CN1987469A - 一种检测克百威酶联免疫分析方法 - Google Patents

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孙远明
杨金易
潘科
王弘
吴青
雷红涛
肖治理
谌国莲
沈玉栋
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Abstract

本发明公开了一种检测克百威的酶联免疫分析方法，包括：(1)合成半抗原和人工抗原；(2)制备对克百威具特异性的多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗体；(3)制备酶标抗原；(4)用第二抗体包被酶标板并封闭，加入抗克百威抗体与第二抗体反应并固定于酶标板上；(5)洗涤去除游离物，加入待测样品及酶标抗原或克百威标样及酶标抗原；(6)洗涤去除游离物，加入酶的底物和显色剂，酶促显色反应的强度与结合在抗体上的酶标抗原量成正比，与样品或标样中克百威的含量成反比。本发明采用第二抗体预包被酶标板，节约了克百威抗体用量，可长期保存，提高了灵敏度、准确度和精密度；检测操作简单、快速、能同时检测大批量的样品。

Description

一种检测克百威酶联免疫分析方法
技术领域
本发明涉及酶联免疫分析方法，具体地说，涉及一种检测克百威的酶联免疫分析方法。
背景技术
克百威(carbofuran，化学名2，3二氢-2，2二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯)，商品名呋喃丹，自1969年由FMC公司和Mobay化学公司开发生产后即作为一种高效、广谱的杀虫剂，广泛应用于粮食、蔬菜、水果及经济作物的害虫防治。克百威是一种胆碱酯酶抑制剂，对人和野生动物具有很高的毒性(小鼠经口LD50为8mg/kg)，是蔬菜农药残留规定中不得检出的一种，但由于杀虫效果较好，目前在粮食和蔬菜上存在不合理使用的现象比较严重，对公众健康具有较大的危害。另外，克百威在酸性土壤中不易降解，极易污染土壤和地下水源，容易造成环境污染。因此，除加强克百威的使用管理，从源头控制的同时，还应加强对其的检测与监管，防止其进入食物链中。
目前，检测克百威残留的常规方法有气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)，这些方法虽然灵敏精确，但需要昂贵的专业仪器，分析费时，成本较高。而酶联免疫分析(ELISA)快速检测技术因成本低、操作简单、速度快、一次检测样本量大、仪器化程度低，现已成为常用的筛选方法，因此，开发克百威特异、灵敏，且适于现场大批量样品快速筛选的酶联免疫分析方法具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简单快速，适合环境和农产品中大批量检测克百威的酶联免疫分析方法。
一种检测克百威的酶联免疫分析方法，包括如下步骤：
(1)合成半抗原和人工抗原；
(2)将人工抗原免疫动物制备对克百威具特异性的多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗体；
(3)用辣根过氧化物酶标记半抗原制备酶标抗原；
(4)用第二抗体包被酶标板并封闭，加入抗克百威抗体与第二抗体反应并固定于酶标板上；
(5)洗涤去除游离物，加入待测样品及酶标抗原或克百威标样及酶标抗原；
(6)洗涤去除游离物，加入酶的底物和显色剂，酶促显色反应的强度与结合在抗体上的酶标抗原量成正比，与样品或标样中克百威的含量成反比，因而根据已知量的克百威标准曲线和待检样品的抑制率，再根据抑制率与克百威浓度之间的半对数关系作图得到标准曲线，从而推算出待测克百威的浓度。
在上述检测克百威的酶联免疫分析方法中，所述半抗原是6-[〔(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基〕氨基]己酸或4-[〔(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基〕氨基]丁酸。该半抗原是以呋喃酚与光气反应生成氯甲酸呋喃酚酯，再与氨基酸缩合合成的两种半抗原。
在上述检测克百威的酶联免疫分析方法中，所述人工抗原是半抗原与载体蛋白共价偶联合成的人工抗原。
在上述检测克百威的酶联免疫分析方法中，步骤(2)所述多克隆抗体是以人工抗原与弗氏佐剂混合乳化后免疫动物制备的；所述单克隆抗体是采用杂交瘤技术制备的；所述基因工程抗体是采用基因工程技术制备的。
在上述检测克百威的酶联免疫分析方法中，所述酶标抗原是采用混合酸酐法或活性酯法将半抗原与辣根过氧化物酶共价偶联而成。
在上述检测克百威的酶联免疫分析方法中，所述酶标板是聚苯乙烯微孔板。
在上述检测克百威的酶联免疫分析方法中，所述封闭是采用1.0～5.0％脱脂奶粉进行封闭。
本发明的检测克百威的酶联免疫分析方法的测定原理是，首先将抗抗体(第二抗体)吸附于固体载体上，然后加入人工制备的抗克百威抗体，再加入酶标抗原与待测农药，酶标抗原与待测农药竞争抗克百威抗体，待测农药含量高时，则与克百威抗体结合的酶标抗原就少，反之结合在克百威抗体的酶标抗原就多，反应后加入底物进行显色加以测定，当克百威抗体量一定时，加入的待测农药量越多，与克百威抗体结合酶标抗原就越少，发色反应减弱，抑制率增高，反之，则发色反应增强，抑制率减低，因而根据已知量的农药的标准曲线和待检样品的抑制率，再根据抑制率与农药浓度之间的半对数关系作图即得标准曲线，并推算出待测农药的浓度。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1、本发明采用第二抗体预包被酶标板，节约了克百威抗体的用量，而且克服了直接包被第一抗体不利于试剂盒长期保存的问题。2、本发明采用高特异性、高亲合力的抗克百威抗体，提高了检测的灵敏度、准确度和精密度。3、本发明的检测方法能用于水、土壤、农产品等样品中克百威残留的检测，操作简单、快速，能同时检测大批量的样品，成本远低于传统克百威检测方法，适用于农药克百威残留现场监控的痕量分析，具有重要的现实意义。
具体实施方式
实施例1
1、缓冲液的配制  缓冲液(pH7.4PBST)KH2PO4 0.4g，Na2HPO4·12H2O5.8g，NaCl 16g，KCl 0.4g，Tween-200.05％1mL，加蒸馏水至2000mL。
2、封闭液的配制脱脂奶粉3.0g溶于100mL蒸馏水。
3、底物液的配制30％过氧化氢30μL溶于19mL的显色液(pH5.0磷酸-柠檬酸缓冲液0.2M Na2HPO4 25.7mL，0.1M柠檬酸24.3mL，加蒸馏水50mL)中，4℃保存。
4、底物缓冲液的配制邻苯二胺OPD80mg溶于10ml底物液中，4℃保存。
5、微孔板的包被第二抗体用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(含2g碳酸钠和4g碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成4ug/ml，在酶标板的每孔加100ul，4℃下包被过夜，倾去包被液，用PBST洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入200ul3.0％脱脂奶粉，放入37℃温箱中1h后用PBST洗涤3次，拍干后干燥保存。
6、克百威标样溶液的配制  准确称取克百威标样10mg，溶于0.1L缓冲液中，然后用缓冲液10倍梯度稀释分别配制10mg/L、1mg/L、0.1mg/L、0.01mg/L、0.001mg/L克百威溶液，另外缓冲液配制0mg/L对照样，4℃保存。
7、克百威抗体溶液的制备用缓冲液适当稀释抗体，4℃保存备用。
8、酶标抗原的制备：
利用混合酸酐法，使HRP标记半抗原6-[〔(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基〕氨基]己酸(BFNH)，具体方法为：
①称取10mg的HRP(250nmol)于玻璃容器中，用0.5mL的去离子水溶解，加入2μL双蒸的三正丁胺，485μL的DMF，轻轻混匀，冰浴保存。
②取半抗原，加入275μL DMF溶解，加入1.2摩尔比的三正丁胺，加入1.2摩尔比的氯甲酸异丁酯，活化5min。
③将活化产物加入到HRP溶液中，控制半抗原与HRP的摩尔比为2∶1，冰浴反应1h，不时摇荡一下。
④将反应物过Sephadex G25柱(1cm×45cm)，用0.1M、pH7.0、含0.15M NaCl的PBS缓冲液洗脱，收集蛋白峰，分装冻存备用。
取出一块包被有第二抗体的酶标板，恢复到室温后备用；加入100ul克百威抗体到各自孔中，37℃孵育0.5h，洗板，加入酶标抗原和一系列稀释度的克百威标样溶液进行竞争反应，37℃孵育1h，洗板，OPD37℃避光显色15min，硫酸终止，酶标仪490nm测定结果。
以所获样品吸光值的平均值计算抑制率，抑制率的计算公式为：
其中，Amax为不加农药时的吸光值，Ax为农药浓度为x时的吸光值，Amin为空白对照孔的吸光值。
以抑制率为纵坐标，克百威浓度(mg/L)的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出曲线方程，对应样品的浓度可以根据方程求出。

