CN108181462A - 一种多颜色可视化快速检测海产品中石房蛤毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种多颜色可视化快速检测海产品中石房蛤毒素的方法，针对海产品中微量石房蛤毒素的现场快速、低成本和高通量检测和筛查的技术难题，开发了一种基于纳米金棒和抗体竞争识别、多颜色区别可视化快速检测海产品中石房蛤毒素（STX）的新方法，为海产品中石房蛤毒素的现场快速、低成本和高通量检测和筛查提供一种更加可靠和灵敏的检测手段。所建立的可视化检测方法具有较高的灵敏度、良好的稳定性和选择性、分析时间短、高通量、不需要大型仪器等明显优势，克服了传统石房蛤毒素检测耗时长、费用高、且需要大型仪器等缺点。

Description

一种多颜色可视化快速检测海产品中石房蛤毒素的方法
技术领域
本发明具体涉及一种多颜色可视化快速检测海产品中石房蛤毒素的方法，属于石房蛤毒素检测领域。
背景技术
水环境的富营养化污染会引发藻类的大量繁殖产生赤潮现象，大量繁殖的藻类中有些藻类比如甲藻或硅藻或菌类会分泌出藻毒素，统称贝毒。而水环境的中的生物比如贝类或鱼类通过摄食这些藻类会积累贝毒，并通过食物链对人体造成伤害。贝类毒素可分为麻痹性贝毒（PSP）、神经性贝毒（NSP）、腹泻性贝毒（DSP）、西加鱼毒（CFP）、记忆缺失性贝毒（ASP）和氨代螺旋酸贝类毒（AZP）。这些毒素具有热稳定性，不能被正常的烹饪或加热破坏。麻痹性贝类毒素（PSP）是由特定类型的浮游植物产生的强力神经毒素，在所有的海洋藻毒素中，麻痹性贝类毒素（PSP）是世界上分布最广泛的毒素之一，严重危害了海产品养殖业的健康发展。石房蛤毒素（STX）是已知麻痹性贝类毒素中毒性最强的毒素，它的毒性高，通过阻断Na+通道从而阻断神经冲动的传导并导致一系列神经障碍症状，甚至导致死亡。所以，欧盟和美国食品药物管理局（FDA）对海产品中的石房蛤毒素的限量标准是40-80µg/100g（0.4-0.8 ppm）。在我们国家东南沿海地区时有因食用被贝毒污染的海鲜而引起的石房蛤毒素中毒事件发生，给人的健康带来极大风险，至2013年已经有50000名中毒受害者。因此，对海产品中的石房蛤毒素（STX）的含量进行检测对人类健康和环境安全具有重要的意义。
目前检测石房蛤毒素（STX）的方法主要有毛细管电泳、体外细胞测定、液相色谱串联质谱、小鼠实验测定、表面增强拉曼光谱和表面等离子体共振等。但是这些方法都需要比较昂贵的大型仪器和具有娴熟技巧的专业人员、耗时较长、耗费比较高，无法用于海产品中石房蛤毒素（STX）的现场快速检测。近年，也有一些电化学生物传感和酶链免疫（ELISA）方法被开发用于石房蛤毒素（STX）的快速检测，但是电化学生物传感稳定性和抗干扰能力差，无法在实际检测中使用。酶链免疫（ELISA）方法灵敏度较低，且存在假阳性可能，无法满足海产品中石房蛤毒素（STX）现场快速检测的实际需要。因此研发一种快速、高通量、不需要大型仪器的石房蛤毒素的特异快速检测和筛查方法，对保证海产品的安全消费具有十分重要的意义。
发明内容
本发明针对海产品中微量石房蛤毒素的现场快速、低成本和高通量检测和筛查的技术难题，开发了一种基于纳米金棒和抗体竞争识别、多颜色区别可视化快速检测海产品中石房蛤毒素（STX）的新方法，为海产品中石房蛤毒素的现场快速、低成本和高通量检测和筛查提供一种更加可靠和灵敏的检测手段。所建立的可视化检测方法具有较高的灵敏度、良好的稳定性和选择性、分析时间短、高通量、不需要大型仪器等明显优势，克服了传统石房蛤毒素检测耗时长、费用高、且需要大型仪器等缺点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明利用抗体实现对石房蛤毒素（STX）的特异识别，以纳米金棒作为颜色信号，采用竞争法建立了一种多颜色区别、可视化快速检测海产品中石房蛤毒素（STX）的新方法。方法因具有灵敏度较高、稳定性和选择性良好、分析时间短、高通量、不需要仪器和可视化等优点，可用于各种海产品中中石房蛤毒素现场快速检测和筛查。
该方法的具体步骤如下：
