CN113238043A - 一种基于sers免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法及应用 - Google Patents
一种基于sers免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种基于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法及应用，它涉及一种试纸的制备方法及应用。本发明解决了现有的检测呋喃丹方法无法快速定量、定性检测的问题。试纸的制备：一、制备呋喃丹单克隆抗体；二、制备胶体金；三、拉曼免疫探针；四、组装呋喃丹试纸条；本发明的试纸在检测食品中呋喃丹的应用。本发明制备出了呋喃丹单克隆抗体并制备出拉曼标记免疫探针，组装得到对呋喃丹具有高度特性、可以定量的免疫层析试纸条，为食品中有害物质的高灵敏快速检测提供了新的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种试纸的制备方法及应用。
背景技术
现代农业和粮食生产中需要使用农药等化学物质，但这些化学物质的不合理或过度使用对人类和生物体造成严重危害，引起严重的环境和食品安全问题。氨基甲酸酯类农药过度使用会污染环境中食物和水，人类和动物摄入后，会引起中毒反应。虽然氨基甲酸酯类农药在自然界中残留的时间相对较短，但它们会对人类产生严重的神经毒性。在氨基甲酸酯类农药中，呋喃丹(2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃甲基氨基甲酸酯)是农业上常用的广谱杀虫剂。呋喃丹对哺乳动物的毒性在于通过对突触连接处的丝氨酸残基进行氨基甲酰化来不可逆地抑制乙酰胆碱酯酶活性，从而对大脑产生威胁生命的作用。呋喃丹会改变神经递质的浓度和肌酸激酶的同工酶模式。其主要作用靶点是大脑，肝脏，骨骼肌和心脏等器官。人体对呋喃丹的中毒反应可能是由于意外或自杀性摄入而引起的急性反应，也可能是由于重复低剂量的职业接触而导致的慢性反应。由于呋喃丹是亲脂性的，人类长期与其接触会导致氧化性损伤，从而导致膜结构和功能紊乱。
仪器分析法是呋喃丹残留检测中最经典、最常用的技术，但该方法精密度与灵敏度很高，对检测人员技术要求高，设备昂贵，前处理过程复杂费时，不适用于现场快速检测。免疫传感器是基于转换器表面上的抗体和抗原之间相互作用的生物传感器，可将抗体或抗原固定在换能器上以检测抗原或抗体，来实现呋喃丹的检测，然而，由于其体积大和检测方法复杂，使其不易用于快速检测。标记免疫分析一般是将酶、荧光素等标记物对抗体或抗原进行标记，保持抗体或抗原活性的同时不影响标记物的活性，当相应抗体或抗原发生反应后，可以直接测定复合物中的标记物而对目标物质进行分析，但在呋喃丹残留检测中仍然无法达到快速定量、定性检测。
发明内容
本发明为了解决现有的检测呋喃丹方法无法快速定量、定性检测的问题，而提供了一种基于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法及应用。
本发明基于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法，按照以下步骤进行：
步骤一、制备呋喃丹单克隆抗体；
步骤二、制备胶体金；
步骤三、将拉曼标记分子及步骤一制备的呋喃丹单克隆抗体标记到胶体金上得到拉曼免疫探针；
步骤四、组装呋喃丹试纸条，即完成了试纸的制备。
上述基于SERS免疫层析技术的试纸在检测食品中呋喃丹的应用，具体的应用方法如下：将呋喃丹试纸条浸入含有待测物的拉曼免疫探针溶液中，进行显色，然后再用拉曼光谱分析仪进行分析，即完成了呋喃丹检测。显色是通过观察测试线颜色变化来判断样品是否存在呋喃丹，然后利用拉曼信号确定待测样品中呋喃丹浓度，即实现了待测物中呋喃丹定性和定量的检测。
