动期间施加磁场，由此孵育物和/或试剂组合物通过流体出口通道从ECL测量细胞腔中排出。
在俘获磁性颗粒之后，含有ECL共反应剂的本发明试剂组合物在下一步骤中引入ECL测量细胞中，由此用所述试剂组合物洗涤磁性颗粒。该洗涤步骤是除去来自电极的所述孵育物的未结合组分，其潜在地干扰电化学反应。
而后电化学发光(ECL)信号的释放是通过施加电势而电化学引发的，由此发光强度借助光传感器检测，并且可作为处于电极表面的磁性颗粒上的经标记的复合物-分子的浓度的量度进行评价，由此该浓度再次用作样品中分析物浓度的量度。
在电化学发光检测之后，ECL测量细胞通常用洁净流体淋洗。
借助电化学发光进行检测方法的设备在实施例章节(实施例1、2或3)中有所提及，或者描述在EP1892524(A1)中。而且，所述设备可包括用于控制测量单元和/或液体容器的温度的装置。测量单元理解为其中测量电化学发光的单元。液体容器可以是储藏容器，也可以是进料装置；例如，试剂溶液用的管在测量期间包含在测量单元中。
组合物:
本发明的一方面涉及用于ECL-信号产生的改善的试剂组合物，其导致提高的信噪比。更具体地，通过降低在没有ECL标记物的情况下的背景电化学发光，本发明试剂组合物提供改善的在低检测水平时的灵敏度。出乎预料的是，包含化合物如碳酰胺的试剂组合物比不含这些化合物的常规测试试剂发射更少的背景发光。这在低检测水平时是尤其有利的，其中提高信号与背景之比(=信噪比)大大改善了灵敏度。该改善的试剂组合物包含来自碳酰胺的组的化合物以及支持产生ECL的方法的其它化合物。出乎预料地，本申请发明人发现使用本发明的试剂组合物进行电化学发光检测导致ECL检测的信噪比改善10%至60%。
本发明的一方面涉及在电化学发光测定中给出高的信号背景之比的试剂组合物。特异性信号与背景信号之间的信号差异得到提高。所述改善的性质已经通过鉴定出的ECL共反应剂、pH缓冲剂、洗涤剂和pH的有利组合(具体而言，通过使用选自碳酰胺的化合物)得到实现。
所述试剂组合物提供适于有效引起ECL标记物发射ECL和通过测量ECL而灵敏地测量ECL标记物的环境。本发明的试剂组合物可任选地包含其它组分，所述其它组分包括防腐剂、洗涤剂、消泡剂、ECL活性物、盐、用于pH控制的酸性和碱性化合物(缓冲剂)、金属离子和/或金属螯合剂。本发明的试剂组合物也可包括生物测定的成分(其在一些情形中可用ECL标记物标记)，包括结合试剂、酶、酶底物、辅助因子和/或酶抑制剂。本发明还包括包含本发明试剂组合物的测定试剂、组合物、试剂盒、系统和系统组分，以及任选的其它测定组分。本发明还包括使用本发明的试剂组合物进行ECL测定的方法。
在一种实施方案中，本发明涉及用于确定ECL的试剂组合物，其包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，和ii)至少一种共反应剂。
在一种实施方案中，试剂组合物中的碳酰胺选自乙酰胺、2-氟乙酰胺、2-氯乙酰胺、丙酰胺、2-氯丙酰胺、3-氯丙酰胺、丁酰胺和2-氯丁酰胺。
在一种优选的实施方案中，所述碳酰胺选自乙酰胺、2-氯乙酰胺、丙酰胺和丁酰胺。在进一步的实施方案中，所述碳酰胺选自乙酰胺、丙酰胺和丁酰胺。碳酰胺具有最适宜于ECL增强作用的单独的浓度。如实验中(具体而言，表2、3和4)所示，熟练技术人员知道针对在试剂组合物中的所选择的碳酰胺选择适当的浓度。熟练技术人员知道针对试剂组合物中的碳酰胺确定最适宜浓度的方法。
在一种实施方案中，所述试剂组合物包含的碳酰胺的浓度为0.01M至0.25M。在进一步的实施方案中，所述试剂组合物包含的碳酰胺的浓度为0.01M至0.2M。在进一步的实施方案中，所述试剂组合物包含的碳酰胺的浓度为0.01M至0.1M。
试剂组合物的共反应剂在一种实施方案中选自叔胺(例如三丙基胺(TPA))、草酸盐和过硫酸盐。在一种优选的实施方案中，所述共反应剂是TPA。
在存储试剂组合物时包含阻止微生物生长的防腐剂可能是有利的。另外，鉴定出适宜的防腐剂以控制细菌和真菌生长从而能够长期存储和使用所述试剂组合物。本发明的试剂组合物可另外包含一种或多种防腐剂。在本发明的一种实施方案中，试剂组合物包含防腐剂(防腐试剂)。
