CN108375571A - 一种用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂及试剂盒，所述磁颗粒试剂包含有0.5‑1.5mg/mL链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁颗粒、0.5‑5mg/mL蛋白、0.5‑10mg/mL氯乙酰胺类蛋白保护剂、1‑10mg/mL防腐剂、5‑10mg/mL多羟基化合物、1‑5mg/mL表面活性剂的缓冲液，所述多羟基化合物为多元醇或多糖，所述表面活性剂为Brij35、TX‑100、平平加O‑20中的至少一种，本发明的磁颗粒试剂可使磁颗粒长期稳定、均匀地分散，且在高温等不利环境下能保存链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体以及蛋白的活性和稳定性，使化学发光免疫分析的化学发光值大，重复性好，背景值小。

Description

一种用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂及试剂盒，属于化学发光免疫分析技术领域。
背景技术
近年来，在免疫分析领域中免疫分析方法多种多样，其中磁微粒化学发光免疫分析法是将化学发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术，它具有选择性好、灵敏度高、特异性强、无放射性危害、分析速度快、设备简单等优点，在环境、临床、食品、药物检测等领域得到了广泛应用，成为免疫分析方法的研究热点和发展趋势。
目前磁微粒化学发光免疫检测试剂盒已广泛应用于市场，但现有试剂盒的磁颗粒试剂在高温等不利环境下的稳定性差，磁颗粒易聚集而又无法快速混匀，导致化学发光免疫检测实验的检测结果发光值小、重复性差、背景值高，且磁颗粒试剂的实际消耗多，使用成本相对增加，不便于临床样本的检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：为解决现有用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂高温等不利环境下的稳定性差，磁颗粒易聚集而又无法快速混匀的技术问题，提供一种用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂及试剂盒。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂，包含有0.5-1.5mg/mL 链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁颗粒、0.5-5mg/mL蛋白、0.5-10mg/mL氯乙酰胺类蛋白保护剂、1-10mg/mL防腐剂、 5-10mg/mL多羟基化合物、1-5mg/mL表面活性剂的缓冲液，所述多羟基化合物为多元醇或多糖，所述表面活性剂为十二烷基聚乙二醇醚 (Brij35)、聚乙二醇对异辛基苯基醚(TX-100)、月桂醇聚氧乙烯醚(平平加O-20)中的至少一种。
优选地，所述多元醇为丙三醇、山梨醇或聚乙二醇中的至少一种，所述聚乙二醇优选为PEG8000、PEG10000、PEG20000中的一种。
优选地，所述多糖为果糖、蔗糖、海藻糖中的至少一种。
优选地，所述氯乙酰胺类蛋白保护剂为氯乙酰胺、二氯丙烯胺、解草酮中的至少一种。
优选地，所述链霉亲和素包被的磁颗粒为包裹有葡聚糖的Fe3O4纳米颗粒，粒径大小为0.1-5μm。
优选地，所述防腐剂为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、NaN3或 proclin300，所述防腐剂的毒性低，能有效控制试剂中细菌、真菌和酵母菌等微生物的生长。
优选地，所述缓冲液为50-100mM、PH为7.2-7.6的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液或三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液。
优选地，所述蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白(Casein)、明胶(Gelatin)中的至少一种。
本发明还提供一种含有上述磁颗粒试剂的化学发光免疫检测试剂盒，所述试剂盒还包括标记生物素或异硫氰酸荧光素的抗待测抗原抗体溶液，化学发光标记物标记的抗待测抗原抗体溶液，化学发光底物液，清洗液。
本发明的有益效果是：
本发明的磁颗粒试剂可使链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁颗粒在长期放置后稳定、均匀地分散而不易聚集，在应用于化学发光免疫分析时可以将磁颗粒被磁力快速吸附，且对链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁颗粒具有良好的保存效果，能在高温等不利环境下能保持链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体以及蛋白的活性和稳定性，使化学发光免疫分析的化学发光值大，重复性好，背景值小，具体是：