上述步骤一中的呋喃丹单克隆抗体利用杂交瘤细胞株得到的，所述的杂交瘤细胞株，其为杂交瘤细胞株1D05，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：c2020243，保藏日期为2020年12月9日，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
本发明的SERS免疫层析技术可在12分钟内完成食品中呋喃丹的检测。本发明呋喃丹试纸条对呋喃丹标准样品的检测性范围为10-4至100ng/mL，
(表面增强拉曼光谱试纸条测定呋喃丹拉曼光谱标准曲线)，相关系数R2为0.99，IC50为0.038ng/mL，检测限为0.48pg/mL，低于国标规定的最低残留限量，本发明方法利用拉曼信号分析，测定了样品中的呋喃丹浓度，实现了呋喃丹的定量检测；本发明方法中的RSD为1.1％-6.0％(n＝3)，重现性良好；平均回收率在97.7％～104.8％之间，回收率较高。
本发明制备出了呋喃丹单克隆抗体并制备出拉曼标记免疫探针，对呋喃丹具有高度特性，本发明基于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸了实现了对呋喃丹定性，快速定量分析检测，为食品中有害物质的高灵敏快速检测提供了新的方案。
附图说明
图1是呋喃丹的mAb阳性细胞株筛选结果图；
图2是呋喃丹单克隆抗体SDS-PAGE电泳图；
图3呋喃丹鼠抗血清效价曲线；
图4是呋喃丹单克隆抗体亚类测定；
图5是胶体金溶液的透射电镜图；
图6是SERS-ICA原理示意图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式基于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法，按照以下步骤进行：
步骤一、制备呋喃丹单克隆抗体；
步骤二、制备胶体金；
步骤三、将拉曼标记分子及步骤一制备的呋喃丹单克隆抗体标记到胶体金上得到拉曼免疫探针；
步骤四、组装呋喃丹试纸条，即完成了试纸的制备。
本实施方式步骤三中拉曼标记分子是1mM PATP，得到的胶体金溶液为亮红色，并且均一透明、无肉眼可见杂质，此胶体金可适用于标记单克隆抗体。
本实施方式步骤三中拉曼免疫探针(SERS免疫探针)的制备方法为：
1、取1mL制备好的胶体金液体加入到1.5mL的离心管内，用10％的K2CO3溶液将离心管内的胶体金溶液调至pH 7-9。
2、加入适量对氨基苯硫酚(P-Amino Thiophenol，PATP,拉曼标记物)，搅拌15min后置于4℃冰箱静置1h。
(3)逐滴加入适量呋喃丹单克隆抗体(单抗)，保持搅拌15min后置于4℃冰箱静置1h。
(4)加入终浓度为5％(w/v)的BSA搅拌15min后移入4℃冰箱至次日。
(5)4℃低温5000r/min离心10min后收集底部沉积物，用等体积的浓度为20％蔗糖、0.2％PEG、0.5％BSA、0.1％苯酚和5％甘油的10mmol的磷酸盐缓冲液(pH7-9)重悬沉淀物，置于4℃冰箱保存待用。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤一中的呋喃丹单克隆抗体的制备方法：利用呋喃酚制备呋喃丹人工抗原，利用免疫小鼠得到杂交瘤细胞株，然后制备单克隆杂交瘤，分离纯化得到喃丹单克隆抗体。其它步骤及参数与实施方式一相同。
本实施方式制备呋喃丹单克隆抗体的具体步骤如下：
一、利用呋喃酚制备呋喃丹人工抗原：以克百威水解产物呋喃酚为原料，制备呋喃丹人工抗原