在一种实施方案中，本发明涉及用于确定ECL的试剂组合物，其包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，ii)至少一种共反应剂，和iii)至少一种防腐剂。
优选地，防腐剂对ECL信号产生没有影响或者有积极的影响。本领域技术人员已知噁唑烷(例如，Oxaban A或4,4-二甲基噁唑烷)、叠氮化物和相关的防腐剂是与ECL相容的。在测试试剂中通常使用0.01%至1%的噁唑烷浓度。在一种实施方案中，所述试剂组合物包含选自噁唑烷的防腐剂，优选Oxaban A。在一种实施方案中，所述试剂组合物包含的防腐剂的浓度为0.01%至1%，在另一种实施方案中所述试剂组合物包含的防腐剂的浓度为0.1%至1%。使用两种或更多种防腐剂的混合物也可能是有利的。
上文中已经提及的碳酰胺2-氯乙酰胺(CAA)除了其ECL信号增强作用之外还具有防腐剂功能。
如上所述，本发明的一方面涵盖加入对ECL信号产生没有影响或者有积极的影响的有效防腐剂的需求。作为适宜的无机化合物，硼酸和/或硼酸盐鉴定为有效控制细菌和真菌生长。出乎预料的是，本申请发明人发现在用于确定ECL的试剂组合物中存在的硼酸和/或硼酸盐对ECL信号产生没有消极影响。出乎预料地发现包含硼酸或硼酸盐作为防腐剂的试剂组合物对ECL信号产生过程具有积极作用，即提高特异性信号。此外，它们的高活性和与危害安全物或环境关注相关的低程度的问题是有利的。与试剂组合物中的一些其它常用的防腐剂相反，硼酸或硼酸盐不含卤素并且不释放出甲醛。在ECL信号产生中存在的硼酸的结果示于实施例章节例如实施例2中。
在一种实施方案中，本发明涉及用于确定ECL的试剂组合物，其包含i)至少一种共反应剂，和iii)选自硼酸和硼酸盐的至少一种防腐剂。
在一种实施方案中，本发明涉及用于确定ECL的试剂组合物，其包含i)至少一种共反应剂，和iii)防腐剂硼酸。
在一种实施方案中，本发明涉及用于确定ECL的试剂组合物，其包含i)至少一种共反应剂，和iii)防腐剂硼酸盐。
在一种实施方案中，本发明涉及用于确定ECL的试剂组合物，其包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，ii)至少一种共反应剂，iii)选自硼酸和硼酸盐的至少一种防腐剂。
在一种实施方案中，本发明的试剂组合物包含硼酸或硼酸盐作为防腐剂，浓度为0.1%至5%，优选浓度为0.5%至4%，尤其优选浓度为0.5%至2%。
在一种优选的实施方案中，本发明的试剂组合物包含硼酸作为防腐剂，浓度为0.1%至5%，优选浓度为0.5%至4%，尤其优选浓度为0.5%至2%。
在一种优选的实施方案中，本发明的试剂组合物包含硼酸盐作为防腐剂，浓度为0.1%至5%，优选浓度为0.5%至4%，尤其优选浓度为0.5%至2%。
本发明的试剂组合物任选地还包含其它测试组分。其它测试组分选自至少一种洗涤剂、至少一种信号增强化合物、包含用于pH控制的酸性和碱性试剂的缓冲剂和水。
在一种实施方案中，本发明涉及用于确定ECL的试剂组合物，其包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，ii)至少一种共反应剂，iii)至少一种防腐剂，iv)缓冲剂，v)至少一种洗涤剂，vi)盐和/或消泡剂和vii)任选的其它测试组分。
适用于本发明试剂组合物的洗涤剂是选自以下的那些：脂肪酸醇乙氧基化物，包括聚(乙二醇)醚，例如聚多卡醇或其它具有式CXEOY(X=8–18和Y=2-9)的聚(乙二醇)醚，Genapol(异十三烷基聚((乙二醇醚)n)，
Figure BDA00003395690400201
(烷基多糖苷)，辛基糖苷(辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷)以及两性离子洗涤剂如Zwittergent3-12或者它们的混合物。洗涤剂以0.01%至2%的浓度使用。可容易确定各洗涤剂的最佳浓度。最适宜的浓度是0.05%至1%的那些。