(1)多羟基化合物可与链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体形成氢键，降低链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁颗粒吸附于器壁表面而造成的磁颗粒聚集，多羟基化合物与表面活性剂的配合使用可将链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁颗粒有效地包裹起来，稳定、均匀地分散于试剂中，从而提高磁颗粒试剂保存稳定性和分散性。
(2)多羟基化合物与蛋白配合，可以对磁颗粒的表面活性位点起到良好的封闭效果，降低化学发光标记物标记抗体的非特异性吸附，从而降低了背景值。
(3)氯乙酰胺类蛋白保护剂可以有效地保护链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体的活性位点，还可进一步保证蛋白活性，避免高温运输等不利环境因素导致的链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体以及蛋白的变性，多羟基化合物可进一步避免高温运输导致的链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体以及蛋白的变性。
另外，本发明还提供一种含有上述磁颗粒试剂的化学发光免疫检测试剂盒，使用的有效时间长，成本低，检测结果的精密度和灵敏度高，特异性好，适于临床检测的应用。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明实施例11的磁颗粒试剂中磁颗粒的沉淀情况图；
图2是本发明对比例1的磁颗粒试剂中磁颗粒的沉淀情况图；
图3是本发明对比例2的磁颗粒试剂中磁颗粒的沉淀情况图；
图4是本发明对比例3的磁颗粒试剂中磁颗粒的沉淀情况图。
具体实施方式
现对本发明作进一步详细的说明。
实施例1-11和对比例1-4
实施例1-11和对比例1-4提供了用于化学发光免疫检测的链霉亲和素包被的磁颗粒试剂，所述磁颗粒试剂含有如下含量的组分：
效果例1
将上述实施例1-11和对比例1-4的磁颗粒试剂均分成两份，分别置于4℃和37℃环境下保存72h后，利用上述磁颗粒试剂，采用 AE-180全自动化学发光分析仪检测血样中甲胎蛋白的发光情况，实验步骤如下：
S1：将50μL血样和100μL浓度为0.4mg/L的标记生物素的抗甲状腺球蛋白抗体溶液反应10分钟，形成抗原-抗体复合体；
S2：加入20μL浓度为0.8mg/L的磁颗粒试剂，与S1的抗原-抗体复合体反应10分钟后，形成磁性抗原-抗体复合体悬浮液；
S3：将S2的磁性抗原-抗体复合体悬浮液置于磁场内，洗涤所述磁性抗原-抗体复合体；
S4：将S3的洗涤后的磁性抗原-抗体复合体与150μL浓度为 0.1mg/L的吖啶酯标记的抗甲状腺球蛋白的第二抗体(二抗)溶液反应20分钟后，形成抗原-抗体-二抗磁性复合物悬浮液；
S5：将S4的磁性复合物悬浮液置于磁场内，洗涤所述磁性复合物；
S6：向S5洗涤后的磁性复合物中注入150μL化学发光激发液A (0.1M硝酸和1g/100mL过氧化氢)，1.5秒后，注入150μL化学发光激发液B(0.25M氢氧化钠和0.1g/100tritonx-100)，收集5秒内的化学发光光子强度，发光情况如表1。
表1利用不同磁颗粒试剂检测血样中甲胎蛋白的发光情况
备注：上述每个试验结果为重复测定样本10次的结果平均值。
由上表结果可知：(1)多羟基化合物与表面活性剂的配合使用可使链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁颗粒稳定、均匀地分散于试剂中，使得本发明的磁颗粒试剂(实施例1-11)应用于化学发光免疫分析的发光值大，重复性好，对比例1与实施例11的区别在于无多羟基化合物与表面活性剂，对比例2与实施例11的区别在于无多羟基化合物，对比例3与实施例11的区别在于无表面活性剂，实施例11和对比例1-3的对比结果进一步印证了多羟基化合物与表面活性剂对磁颗粒分散的协同作用；(2)氯乙酰胺类蛋白稳定剂可以有效地保护链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体的活性位点，避免高温等不利环境因素导致的链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体的变性，对比例4与实施例11的区别在于无氯乙酰胺类蛋白稳定剂，实施例11的磁颗粒试剂置于4℃和37℃环境下保存72h后的发光值差别不大，而对比例4的磁颗粒试剂置于37℃环境下保存72h后比置于4℃下保存72h后的发光值降低很多，对比结果进一步印证了高温下氯乙酰胺类蛋白稳定剂对链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体的活性的保护作用。
效果例2
将实施例1-11以及对比例1的磁颗粒试剂于37℃环境下保存72h 后，通过效果例1的化学发光免疫分析方法检测甲状腺球蛋白阴性血样及甲状腺球蛋白浓度为20IU/mL、60IU/mL、200IU/mL、600IU /mL、2000IU/mL血样的发光值，结果见表2。