1、称取3-5g呋喃酚，溶于50mLCH2Cl2，冰浴条件下加入4.2mL吡啶并搅拌。4.08g对硝基苯氯甲酸酯溶于35mLCH2Cl2中，缓慢滴加进上述溶液中，保持低温反应，TLC监测(展开剂为CH2Cl2：石油醚＝3:2)，反应液用3％HCl洗涤至pH<7，分层后下层用无水Na2SO4干燥，旋蒸后用CH2Cl2和乙醚重结晶，得到苯并呋喃基对硝基苯氯甲酸酯。取0.81g上述中间物溶于25mL四氢呋喃中，再取0.65g的6-氨基己酸溶于48mLNaHCO3(pH8.2,0.1mol/L)溶液中，将四氢呋喃溶液冰浴条件下逐滴加入到NaHCO3中，TLC跟踪反应。冰浴下用4mol/LHCl调节pH值为4,再用乙酸乙酯萃取三次，干燥浓缩后，柱层析分离(洗脱剂为V石油醚：V乙酸乙酯＝5:1),收集目标产物，乙酸乙酯重结晶，得到2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-(5-羧基戊烷)氨基甲酸酯(BFNH)，采用核磁共振仪对BFNH结构进行分析鉴定。
2、呋喃丹人工抗原(免疫原BFNH-BSA)采用活性酯法进行合成：将16-20mgBFNH、6-8mgNHS和11-13mgDCC溶于1mLDMF中，室温下搅拌反应18h，反应液离心，分取上清活化液。再称量120mgBSA溶于8mL的碳酸盐缓冲溶液(0.05mol/L，pH9.6)中，缓慢分次滴加400μL活化液，然后室温下搅拌反应3h，再将黄色反应液装入透析袋，用PBS(0.01mol/L，PH7.4)透析，每4h换液1次。换液7-8次，透析后离心，上清液冷冻干燥，4℃保存。
二、免疫小鼠
1、取12只6～8周龄BALB/c雌性小鼠，将制备的人工抗原(免疫原BFNH-BSA)与等量的佐剂充分乳化后，颈背部皮下多点注射小鼠，免疫前眼眶采血获得阴性血清，具体的免疫方案如1所示。
表1 小鼠免疫方案
1.1、饲养细胞的准备
本试验中采用未免疫小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，于融合前一天进行制备。选择未免疫健康成长的Balb/c小鼠，处死后在75％酒精中浸泡5min，随后移入超净台并将其固定。剪开小鼠腹部皮肤使腹膜充分暴露。用酒精擦拭消毒后，取注射器吸取一定量的1640培养液，缓慢注入小鼠腹腔，用注射器在腹腔内缓慢反复抽吸数次后吸出腹腔内液体，注入无菌离心管内，以1000r/min离心l0min，弃去上清后用已制备的5mL HAT培养液将细胞沉淀悬浮并混匀。将细胞悬液每孔0.1mL加入96孔培养板内，然后将培养板置于37℃、5％的CO2培养箱中进行培养。经18-24h后观察细胞生长状态，细胞贴壁紧密时，方可使用。
1.2、脾淋巴细胞的准备
通过已建立的间接ELISA法检测抗血清效价，取效价最高的Balb/c小鼠的眼球放血。小鼠处死后浸泡于75％酒精中灭菌5min，于超净台上固定后取出脾脏，将其置于盛有5mL PBS洗涤液的平皿中，用注射器PBS在脾脏上扎入小孔，缓慢洗涤数次后，取PBS洗涤液至无菌离心管中，1000r/min离心10min，弃去上清，加1640培养液润洗沉淀细胞，1000r/min离心10min，重复此过程2次后重悬细胞。
1.3、融合过程
将SP2/0骨髓瘤细胞(骨髓瘤细胞SP2/0购自普赛诺生物科技公司)与脾细胞按1:5混合，将其悬浮液以1000r/min离心l0min；除去上清后，放入37℃水浴中。将已37℃预热的PEG4000在1min之内沿管壁慢慢转动的加入离心管中，静置30s。紧接着将9mL 1640培养液先慢后快地滴加至离心管中，整个过程在4min内完成，终止其融合反应。1000r/min离心5min后弃除上清，加入HAT培养液，并与融合前一天制备的饲养细胞混匀后200μL/孔加入到96孔细胞培养板中，放入37℃、5％CO2培养箱中培养。
1.4、融合细胞的选择性培养
细胞融合后每天观察细胞生长状况，用已制备的HAT、HT培养液对其培养基进行换液；继续每天观察杂交瘤细胞生长状态，随后进行抗体检测。
1.5阳性杂交瘤细胞株的筛选
细胞融合后约7～12d，倒置显微镜下观察细胞生长状况。当杂交瘤细胞布满孔底约1/10面积时，吸取细胞培养上清100μL/孔，采用间接ELISA法进行检测：