在一种实施方案中，本发明的试剂组合物包含洗涤剂，其选自聚多卡醇或其它具有式CXEOY(X=8–18和Y=2-9)的聚(乙二醇)醚，辛基糖苷(辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷)或两性离子洗涤剂如Zwittergent3-12或者它们的混合物。在一种优选的实施方案中，所述试剂组合物包含洗涤剂，其选自聚多卡醇，辛基糖苷(辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷)和Zwittergent3-12，或者它们的混合物。
进一步，电化学发光信号也可通过调节pH至6.0～8.0、优选6.0～7.5、尤其优选6.2～6.9来提高。这可通过使用本领域技术人员已知的适于该范围的pH缓冲剂来方便地进行。在一种实施方案中，适于所述试剂组合物的缓冲剂包括KOH和磷酸(H3PO4)。
更进一步地，信号可通过加入盐来增强，所述盐包括无机盐例如NaBr、NaCl、NaJ。盐(具体而言NaCl)按浓度1mM～1M、优选10mM～100mM、最优选10mM～50mM加入。
避免产生气泡或泡沫可能是有利的，尤其在HTS应用中。因此，可能期望向试剂组合物中加入消泡剂。多种商业消泡剂(包括Antifoam o-30、Antifoam204、Antifoam A、Antifoam SE-15、Antifoam SO-25和Antifoam289)可加入本发明的试剂组合物中。
本发明的试剂组合物可包括ECL标记物。所述ECL标记物可以是常规的ECL标记物。ECL标记物的实例包括三-联吡啶-钌(RuBpy)和其它有机金属化合物，其中金属例如是来自族VII和VIII的金属，包括Re、Ru、Ir和Os。本领域技术人员使用这些ECL标记物以用电化学发光基团来标记分析物特异性试剂，或者用电化学发光基团标记分析物本身。在一种实施方案中，本发明的试剂组合物包含经标记的分析物和/或经标记的分析物特异性试剂，其中ECL标记物选自US5,310,687(A)(BPRu=Ru(bpy)2-bpyCO-OSu)US2003/0124572(A1)(Sulfo-BPRu NHS酯)、EP720614(A1)(Bpy2-Ru-bpy-CO-UEEK-korks.-OSu)和WO2002/027317(A2)(BPRu-(UE)-25-K和BPRu2-SK4)中分别披露的ECL标记物。
在试剂组合物中使用的试剂及其混合物在使用前可以以液体、冷冻、深度冷冻、蒸发冷冻、冻干、气体、固体或干燥形式提供。至少在使用试剂组合物之前将试剂溶于溶剂中。本发明的试剂组合物将是水溶液。在一种优选的实施方案中，所述试剂溶于水中。
这些改善的制剂在高灵敏度测定中是尤其有价值的。在本发明的一些实施方案中，ECL测定的性能通过试剂组合物与电极组成的最佳组合得到甚至更进一步的改善。所述适宜的ECL电极组成包括Ir、Pt或碳的电极。
这些有利的组合包括前述增强ECL的碳酰胺和选自硼酸和硼酸盐的适宜防腐剂，二者均具有改善性质。这些包括使用本发明披露的试剂组合物时较高的动态范围和改善的来自结合标记物的ECL信号与ECL背景信号之比。该提高的灵敏度是重要的，例如在受益于较低检测限的测定中(例如TroponinT测定(TNThs；Order-No.:05092744)、肝炎-B包膜抗原测定(HBeAg；Order-No.:11820583)、抗-促甲状腺激素受体测定(抗-TSHR；Order-No.:04388780)-具体参见实施例章节)。
这些改善的试剂组合物制剂可给出更好的精度，这可在ECL测定中导致更低的检测限。
本发明的另一方面涉及降低成本，这是由于减少了样品、测试-特异性试剂和/或测试试剂所需的体积。较低试剂体积的信号损失可通过使用有利的本发明试剂组合物得到弥补。
