CN101008645A - 一种检测克百威的酶联免疫试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测克百威的酶联免疫试剂盒，包括盒体和酶标板，其特征在于还包括抗克百威抗体、辣根过氧化物酶标记抗原、克百威标准溶液、底物液、底物缓冲液与终止液；所述酶标板内包被有能与抗克百威抗体特异结合的第二抗体。本发明的酶联免疫试剂盒采用第二抗体预包被酶标板，节约了克百威抗体的用量，而且克服了直接包被第一抗体不利于试剂盒长期保存的问题。另外，本发明的酶联免疫试剂盒灵敏度高、准确度高、精密度好，能用于水、土壤、农产品等样品中克百威残留的检测，操作简单、快速，能同时检测大批量的样品，成本远低于传统克百威检测方法。

Description

一种检测克百威的酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测领域，具体地说，涉及一种检测克百威的酶联免疫试剂盒。

背景技术

克百威(carbofuran，化学名2，3二氢-2，2二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯)，商品名呋喃丹，自1969年由FMC公司和Mobay化学公司开发生产后即作为一种高效、广谱的杀虫剂，广泛应用于粮食、蔬菜、水果及经济作物的害虫防治。克百威是一种胆碱酯酶抑制剂，对人和野生动物具有很高的毒性(小鼠经口LD₅₀为8mg/kg)，是蔬菜农药残留规定中不得检出的一种，但由于杀虫效果较好，目前在粮食和蔬菜上存在不合理使用的现象比较严重，对公众健康具有较大的危害。另外，克百威在酸性土壤中不易降解，极易污染土壤和地下水源，容易造成环境污染。因此，除加强克百威的使用管理，从源头控制的同时，还应加强对其的检测与监管，防止其进入食物链中。

目前，检测克百威残留的常规方法有气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)，这些方法虽然灵敏精确，但需要昂贵的专业仪器，分析费时，成本较高。而酶联免疫分析(ELISA)快速检测技术因成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低，现已成为常用的筛选方法，但目前未见克百威免疫分析试剂盒的出现。因此，开发克百威特异、灵敏，且适于现场大批量样品快速筛选的酶联免疫分析检测试剂盒对克百威残留进行监控，保障人民群众身体健康具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种高特异性、高灵敏度、操作方法简单快速、廉价高效，适合于检测环境和农产品中残留克百威的酶联免疫试剂盒。

为了实现上述目的，本发明的酶联免疫试剂盒依据如下检测原理：首先将抗抗体(第二抗体)吸附于固体载体上，然后加入人工制备的抗克百威抗体，再加入酶标抗原与待测农药，酶标抗原与待测农药竞争抗克百威抗体，待测农药含量高时，则与克百威抗体结合的酶标抗原就少，反之结合在克百威抗体的酶标抗原就多，反应后加入底物进行显色加以测定，当克百威抗体量一定时，加入的待测农药量越多，与克百威抗体结合酶标抗原就越少，发色反应减弱，抑制率增高，反之，则发色反应增强，抑制率减低，因而根据已知量的农药的标准曲线和待检样品的抑制率，再根据抑制率与农药浓度之间的半对数关系作图即得标准曲线，并推算出待测农药的浓度。

本发明合成克百威半抗原4-[〔(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基〕氨基]丁酸(BFNB)和6-[〔(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基〕氨基]己酸(BFNH)，并与载体蛋白共价偶联合成人工抗原，以人工抗原免疫兔子或小鼠，制备多克隆抗体、利用杂交瘤技术制备抗克百威的单克隆抗体或利用基因工程方法制备基因工程抗体。用辣根过氧化物酶标记半抗原。首先用抗抗体(第二抗体)预包被聚苯乙烯微孔板，1.0～3.0％脱脂奶粉进行封闭；在酶标板中加入抗克百威抗体孵育一定时间，洗涤去除游离物，先后加入待测样品(或克百威标样)与酶标抗原，克百威、酶标抗原与结合在酶标板上的抗克百威抗体竞争性结合，洗涤去除游离物，加入酶底物，酶促反应的强度与结合在抗体上的酶标抗原量成正比，与样品(或标样)中的克百威的含量成反比，从而建立克百威直接竞争酶联免疫吸附分析技术。

本发明的检测克百威的酶联免疫试剂盒，包括盒体和酶标板，包括抗克百威抗体、辣根过氧化物酶标记抗原、克百威标准溶液、底物液、底物缓冲液与终止液；所述酶标板内包被有能与抗克百威抗体特异结合的第二抗体。