1.5.1每孔加入100μL的BFNH-BSA抗原包被酶标板，37℃过夜，PBST洗涤三次，弃去洗涤液。
1.5.2每孔加入细胞培养上清，置37℃反应1h，PBST洗涤三次。
1.5.3每孔加入1:5000倍稀释的HRP-羊抗鼠酶标二抗，置37℃反应1h，PBST洗涤五次后轻轻拍干。
1.5.4每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光放置15min，加入50μL 2mol/L的H2SO4终止反应，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值，判定结果。
阳性杂交瘤细胞制备和筛选是制备单克隆抗体的关键步骤，人工抗原免疫获得的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合后约7-12天，当杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，每孔吸取100μL细胞培养上清，用已建立的间接ELISA方法对其进行检测。如图1所示，成功筛选出呋喃丹的mAb阳性细胞株，命名为1D05、1H10和2H04。
从图1可以看出，1D05、1H10和2H04分别为筛选出的阳性杂交瘤细胞株。其中1D05杂交瘤细胞株(杂交瘤细胞1D05的保藏号为CCTCC NO：c2020243)的结合活性最高，因此选择杂交瘤细胞株1D05用有限稀释法进行亚克隆，以获得稳定分泌抗体的单克隆杂交瘤用于进一步的分析。
三、腹水制备及辛酸-硫酸铵法纯化
1、腹水的制备
取20只成年健康生长的雌性Balb/c小鼠，向小鼠腹腔中注射0.5mL经过灭菌的液体石蜡；经过一周后，注射0.5mL阳性克隆杂交瘤细胞于小鼠腹腔中，观察小鼠生长状态，待其肚子圆鼓且行动较为缓慢时，用无菌注射器抽取小鼠腹水；将其腹水置于37℃静置30min，5000r/min离心30min，除去其他沉淀物，收集上清，间接ELISA法测定效价，分装，至-80℃下冻存备用。
2、辛酸-硫酸铵法纯化抗体
通过采用辛酸-硫酸铵法纯化人工抗原免疫制备的抗血清，偏酸条件下正辛酸沉淀血清中其他蛋白质，加入硫酸铵后抗体表面电荷被大量中和，使抗体分子聚集沉淀，纯化呋喃丹单克隆抗体。
取腹水10000r/min 4℃离心30min，取上清，加入三倍体积的pH5.0的0.06mol/L的CH3COONa缓冲液，用1mol/L的HCl调pH至4.2-4.8。按照每毫升腹水加入60μL正辛酸的比例逐滴加入正辛酸，持续搅拌30min，4℃静置2h，10000r/min 4℃离心30min，收集上清液加入1/10体积的0.1mol/L PBS，用1mol/L NaOH调pH至7.4，在4℃下缓慢加入等体积(NH4)2SO4，4℃静置过夜。10000r/min 4℃离心30min，弃去上清液。收集沉淀，用0.01mol/L PBS重悬；每6h更换透析液，4℃透析3天。
3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下：
对玻璃板进行清洗，并将其安装在电泳槽中以防泄漏。根据表2来配制12％分离胶，倒入电泳槽中，用2mL异丙醇密封，胶面要始终保持平稳状态，置于25℃条件下30min。根据表2-3配制5％浓缩胶，倒入电泳槽中，即刻将梳子缓慢垂直插入，再次在25℃条件下静置2h。拔出梳子，将样品与上样缓冲液以1:1比例进行混合，加入15-20μL混合液于每个点样孔中。电源接通，调节电压到80V，当样品移到分离胶时，会在浓缩胶部分出现一条线，此时调节电压到120V，观察溴酚蓝指示剂到达分离胶底部边缘时关闭电源。在摇床上低速震荡1h后取出凝胶，将其浸入脱色液中，在低速下于摇床中震荡12h后取出，并拍照记录。
表2 分离胶和浓缩胶的配制