本发明的又一方面涉及包含本发明试剂组合物的改善的系统和设备和/或适合于进行本发明方法的改善的系统和设备。
ECL信号产生也可在单独或者相互组合使用上述发现时得到改善。
试剂混合物:
对于确定ECL，本发明的试剂组合物可与另外的化合物混合形成试剂混合物。在一种实施方案中，本发明涉及用于确定ECL的试剂混合物，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，ii)至少一种共反应剂，iii)待研究样品和iv)至少一种用电化学发光基团标记的检测试剂。
在一种实施方案中，本发明涉及用于确定ECL的试剂混合物，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，ii)至少一种共反应剂，iii)至少一种防腐剂，iv)待研究样品和v)至少一种用电化学发光基团标记的检测试剂。
在一种实施方案中，本发明涉及用于确定ECL的试剂混合物，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，ii)至少一种共反应剂，iii)选自硼酸和硼酸盐的防腐剂，iv)待研究样品和v)至少一种用电化学发光基团标记的检测试剂。
在进一步的实施方案中，本发明涉及用于确定ECL的试剂混合物，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含i)选自硼酸和硼酸盐的防腐剂，ii)至少一种共反应剂，iii)待研究样品和iv)至少一种用电化学发光基团标记的检测试剂。在一种优选的实施方案中，所述试剂混合物包含防腐剂硼酸。在一种优选的实施方案中，所述试剂混合物包含防腐剂硼酸盐。
本发明在一种实施方案中还涉及用于确定ECL的试剂混合物，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含i)选自硼酸和硼酸盐的防腐剂，ii)至少一种共反应剂，iii)待研究样品，iv)洗涤剂，v)缓冲剂，vi)至少一种用电化学发光基团标记的检测试剂，和vii)包含盐和/或消泡剂。
在一种进一步优选的实施方案中，本发明涉及用于确定ECL的试剂混合物，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，ii)至少一种共反应剂，iii)选自硼酸和硼酸盐的防腐剂，iv)待研究样品，v)洗涤剂，vi)缓冲剂和vii)至少一种用电化学发光基团标记的检测试剂。
试剂混合物还可包含至少一种洗涤剂和用于控制pH的缓冲剂。任选地，试剂混合物可包含盐和/或消泡剂。
在试剂混合物中的其它测试组分选自未标记的分析物特异性试剂、分析物同源物、固相包衣和降低干扰的物质。
用途:
本发明的一方面涉及本发明的改善试剂组合物和/或改善试剂混合物在进行电化学发光检测方法中的用途。
在一种实施方案中，本发明涉及选自式I和式II的碳酰胺在进行电化学发光检测中的用途。在一种实施方案中，本发明涉及选自式I和式II的碳酰胺在进行电化学发光检测方法操作中的用途。
在一种优选的实施方案中，本发明涉及选自乙酰胺、2-氟乙酰胺、2-氯乙酰胺、丙酰胺、2-氯丙酰胺、3-氯丙酰胺、丁酰胺和2-氯丁酰胺的碳酰胺在进行电化学发光检测中的用途。
在另一种优选的实施方案中，本发明涉及选自乙酰胺、2-氯乙酰胺、丙酰胺和丁酰胺的碳酰胺在进行电化学发光检测中的用途。在另一种实施方案中，本发明涉及选自乙酰胺、丙酰胺和丁酰胺的碳酰胺在进行电化学发光检测中的用途。
在一种实施方案中，本发明涉及试剂组合物在确定ECL中的用途，所述试剂组合物包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，ii)至少一种共反应剂，和iii)至少一种防腐剂。
在一种实施方案中，本发明涉及试剂组合物在确定ECL中的用途，所述试剂组合物包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，ii)至少一种共反应剂，和iii)选自硼酸和硼酸盐的防腐剂。