（1）高通量检测板的制备：在96孔酶标板的反应孔中加100微升浓度为10 ppm的羊抗兔二抗溶液（溶解于0.05 M的碳酸盐缓冲溶液，pH=9.6），在4℃下放置24小时使羊抗兔二抗包被在反应孔表面。然后弃去反应孔中的溶液，用PBST缓冲液（pH 7.4）洗涤反应孔三次。然后加入200 微升包含2wt%牛血清白蛋白的PBST缓冲液（pH=7.4）在37 ℃下进行封闭1小时，之后用PBST缓冲液（pH 7.4）洗涤三次，拍干酶标板，4℃保存待用。
（2）石房蛤毒素（STX）的多颜色区分可视化检测：在（1）所制备的酶标板反应孔中加入50微升石房蛤毒素标准溶液或样品溶液，同时加入50微升标记有辣根过氧化酶（HRP）的石房蛤毒素溶液和50微升用0.05 M的碳酸盐缓冲溶液（pH=9.6）稀释12800倍的石房蛤毒素抗体溶液，用封口膜把酶标板盖上，轻轻的震荡酶标板30秒使孔内的溶液混匀。在室温下孵育30分钟后，把封口膜取掉，将微孔中的溶液拍干，用250微升的PBST缓冲液（pH=7.4）洗板3次，拍板，去掉残留的洗液。接着，在每个反应孔中加入100微升的TMB显色液底物，用封口膜把酶标板盖上，轻轻地震荡酶标板30秒使里面的溶液混匀。不要使液体洒出，室温孵育一段时间30分钟，使HRP催化氧化TMB底物。然后加入20 微升浓度为2 M的盐酸终止反应，最后加入80微升用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）稳定的金纳米棒溶液（长60nm，宽15nm），10分钟后肉眼观察溶液的颜色，对比标准溶液对样品中石房蛤毒素（STX）的浓度进行可视化检测。
（3）海产品样品的检测：称取 0.1 g 干燥后的海产品样品，简单磨碎后，加入3 毫升80wt% 的甲醇溶液，超声提取10分钟，过滤收集滤液。残留用2毫升80wt%的甲醇重复提取1次，合并提取液（5 mL）。提取液按（2）步骤进行检测，以实现对海产品中石房蛤毒素（STX）的测定。
方法利用特异性抗体识别石房蛤毒素，样本中的石房蛤毒素与标记有辣根过氧化酶（HRP）的石房蛤毒素竞争，同包被在微孔板上的兔抗-石房蛤毒素抗体结合。兔抗-石房蛤毒素抗体与包被在微孔底部的羊抗兔二抗结合。洗板后加入TMB底物溶液，辣根过氧化酶催化TMB底物溶液氧化变为蓝色的TMB+。用盐酸溶液终止反应可是TMB+变为TMB2+。TMB2+会刻蚀金纳米棒溶液，且刻蚀的程度与TMB2+的浓度相关。刻蚀作用使得金纳米棒的横纵轴比产生变化，因而显现出不同颜色，实现石房蛤毒素的多颜色可视化检测。
本发明的显著优点在于：
（1）本发明所建立的石房蛤毒素检测方法为多颜色可视化检测方法，具有较高的灵敏度，通过裸眼观测可目视检测浓度低至0.02ng/mL。可满足实际海产品中石房蛤毒素的现场快速检测需要，无需借助仪器。
（2）操作简单，高通量、检测速度快，检测整个过程在1.5小时之内完成。检测成本低，一个样品检测成本低于2元。
（3）本发明所建立的检测方法具有良好的选择性和抗基质干扰能力，检测海产品无需复杂的前处理过程。
附图说明
图1是利用所建立的方法检测不同浓度石房蛤毒素时溶液颜色的变化图，从左至右石房蛤毒素的浓度依次为0.0，0.02，0.05，0.10，0.20和0.40 ng/mL；
图2为利用所建立的方法对贻贝和花蛤中石房蛤毒素的分析结果。
具体实施方式
实施例1
一种多颜色可视化快速检测海产品中石房蛤毒素的方法，包括如下步骤：
（1）高通量检测板的制备：在96孔酶标板的反应孔中加100微升浓度为10 ppm的羊抗兔二抗缓冲溶液，在4℃下放置24小时使羊抗兔二抗包被在反应孔表面，然后弃去反应孔中的溶液，用PBST缓冲液洗涤反应孔三次，然后加入200 微升包含2wt%牛血清白蛋白的PBST缓冲液在37 ℃下进行封闭1小时，之后用PBST缓冲液洗涤三次，拍干酶标板，4℃保存待用；