SDS-PAGE分析纯化后的单克隆抗体，如图1所示，图中1为纯化后抗呋喃丹单克隆抗体；M为标准蛋白结果表明，制得的抗血清经纯化后，可以得到较纯的条带。并且IgG的重链和轻链分子质量分别在55kd和26kd左右。
四、呋喃丹单克隆抗体的测定
1、呋喃丹单克隆抗体效价测定
采用间接ELISA法测定单克隆抗体效价，其有无抗体或抗原的含量可以有颜色来判断。操作如下：
1.1、向聚苯乙烯96孔反应板的每个孔中加入100μL的BFNH-BSA作为抗原包被，37℃孵育2h。倒干小孔内的液体，每孔加入320μL的PBST清洗3次后拍干。
1.2、每孔加入l00μL的BSA封闭液，37℃放置1h以防止非特异性结合。倒干小孔内的液体后清洗拍干。
1.3、每孔加入100μL用0.1mol/L pH7.4的PBST连续倍比稀释后的抗血清，37℃孵育1h。倒干小孔内的液体后清洗拍干。
1.4、每孔加入100μL的羊抗鼠IgG-HRP，37℃孵育30min。倒掉小孔中的液体，用PBST清洗5次后拍干。
1.5、每孔加入现配的TMB底物溶液100μL，在37℃下避免阳光直射，放置15min。
1.6、加入50μL的H2SO4以终止反应继续进行；于450nm波长下测量各孔溶液的吸光度值，待测样品的效价以阳性反应的最大稀释度表示。
1.7、用间接ELISA方法检测单克隆抗体效价，计算抗血清与空白血清A值之比，当比值≥2.1时为阳性。
间接ELISA方法检测单克隆抗体效价，并绘制效价曲线，如图3所示，图中
表示抗血清，
表示空白血清(空白血清为未免疫小鼠血清)。结果表明，所得到的小鼠抗血清效价为64000。
2、呋喃丹单克隆抗体亚类测定
通过小鼠单抗Ig类/亚类检测试剂盒对抗体进行亚类鉴定。操作如下：
(1)首先将试剂盒恢复室温，用纯水把清洗液配成工作浓度。
(2)将细胞培养上清50μl加入酶标微孔板的6个孔中，阳性对照加6孔每孔50μl。每孔再加入50μl稀释液。贴上封板膜37℃温育30分钟。
(3)弃去板内液体，洗板5遍拍干。在样本和阳性对照孔中分别加入6种酶标二抗各100μl。贴上封板膜37℃温育30分钟。
(4)弃去板内液体，洗板5遍拍干。每孔分别加入显色剂A和显色剂B各50μl，换一张新的封板膜贴板避光37℃显色20分钟。
(5)一般肉眼即可观察出结果，显色蓝的孔所对应的酶标二抗即为抗体的Ig类或亚类。也可将反应终止液(每孔50μl)终止反应后用酶标仪450nm测定波长，参看高值孔所对应的酶标二抗即为抗体的Ig类或亚类。
小鼠单抗Ig类/亚类检测试剂盒采用小鼠抗体共有位点的二抗包被微孔板，加入培养上清中的抗体与之结合，再分别加入HRP标记的抗小鼠亚类的抗体，通过酶标仪检测吸光度值来判断其亚类。
将血清效价较高的单克隆抗体1D05用小鼠单抗Ig类/亚类检测试剂盒进行鉴定，可区分出IgA、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，如图4所示，如图所示，小鼠单克隆抗体的亚类为IgG1。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二的不同点是：杂交瘤细胞株，其为杂交瘤细胞株1D05，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：c2020243，保藏日期为2020年12月9日。其它步骤及参数与实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二中采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。其它步骤及参数与实施方式一相同。