在一种实施方案中，本发明涉及试剂组合物在确定ECL中的用途，所述试剂组合物包含i)选自碳酰胺的化合物，所述碳酰胺选自乙酰胺、2-氟乙酰胺、2-氯乙酰胺、丙酰胺、2-氯丙酰胺、3-氯丙酰胺、丁酰胺和2-氯丁酰胺，ii)至少一种共反应剂，和iii)防腐剂。
在一种实施方案中，本发明的试剂组合物适合于调理或再生ECL测量细胞和确定ECL信号。在一种实施方案中，所述试剂组合物用作调理溶液。在一种实施方案中，本发明的试剂组合物用于调理或再生ECL测量细胞。在一种实施方案中，所述试剂组合物用于调理或再生ECL测量细胞，其包含选自碳酰胺的化合物，所述碳酰胺选自乙酰胺、2-氟乙酰胺、2-氯乙酰胺、丙酰胺、2-氯丙酰胺、3-氯丙酰胺、丁酰胺和2-氯丁酰胺。在另一种实施方案中，所述试剂组合物用于调理或再生ECL测量细胞，其包含选自碳酰胺的化合物，所述碳酰胺选自乙酰胺、丙酰胺和丁酰胺。
针对用于进行电化学发光检测方法，所述试剂组合物可与另外的化合物混合形成试剂混合物，所述另外的化合物例如待研究样品、至少一种具有电化学发光基团的检测试剂以及支持该方法的下述其它组分。
在一种实施方案中，本发明涉及包含试剂组合物的试剂混合物在确定ECL中的用途，a)包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，ii)至少一种共反应剂，和iii)防腐剂，b)待研究样品，以及c)至少一种用电化学发光基团标记的检测试剂。
本发明涉及包含用于确定ECL的试剂组合物的试剂混合物在确定ECL中的用途，a)包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，ii)至少一种共反应剂，和iii)选自硼酸和硼酸盐的防腐剂，b)待研究样品，以及c)至少一种用电化学发光基团标记的检测试剂。
在进一步的实施方案中，本发明涉及硼酸或硼酸盐在进行电化学发光检测中的用途。还在一种实施方案中，本发明涉及选自硼酸和硼酸盐的防腐剂在进行电化学发光检测方法操作中的用途。
在一种实施方案中，本发明涉及试剂混合物在确定ECL中的用途，所述试剂混合物包含a)用于确定ECL的试剂组合物，其包含i)选自硼酸和硼酸盐的防腐剂和ii)至少一种共反应剂，b)待研究样品，以及c)至少一种用电化学发光基团标记的检测试剂。
此外，用于确定ECL的试剂混合物可包含选自洗涤剂和用于pH控制的缓冲剂的组分。任选地，所用的试剂混合物可包含盐和/或消泡剂。在试剂混合物中的其它测试组分选自未标记的分析物特异性试剂、分析物同源物、固相包衣和降低干扰的物质。
试剂盒:
本发明的一方面涉及在一种或多种容器中包含本发明的试剂组合物的一种或多种组分的试剂盒。这些组分可任选地与另外的试剂合并形成本发明的试剂组合物。试剂盒在一种实施方案中也可包含另外的测定相关组分诸如ECL标记物、ECL标记的测定试剂、稀释剂、洗涤溶液、蛋白质变性试剂、酶、结合试剂、测定板、可处理物，等等。
在一种实施方案中，所述试剂组合物容纳在一个或多个玻璃或塑料容器中，适当标示出关于试剂组合物内容的信息和关于正确存储和使用的说明。关于试剂组合物内容、批号、生产日期、保质期的信息和关于正确存储和使用的说明也可存储于置于玻璃或塑料容器内的RFID芯片上。在所述RFID芯片上存储的信息可通过与RFID读数器相连的天线读出并在控制装置中进一步进行处理。
在一种实施方案中，所述试剂组合物的一些或全部组分可在一种实施方案中以液体或干燥状态存储。
在一种实施方案中，本发明涉及测量ECL的试剂盒，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物和ii)至少一种共反应剂。
在一种优选的实施方案中，本发明涉及测量ECL的试剂盒，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含i)选自乙酰胺、2-氟乙酰胺、2-氯乙酰胺、丙酰胺、2-氯丙酰胺、3-氯丙酰胺、丁酰胺和2-氯丁酰胺的碳酰胺和ii)至少一种共反应剂。