Claims (8)

1、一种检测克百威的酶联免疫分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)合成半抗原和人工抗原；
(2)将人工抗原免疫动物制备对克百威具特异性的多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗体；
(3)用辣根过氧化物酶标记半抗原制备酶标抗原；
(4)用第二抗体包被酶标板并封闭，加入抗克百威抗体与第二抗体反应并固定于酶标板上；
(5)洗涤去除游离物，加入待测样品及酶标抗原或克百威标样及酶标抗原；
(6)洗涤去除游离物，加入酶的底物和显色剂，酶促显色反应的强度与结合在抗体上的酶标抗原量成正比，与样品或标样中克百威的含量成反比，因而根据已知量的克百威标准曲线和待检样品的抑制率，再根据抑制率与克百威浓度之间的半对数关系作图得到标准曲线，从而推算出待测克百威的浓度。
2、根据权利要求1所述的检测克百威的酶联免疫分析方法，其特征在于，所述半抗原是6-[〔(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基〕氨基]己酸或4-[〔(2，3-二氢-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基〕氨基]丁酸。
3、根据权利要求2所述的检测克百威的酶联免疫分析方法，具特征在于，所述半抗原是以呋喃酚与光气反应生成氯甲酸呋喃酚酯，再与氨基酸缩合合成的两种半抗原。
4、根据权利要求1所述的检测克百威的酶联免疫分析方法，其特征在于，所述人工抗原是半抗原与载体蛋白共价偶联合成的人工抗原。
5、根据权利要求1所述的检测克百威的酶联免疫分析方法，其特征在于，步骤(2)所述多克隆抗体是以人工抗原与弗氏佐剂混合乳化后免疫动物制备；所述单克隆抗体是采用杂交瘤技术制备；所述基因工程抗体是采用基因工程技术制备的。
6、根据权利要求1所述的检测克百威的酶联免疫分析方法，其特征在于，所述酶标抗原是采用混合酸酐法或活性酯法将半抗原与辣根过氧化物酶共价偶联而成。
7、根据权利要求1所述的检测克百威的酶联免疫分析方法，其特征在于，所述酶标板是聚苯乙烯微孔板。
8、根据权利要求1所述的检测克百威的酶联免疫分析方法，其特征在于，步骤(4)所述封闭是采用1.0～5.0％脱脂奶粉进行封闭。
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