本实施方式胶体金的制备方法为：配制1％(w/v)氯金酸，1％(w/v)柠檬酸三钠溶液，用0.2um滤膜过滤。在清洗干净的500mL三角瓶中放入200mL超纯水，将其置于电热板加热，待水沸腾后然后加入已配置的氯金酸及柠檬酸三钠溶液，搅拌加热，当颜色由黑—棕红或红保持5～10min后，将其移到一旁放置，倒入干净容器中，自然冷却至室温后4℃保存备用。所制备的胶体金溶液的透射电镜图如图5所示，如图5所示，透射电镜观察胶体金颗粒形状及粒度分布、均匀度及分散度，胶体金颗粒呈圆形，粒子大小均匀，分散且没有聚集，胶体金颗粒平均直径为46.08±0.53nm。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤四胶体金、拉曼标记分子、呋喃丹单克隆抗体的体积比为1000:1:6。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤四中试纸条由样品垫、硝酸纤维素膜条和吸收垫组成。其它步骤及参数与实施方式一相同。
本实施方式试纸条组装方法为：在硝酸纤维素(NC)膜上，通过铺展2mg/mL包被抗原(BFNH-OVA)和1mg/mL羊抗鼠IgG1，形成一条测试线(T线)和一条对照线(C线)；将NC膜组装在PVC板上，将样品垫和吸收垫粘贴在NC膜的两端，重叠1.5mm。然后，将组装好的板切成宽4mm的条，将条密封到玻璃瓶中并在4℃下储存直至使用；其中所述的抗原利用呋喃酚制备呋喃丹人工抗原，以克百威水解产物呋喃酚为原料，制备呋喃丹人工抗原，具体是：
1、称取3-5g呋喃酚，溶于50mLCH2Cl2，冰浴条件下加入4.2mL吡啶并搅拌。4.08g对硝基苯氯甲酸酯溶于35mLCH2Cl2中，缓慢滴加进上述溶液中，保持低温反应，TLC监测(展开剂为CH2Cl2：石油醚＝3:2)，反应液用3％HCl洗涤至pH<7，分层后下层用无水Na2SO4干燥，旋蒸后用CH2Cl2和乙醚重结晶，得到苯并呋喃基对硝基苯氯甲酸酯。取0.81g上述中间物溶于25mL四氢呋喃中，再取0.65g的6-氨基己酸溶于48mLNaHCO3(pH8.2,0.1mol/L)溶液中，将四氢呋喃溶液冰浴条件下逐滴加入到NaHCO3中，TLC跟踪反应。冰浴下用4mol/LHCl调节pH值为4,再用乙酸乙酯萃取三次，干燥浓缩后，柱层析分离(洗脱剂为V石油醚：V乙酸乙酯＝5:1),收集目标产物，乙酸乙酯重结晶，得到2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-(5-羧基戊烷)氨基甲酸酯(BFNH)，采用核磁共振仪对BFNH结构进行分析鉴定。
2、呋喃丹人工抗原(免疫原BFNH-BSA)采用活性酯法进行合成：将16-20mgBFNH、6-8mgNHS和11-13mgDCC溶于1mLDMF中，室温下搅拌反应18h，反应液离心，分取上清活化液。再称量120mgBSA溶于8mL的碳酸盐缓冲溶液(0.05mol/L，pH9.6)中，缓慢分次滴加400μL活化液，然后室温下搅拌反应3h，再将黄色反应液装入透析袋，用PBS(0.01mol/L，PH7.4)透析，每4h换液1次。换液7-8次，透析后离心，上清液冷冻干燥，4℃保存。
具体实施方式七：具体实施方式一所述的基于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸在检测食品中呋喃丹的应用。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式六不同的是：基于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸在检测食品中呋喃丹的应用方法为：将试纸将呋喃丹试纸条浸入含有待测物的拉曼免疫探针溶液中，进行显色，然后再用拉曼光谱分析仪进行分析，即完成了呋喃丹检测。其他步骤及参数与具体实施方式六相同。
本实施方式中显色是通过观察测试线颜色变化来判断样品是否存在呋喃丹，然后利用拉曼信号确定待测样品中呋喃丹浓度，即实现了待测物中呋喃丹定性和定量的检测。