在另一种优选的实施方案中，本发明涉及测量ECL的试剂盒，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含i)选自乙酰胺、2-氯乙酰胺、丙酰胺和丁酰胺的碳酰胺和ii)至少一种共反应剂。
在一种实施方案中，本发明涉及测量ECL的试剂盒，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，ii)至少一种共反应剂和iii)防腐剂。
在一种优选的实施方案中，本发明涉及测量ECL的试剂盒，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，ii)至少一种共反应剂和iii)选自硼酸和硼酸盐的防腐剂。
在另一种优选的实施方案中，本发明涉及测量ECL的试剂盒，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含i)选自乙酰胺、2-氟乙酰胺、2-氯乙酰胺、丙酰胺、2-氯丙酰胺、3-氯丙酰胺、丁酰胺和2-氯丁酰胺的碳酰胺，ii)至少一种共反应剂和iii)选自硼酸和硼酸盐的防腐剂。
在另一种优选的实施方案中，本发明涉及测量ECL的试剂盒，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含i)选自乙酰胺、2-氯乙酰胺、丙酰胺和丁酰胺的碳酰胺，ii)至少一种共反应剂和iii)选自硼酸和硼酸盐的防腐剂。
在一种实施方案中，本发明涉及测量ECL的试剂盒，其包含用于确定ECL的试剂组合物，所述试剂组合物包含至少i)选自硼酸和硼酸盐的防腐剂和ii)至少一种共反应剂。
前述的测量本身已经显著地改善了已知的操作。而且，通过合并这些测量可能进一步显著地提高分析物检测测定的灵敏度和/或动态测量范围。
提供以下实施例和图来帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中列出。应当理解，可以在不背离本发明主旨的前提下对所列的操作做出修改。
附图说明
图1：浓度为0.001M至0.25M的丙酰胺(X-轴)的测量结果；测量Δ人工测定(人工测定-测定缓冲液背景)、测定缓冲液背景和游离标记物测定的相对回收率(相对于参照物的百分数)示于Y-轴。具体参见实施例1。
图2：浓度为0.001M至1M的2-氯乙酰胺(X-轴)的测量结果；测量Δ人工测定(人工测定-测定缓冲液背景)、测定缓冲液背景和游离标记物测定的相对回收率(相对于参照物的百分数)示于Y-轴。具体参见实施例1。
图3：浓度为0.001M至1M的丁酰胺(X-轴)的测量结果；测量Δ人工测定(人工测定-测定缓冲液背景)、测定缓冲液背景和游离标记物测定的相对回收率(相对于参照物的百分数)示于Y-轴。具体参见实施例1。
图4：浓度为0.001M至1M的乙酰胺(X-轴)的测量结果；测量Δ人工测定(人工测定-测定缓冲液背景)、测定缓冲液背景和游离标记物测定的相对回收率(相对于参照物的百分数)示于Y-轴。具体参见实施例1。
图5：浓度为0至5%的硼酸(X-轴)的测量结果；人工测定用作高特异性信号的示例；TSH刻度器1作为低水平刻度器给出背景信号(TSH Cal1)；TSH刻度器2在高检测水平给出信号(TSH Cal2)。结果以未加入硼酸的参照物试剂组合物的百分数作图。具体参见实施例2。
实施例1
使用含有碳酰胺的测定缓冲液(试剂组合物)的ECL测量
ECL测量使用Roche
Figure BDA00003395690400272
2010设备进行，其中采用下述的可用于该测定的规程。
将如表2、3和4中所示浓度的选自碳酰胺的化合物加入以下测定缓冲液中：
180mM三丙基胺(TPA)
0.1%聚多卡醇
300mM磷酸盐缓冲液
最终pH使用KOH/H3PO4调节至pH6.8。测定缓冲液也可用作空白值。
将选自碳酰胺的化合物(碳酰胺的化学式示于表1中)以指定浓度加入测定缓冲液(试剂组合物)中。结果报道为相对于使用缺少这些化合物的测定缓冲液的测量的信号回收率。