上述酶标板是96孔/40孔酶标板，是聚苯乙烯微孔板，是采用包被液包被能与抗克百威抗体特异结合的第二抗体，并封闭微孔表面未吸附第二抗体的位点。

上述抗克百威抗体是多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗体。所述多克隆抗体是以人工抗原与弗氏佐剂混合乳化后免疫兔子或小鼠制备的；所述单克隆抗体是采用杂交瘤技术制备；所述基因工程抗体是采用基因工程技术制备。

上述辣根过氧化物酶标记抗原是将半抗原BFNH或BFNB与辣根过氧化物酶共价偶联而成。

上述底物液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；所述底物缓冲液为含有3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；所述终止液为1mol/L硫酸溶液。

上述将半抗原BFNH或BFNB与辣根过氧化物酶共价偶联的方法是混合酸酐法或活性酯法。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1、本发明的酶联免疫试剂盒采用第二抗体预包被酶标板，节约了克百威抗体的用量，而且克服了直接包被第一抗体不利于试剂盒长期保存的问题。3、本发明的酶联免疫试剂盒采用高亲合力、高特异性的抗克百威抗体，提高了检测的灵敏度、准确度、精密度，该试剂盒对克百威线性检测范围为0.001～10mg/L，最低检测限为1ng/mL。2、本发明的酶联免疫试剂盒能用于水、土壤、农产品等样品中克百威残留的检测，操作简单、快速，能同时检测大批量的样品，成本远低于传统克百威检测方法，适用于农药克百威残留现场监控的痕量分析，具有重要现实意义。

附图说明

图1为标准曲线；

图2为试剂盒的直观示意图。

其中，图1中，1：酶标记抗原溶液；2：底物缓冲液；3：包被好第二抗体的微孔板；4：克百威标准溶液；5：使用说明书；6：克百威抗体溶液；7：底物液；8：终止液。

具体实施方式

实施例1克百威酶联免疫试剂盒样品的配制

1、缓冲液的配制缓冲液(pH7.4PBST)KH₂PO₄ 0.4g，Na₂HPO₄·12H₂O 5.8g，NaCl 16g，KCl 0.4g，Tween-20 0.05％1mL，加蒸馏水至2000mL。

2、封闭液的配制脱脂奶粉1.0～5.0g溶于100mL蒸馏水。

3、底物液的配制30％过氧化氢30μL溶于19mL的显色液(pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液0.2M Na₂HPO₄ 25.7mL，0.1M柠檬酸24.3mL，加蒸馏水50mL)中，4℃保存。

4、底物缓冲液的配制邻苯二胺OPD80mg溶于10mL底物液中，4℃保存。

5、微孔板的包被第二抗体用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(含1～2g碳酸钠和2～4g碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成0.5～5ug/mL，在酶标板的每孔加100uL，4℃下包被过夜或37℃包被2h，倾去包被液，用PBST洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入200uL1.0～5.0％脱脂奶粉，放入37℃温箱中1h后用PBST洗涤3次，拍干后干燥保存。

6、克百威标样溶液的配制准确称取克百威标样10mg，溶于0.1L缓冲液中，然后用缓冲液10倍梯度稀释分别配制10mg/L、1mg/L、0.1mg/L、0.01mg/L、0.001mg/L克百威溶液，另外缓冲液配制0mg/L对照样，4℃保存。

7、抗体溶液的制备用缓冲液适当稀释克百威抗体，4℃保存备用。

8、酶标抗原的制备：

利用混合酸酐法，HRP标记半抗原4-[〔(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基〕氨基]丁酸(BFNB)，具体方法为：

①称取10mg的HRP(250nmol)于玻璃容器中，用0.5mL的去离子水溶解，加入2μL双蒸的三正丁胺(或N-乙基吗啉)，485μL的DMF，轻轻混匀，冰浴保存。

②称取一定量的半抗原，加入275μL DMF溶解，加入1.2摩尔比的三正丁胺(或N-乙基吗啉)，加入1.2摩尔比的氯甲酸异丁酯，活化2～5min。

③将活化产物加入到HRP溶液中，控制半抗原与HRP的摩尔比为2∶1，冰浴反应1h，不时摇荡一下。

④将反应物过Sephadex G25柱(1cm×45cm)，用0.1M、pH7.0、含0.15M NaCl的PBS缓冲液洗脱，收集蛋白峰，分装冻存备用。

9、试剂分装各种试剂按要求配制，测定合格后无菌分装。克百威抗体6mL/瓶，克百威标样1mL/瓶，酶标抗原6mL/瓶，底物液7mL/瓶，底物缓冲液7mL/瓶，终止液7mL/瓶。分装后贴标签，注明批号和有效期，4℃保存，试剂盒见图2。