（2）石房蛤毒素的多颜色区分可视化检测：在（1）所制备的酶标板反应孔中加入50微升石房蛤毒素标准溶液或样品溶液，同时加入50微升标记有辣根过氧化酶的石房蛤毒素溶液和50微升用pH=9.6，0.05 M的碳酸盐缓冲溶液稀释12800倍的石房蛤毒素抗体溶液，用封口膜把酶标板盖上，轻轻的震荡酶标板30秒使孔内的溶液混匀，在室温下孵育30分钟后，把封口膜取掉，将微孔中的溶液拍干，用250微升的PBST缓冲液洗板3次，拍板，去掉残留的洗液，接着，在每个反应孔中加入100微升的TMB显色液底物，用封口膜把酶标板盖上，轻轻地震荡酶标板30秒使里面的溶液混匀，不要使液体洒出，室温孵育30分钟，使辣根过氧化酶催化氧化TMB底物，然后加入20 微升浓度为2 M的盐酸终止反应，最后加入80微升用十六烷基三甲基溴化铵稳定的金纳米棒溶液（长60nm，宽15nm），10分钟后肉眼观察溶液的颜色，对比标准溶液对样品中石房蛤毒素的浓度进行可视化检测；
上述步骤（1）中羊抗兔二抗缓冲溶液是将羊抗兔二抗溶解于pH=9.6，0.05 M的碳酸盐缓冲溶液中；步骤（1）和（2）中所用的PBST缓冲液的pH 均为7.4。
（3）海产品样品的检测：称取 0.1 g 干燥后的海产品样品，简单磨碎后，加入3 毫升80wt% 的甲醇溶液，超声提取10分钟，过滤收集滤液，残留用2毫升80wt%的甲醇重复提取1次，合并提取液，提取液按步骤（2）进行检测，以实现对海产品中石房蛤毒素的测定。
A.在浓度0.02-0.4ng/mL范围内取3至5个不同浓度石房蛤毒素标准溶液50微升，放在96孔酶标板第一排，按上述具体步骤（2）进行操作，裸眼观测溶液的颜色或利用数码相机记录溶液的颜色，用作比对标准。
B.水产品样品首先按上述具体步骤（3）先进行提取、过滤。然后取50微升提取液，按上述具体步骤（2）进行操作，然后裸眼观测溶液的颜色或利用数码相机记录溶液的颜色。对照上述标准石房蛤毒素溶液的颜色，通过裸眼观测对提取液中的石房蛤毒素浓度进行检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种多颜色可视化快速检测海产品中石房蛤毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）高通量检测板的制备：在96孔酶标板的反应孔中加100微升浓度为10 ppm的羊抗兔二抗缓冲溶液，在4℃下放置24小时使羊抗兔二抗包被在反应孔表面，然后弃去反应孔中的溶液，用PBST缓冲液洗涤反应孔三次，然后加入200 微升包含2wt%牛血清白蛋白的PBST缓冲液在37 ℃下进行封闭1小时，之后用PBST缓冲液洗涤三次，拍干酶标板，4℃保存待用；
（2）石房蛤毒素的多颜色区分可视化检测：在（1）所制备的酶标板反应孔中加入50微升石房蛤毒素标准溶液或样品溶液，同时加入50微升标记有辣根过氧化酶的石房蛤毒素溶液和50微升用pH=9.6，0.05 M的碳酸盐缓冲溶液稀释12800倍的石房蛤毒素抗体溶液，用封口膜把酶标板盖上，轻轻的震荡酶标板30秒使孔内的溶液混匀，在室温下孵育30分钟后，把封口膜取掉，将微孔中的溶液拍干，用250微升的PBST缓冲液洗板3次，拍板，去掉残留的洗液，接着，在每个反应孔中加入100微升的TMB显色液底物，用封口膜把酶标板盖上，轻轻地震荡酶标板30秒使里面的溶液混匀，不要使液体洒出，室温孵育30分钟，使辣根过氧化酶催化氧化TMB底物，然后加入20 微升浓度为2 M的盐酸终止反应，最后加入80微升用十六烷基三甲基溴化铵稳定的金纳米棒溶液，10分钟后肉眼观察溶液的颜色，对比标准溶液对样品中石房蛤毒素的浓度进行可视化检测；
（3）海产品样品的检测：称取 0.1 g 干燥后的海产品样品，简单磨碎后，加入3 毫升80wt% 的甲醇溶液，超声提取10分钟，过滤收集滤液，残留用2毫升80wt%的甲醇重复提取1次，合并提取液，提取液按步骤（2）进行检测，以实现对海产品中石房蛤毒素的测定。
2.根据权利要求1所述的一种多颜色可视化快速检测海产品中石房蛤毒素的方法，其特征在于，步骤（1）中羊抗兔二抗缓冲溶液是将羊抗兔二抗溶解于pH=9.6，0.05 M的碳酸盐缓冲溶液中。
3.根据权利要求1所述的一种多颜色可视化快速检测海产品中石房蛤毒素的方法，其特征在于，步骤（1）和（2）中所用的PBST缓冲液的pH 均为7.4。
4.根据权利要求1所述的一种多颜色可视化快速检测海产品中石房蛤毒素的方法，其特征在于，步骤（2）中金纳米棒的长60nm，宽15nm。
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