进行含有表2中所示浓度的碳酰胺的测定缓冲液的测定缓冲液背景测量。低于100%的值表示以指定浓度加入所选择的碳酰胺降低了ECL背景信号。在没有ECL标记物情况下降低背景电化学发光在低检测水平时是尤其有利的，其中提高信号与背景之比(=信噪比)大大地改善了测定的灵敏度。
表2:
Figure BDA00003395690400271
Figure BDA00003395690400281
n.d.=未确定
在类似实验中，确定游离标记物的信号。游离标记物值代表包含游离ECL标记物的溶液在没有微粒的情况下(在测定缓冲液中，10nM RuBpy)产生的信号。该值相对于没有任何其它化合物的测定缓冲液以百分数列于表3中。该测定形式也称为均相测量或均相测定形式。高于100%的值表示以所选浓度加入所选择的碳酰胺增强了ECL信号。结果示于表3中。
表3:
Figure BDA00003395690400282
Figure BDA00003395690400291
n.d.=未确定
此外，确定采用包括珠的简化测定的值。该人工测定是包括RuBpy标记的微粒的用于高特异性信号的测定。该测定形式也称为非均相测量或者非均相测定形式。使用上述测定缓冲液和其它的化合物的在特异性人工测定-信号与背景信号(测定缓冲液背景)之间的差异表示为以%计的相对于没有任何其它的化合物的测定缓冲液的Δ人工测定。高于100%的值表示以所选浓度加入所选择的碳酰胺增强了ECL信号。结果示于表4中。
表4:
Figure BDA00003395690400301
n.d.=未确定
在图1中图示了如表2、3和4中所示的丙酰胺的结果。在图2中图示了如表2、3和4中所示的2-氯乙酰胺的结果。在图3中图示了如表2、3和4中所示的丁酰胺的结果。在图4中图示了如表2、3和4中所示的乙酰胺的结果。
实施例2
硼酸作为信号增强防腐剂
ECL测量使用2010设备采用下述的测定推荐规程进行。
以下ECL测定缓冲液用于确定空白值：
180mM三丙基胺(TPA)
0.1%聚多卡醇
0.1%Oxaban A
300mM磷酸盐缓冲液
向该测定缓冲液中加入如所指出的增量的硼酸。使用KOH/H3PO4将最终pH调节为pH6.8。
用含有表5中所示浓度的硼酸的测定缓冲液进行测定缓冲液背景测量。游离标记物值代表由含有游离ECL标记物的溶液在没有微粒的情况下(在测定缓冲液中，10nM RuBpy，均相测量)产生的信号，其相对于没有任何其它的化合物的测定缓冲液以%计。该人工测定是针对高特异性信号包括RuBpy标记的微粒的测定。作为商业的体外诊断测定，TSH测定(用于
Figure BDA00003395690400313
的促甲状腺激素测定；Order-No.:11731459)用于确定ΔTSH。TSH刻度器1(TSH Cal set；Order-No.:04738551)作为低水平刻度器(不存在分析物)，用于TSH测定中给出背景信号(TSH Cal1)；TSH刻度器2用于TSH测定中给出高信号值(TSH Cal2)。
人工测定、TSH Cal1和TSH Cal2的结果描绘在图5中，作为未加入硼酸的参照物测定缓冲液的相对回收率(以%计)。
具体而言，进行以下测量。
表5:
Figure BDA00003395690400311
在测定缓冲液中加入硼酸作为防腐剂改善了特异性非均相信号，在人工测定中和在确定TSH Cal2中尤其如此。
实施例3
含有丙酰胺和硼酸的测定缓冲液对
Figure BDA00003395690400314
测定的较低检测限的影响
确定几种商业体外测定(HBeAg:Roche Order-No.:11820583，抗-TSHR:Roche Order-No.:04388780，TNThs:Roche Order-No.:05092744)的较低检测限以比较两种测定缓冲液制剂。
测定缓冲液A:
180mM TPA、0.1%聚多卡醇、300mM磷酸盐缓冲液、0.1%Oxaban A
测定缓冲液B:
180mM TPA、0,1%聚多卡醇、50mM丙酰胺、300mM磷酸盐缓冲液、1%硼酸