表2不同磁颗粒试剂检测不同浓度甲状腺球蛋白血样的发光值
由上表结果可知：本发明的磁颗粒试剂(实施例1-11)即使在高温运输后，应用于化学发光免疫分析的也能达到背景值小，发光值大，线性关系好的效果，使得测定结果的准确度高；通过实施例与对比例 1-4的对比可以看出：(1)多羟基化合物与表面活性剂配合使用才可使链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁颗粒稳定、均匀地分散于试剂中，使磁颗粒试剂应用于化学发光免疫分析时的线性关系好；(2)多羟基化合物与蛋白配合可以有效降低发光背景值，若无多羟基化合物则对磁颗粒的表面活性位点的封闭效果欠佳，背景值明显升高；(3)氯乙酰胺类蛋白保护剂可以有效地保护链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体的活性位点，还可避免高温运输等不利环境因素导致的链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体以及蛋白的变性，若无氯乙酰胺类蛋白保护剂则会使磁颗粒试剂在高温运输后应用于化学发光免疫分析时的线性关系差，背景值高。
效果例3
将上述实施例1-11和对比例4的磁颗粒试剂自然混匀后，静置 120min，显微镜下观察磁颗粒试剂中磁颗粒的沉淀情况，结果实施例 1-11的磁颗粒试剂均无沉淀现象，对比例1有明显的沉淀现象，对比例2和对比例3的沉淀现象不如对比例1明显，实施例11、对比例1、对比例2和对比例3的磁颗粒试剂中磁颗粒的沉淀情况依次见图1、图2、图3和图4，由此可见，只有多羟基化合物与表面活性剂的配合使用才可使链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁颗粒稳定、均匀地分散于试剂中。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (9)

1.一种用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂，其特征在于，包含有0.5-1.5mg/mL链霉亲和素或抗异硫氰酸荧光素抗体包被的磁颗粒、0.5-5mg/mL蛋白、0.5-10mg/mL氯乙酰胺类蛋白保护剂、1-10mg/mL防腐剂、5-10mg/mL多羟基化合物、1-5mg/mL表面活性剂的缓冲液，所述多羟基化合物为多元醇或多糖，所述表面活性剂为十二烷基聚乙二醇醚(Brij35)、聚乙二醇对异辛基苯基醚(TX-100)、月桂醇聚氧乙烯醚(平平加O-20)中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂，其特征在于，所述多元醇为丙三醇、山梨醇或聚乙二醇中的至少一种，所述聚乙二醇优选为PEG8000、PEG10000、PEG20000中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂，其特征在于，所述多糖为果糖、蔗糖、海藻糖中的至少一种。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂，其特征在于，所述氯乙酰胺类蛋白保护剂为氯乙酰胺、二氯丙烯胺、解草酮中的至少一种。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂，其特征在于，所述链霉亲和素包被的磁颗粒为包裹有葡聚糖的Fe3O4纳米颗粒，粒径大小为0.1-5μm。
6.根据权利要求1-5任一项所述的用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂，其特征在于，所述防腐剂为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、NaN3或proclin300。
7.根据权利要求1-6任一项所述的用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂，其特征在于，所述缓冲液为50-100mM、PH为7.2-7.6的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液或三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液。
8.根据权利要求1-7任一项所述的用于化学发光免疫检测的磁颗粒试剂，其特征在于，所述蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白(Casein)、明胶(Gelatin)中的至少一种。
9.一种含有权利要求1-8任一项所述的磁颗粒试剂的化学发光免疫检测试剂盒，所述试剂盒还包括标记生物素或异硫氰酸荧光素的抗待测抗原抗体溶液，化学发光标记物标记的抗待测抗原抗体溶液，化学发光底物液，清洗液。
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