10、试剂盒的组装分别将可拆卸包被好第二抗体的微孔板1块，抗克百威抗体、酶标抗原、底物缓冲液、底物液、终止液各1瓶，克百威标样溶液6瓶，使用说明书1份置试剂盒内指定位置。试剂盒检验合格后封装，4℃保存。参照说明书普通人员就可使用该试剂盒用于农产品与环境中残留克百威的快速检测。

实施例2检测样品的前处理：

水样：过滤后即可取样进行ELISA分析。

土样：取10g土壤用20～40mL甲醇提取三次，合并提取液，浓缩，然后用PBST稀释定容至10mL，进行ELISA分析。

蔬菜样品：取蔬菜样品用粉碎机绞碎后称取10g，20～40mL甲醇提取三次，合并提取液，浓缩，用PBST定容至10mL，取样进行ELISA分析。

血液：取人体血液，加抗凝素后直接用ELISA法进行分析。

洗胃液(2％碳酸氢钠溶液)：取10mL洗胃液，用稀HCl调PH值到中性后即可用ELISA法进行分析。

呕吐物：取样品研碎，离心取上清用ELISA法进行分析。

实施例3检测方法

试剂盒操作过程如下：取出一块包被有第二抗体的酶标板，恢复到室温后备用；加入100uL克百威抗体到各自孔中，37℃孵育0.5h，洗板，加入50uL一系列浓度的克百威标样和50uL酶标抗原进行竞争反应，37℃孵育1h，洗板，OPD 37℃避光显色15min，硫酸终止，酶标仪490nm测定结果。

以所获样品吸光值的平均值计算抑制率，抑制率的计算公式为：

其中，Amax为不加农药时的吸光值，Ax为农药浓度为x时的吸光值，Amin为空白对照孔的吸光值。

以抑制率为纵坐标，克百威浓度(mg/L)的半对数为横坐标绘制标准曲线，校正曲线在0.001～10mg/L范围内为线性，求出直线方程，对应样品的浓度可以根据方程求出。

实施例4保存期试验

将试剂盒放置于4℃，分别取0、10、20、30、60、90、120、150和180d的试剂盒，以最佳抗体、酶标抗原工作浓度为测定浓度，对克百威标准样品(0.001mg/L)进行检测，测定结果如表1。

表1试剂盒保存期试验结果

时间(d)

0

10

20

30

60

90

120

150

180

吸光度值(OD490nm)

1.145

1.134

1.125

1.132

1.121

1.108

1.085

1.058

1.023

从结果可看出，试剂盒在4℃下至少可保存6个月以上。

实施例5试剂盒灵敏度测定

利用克百威标样溶液进行反应，根据实验结果绘制标准曲线(图1)，由图1可得：直线方程为y＝11.453x+63.267，抑制率(B/B0)与克百威浓度的对数值在浓度0.001～10mg/L范围内呈显著的线性关系，相关系数为R²＝0.9891，且最低检出限为0.001mg/L。

实施例6回收率实验

取三个浓度的克百威标样，添加到样品中，每个浓度设6个重复，进行测定。

试剂盒回收率的结果如下，水为95.20％～103.14％，土壤为90.17％～107.32％，蔬菜为95.25％～101.24％，中毒样品(定性检验)为52.48％～91.04％。

实施例7准确度试验精密度实验

取三个浓度的克百威标样，添加到样品中，每个浓度设6个重复，分别在6天进行测定。结果如下，水的变异系数均低于5.94％，土壤的变异系数均低于5.56％，蔬菜的变异系数均低于4.43％，中毒样品的变异系数均低于8.14％。

Claims (8)

1、一种检测克百威的酶联免疫试剂盒，包括盒体和酶标板，其特征在于还包括抗克百威抗体、辣根过氧化物酶标记抗原、克百威标准溶液、底物液、底物缓冲液与终止液；所述酶标板内包被有能与抗克百威抗体特异结合的第二抗体。

2、根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标板是96孔/40孔酶标板。

3、根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述酶标板是聚苯乙烯微孔板，是采用包被液包被能与抗克百威抗体特异结合的第二抗体，并封闭微孔表面未吸附第二抗体的位点。

4、根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述抗克百威抗体是多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗体。

5、根据权利要求4所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述多克隆抗体是以人工抗原与弗氏佐剂混合乳化后免疫兔子或小鼠制备；所述单克隆抗体是采用杂交瘤技术制备；所述基因工程抗体是采用基因工程技术制备。

6、根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记抗原是将半抗原BFNH或BFNB与辣根过氧化物酶共价偶联而成。

7、根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述底物液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；所述底物缓冲液为含有3355-四甲基联苯胺(TMB)或邻苯二胺(OPD)的pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液；所述终止液为1mol/L硫酸溶液。

8、根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述将半抗原BFNH或BFNB与辣根过氧化物酶共价偶联的方法是混合酸酐法或活性酯法。

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