测定缓冲液A和B的最终pH使用KOH/H3PO4调节至pH6.8。
已经分析了上述三种商业可得的测定，以显示碳酰胺即丙酰胺和防腐剂即硼酸对检测非常低的分析物浓度的测定性能的影响。
测定在
Figure BDA00003395690400321
分析仪上测量并如其包装插件中所述进行校准。为了计算较低检测限，确定没有分析物(HBeAg,抗-TSHR)或者具有极低分析物浓度(TNThs)的样品的信号。计算21样本(21-fold)确定的标准偏差，乘以2(2SD)或3(3SD)，并与信号的均值相加(HBeAg,TNThs)或者相减(抗TSHR,竞争测定)。然后使用各测定的校准曲线来确定计算信号的对应浓度。对于具有低分析物浓度的样品(TNThs)，样品的分析物浓度从这些计算浓度中减去。
这3种测定受益于含有碳酰胺以及含有硼酸(硼酸也具有防腐剂功能)的本发明的改善试剂组合物。HBeAg、抗-TSHR和TNThs测定的结果分别示于表6、7和8中。
表6:
Figure BDA00003395690400322
表7:
Figure BDA00003395690400323
表8:
Figure BDA00003395690400331

Claims (15)

1.通过电化学发光检测来测量样品中的分析物的方法，包括以下步骤：
a)将样品与用电化学发光基团标记的检测试剂一起孵育，
b)使结合有分析物的经标记的检测试剂与不含分析物的经标记的检测试剂分离，
c)将分离出的经标记的检测试剂与试剂组合物一起孵育，所述试剂组合物包含：
i)至少一种共反应剂，和
ii)选自式I和式II的碳酰胺的至少一种化合物，
式I
式I中，R1=CH3、CH2F、CH2Cl、CH2CH3、CHClCH3、CH2CH2Cl、
C(CH3)2CH3、CH2CH2CH3、CClHCH2CH3或CH2CH2CH2CH3，
R2=H，且R3=H，
式II
Figure FDA00003395690300012
d)电化学触发发光的释放，以及
e)确定电化学发光(ECL)信号，由此测量分析物。
2.权利要求1的方法，其特征在于使用ECL测量样品中的分析物在水溶液中进行。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于所述碳酰胺选自乙酰胺、2-氟乙酰胺、2-氯乙酰胺、丙酰胺、2-氯丙酰胺、3-氯丙酰胺、丁酰胺和2-氯丁酰胺。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于所述试剂组合物包含浓度为0.01M至0.25M的碳酰胺。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于步骤1c)的试剂组合物包含防腐剂。
6.权利要求5的方法，其特征在于步骤1c)的试剂组合物包含浓度为0.1%至5%的防腐剂。
7.权利要求5或6的方法，其特征在于步骤1c)的试剂组合物包含选自硼酸和硼酸盐的防腐剂。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于步骤1c)的试剂组合物包含洗涤剂和缓冲剂。
9.权利要求8的方法，其特征在于步骤1c)的试剂组合物还包含盐和/或消泡剂。
10.用于确定ECL的试剂组合物，其包含：
i)选自式I和式II的碳酰胺的化合物，和
ii)至少一种共反应剂。
11.权利要求10的试剂组合物，其特征在于所述试剂组合物还包含选自硼酸和硼酸盐的防腐剂。
12.用于确定ECL的试剂混合物，其包含权利要求10或11的试剂组合物、待研究的样品和至少一种用电化学发光基团标记的检测试剂。
13.权利要求10或11的试剂组合物在确定ECL中的用途。
14.选自式I和式II的碳酰胺在进行电化学发光检测操作中的用途。
15.测量ECL的试剂盒，其包含权利要求10或11的试剂组合物。
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