本实施方式取100μL待测溶液作为待测液，然后滴加至含有拉曼(SERS)免疫探针溶液的96孔酶标板的孔中，将试纸条样品垫端浸入含有待测物的拉曼免疫探针溶液中，样品溶液与SERS免疫探针一起通过毛细管作用流向吸收垫，12分钟后，ICA将完成并且可以通过肉眼对照线的颜色变化来验证。通过SERS测量由测试线上的包被抗原捕获的免疫复合物探针的信号强度确定待测液浓度；激发源为785nm激光，激光功率为10mW，积分时间为10s，15min内每隔三分钟测定T线上的拉曼信号1081cm-1处的峰强度即为本实验使用拉曼标记物(PATP)的特征峰。其中所述的待测物是将样品粉碎成均匀样品，称取20g粉碎后样品加入80mL70％甲醇溶液，高速匀浆2min，过滤后得到。
具体实施方式九：本实施方式杂交瘤细胞株，其为杂交瘤细胞株1D05，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：c2020243，保藏日期为2020年12月9日。
具体实施方式一中的呋喃丹单克隆抗体利用本实施方式的杂交瘤细胞株制备得到。
实施例1基于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法按照以下步骤进行：
步骤一、制备呋喃丹单克隆抗体；其中制备方法：利用呋喃酚制备呋喃丹人工抗原，利用免疫小鼠得到杂交瘤细胞株1D05，然后制备单克隆杂交瘤，分离纯化得到喃丹单克隆抗体；其中，所述的杂交瘤细胞株其为杂交瘤细胞株1D05，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：c2020243，保藏日期为2020年12月9日；
步骤二、制备胶体金，其中，胶体金的制备方法为：配制1％(w/v)氯金酸，1％(w/v)柠檬酸三钠溶液，用0.2um滤膜过滤。在清洗干净的500mL三角瓶中放入200mL超纯水，将其置于电热板加热，待水沸腾后然后加入已配置的氯金酸及柠檬酸三钠溶液，搅拌加热，当颜色由黑—棕红或红保持5～10min后，将其移到一旁放置，倒入干净容器中，自然冷却至室温后4℃保存备用；
步骤三、将拉曼标记分子及步骤一制备的呋喃丹单克隆抗体标记到胶体金上得到拉曼免疫探针，拉曼标记分子PATP加入量为1.0μL、呋喃丹单克隆抗体是6μL、胶体金是1毫升；
步骤四、组装呋喃丹试纸条，其中试纸条由样品垫、硝酸纤维素膜条和吸收垫组成，具体组装方法：在硝酸纤维素(NC)膜上，通过铺展2mg/mL包被抗原(其中所述的抗原利用呋喃酚制备呋喃丹人工抗原，以克百威水解产物呋喃酚为原料，制备呋喃丹人工抗原，具体是：
1、称取3-5g呋喃酚，溶于50mLCH2Cl2，冰浴条件下加入4.2mL吡啶并搅拌。4.08g对硝基苯氯甲酸酯溶于35mLCH2Cl2中，缓慢滴加进上述溶液中，保持低温反应，TLC监测(展开剂为CH2Cl2：石油醚＝3:2)，反应液用3％HCl洗涤至pH<7，分层后下层用无水Na2SO4干燥，旋蒸后用CH2Cl2和乙醚重结晶，得到苯并呋喃基对硝基苯氯甲酸酯。取0.81g上述中间物溶于25mL四氢呋喃中，再取0.65g的6-氨基己酸溶于48mLNaHCO3(pH8.2,0.1mol/L)溶液中，将四氢呋喃溶液冰浴条件下逐滴加入到NaHCO3中，TLC跟踪反应。冰浴下用4mol/LHCl调节pH值为4,再用乙酸乙酯萃取三次，干燥浓缩后，柱层析分离(洗脱剂为V石油醚：V乙酸乙酯＝5:1),收集目标产物，乙酸乙酯重结晶，得到2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-(5-羧基戊烷)氨基甲酸酯(BFNH)，采用核磁共振仪对BFNH结构进行分析鉴定。
2、呋喃丹人工抗原(免疫原BFNH-BSA)采用活性酯法进行合成：将16-20mgBFNH、6-8mgNHS和11-13mgDCC溶于1mLDMF中，室温下搅拌反应18h，反应液离心，分取上清活化液。再称量120mgBSA溶于8mL的碳酸盐缓冲溶液(0.05mol/L，pH9.6)中，缓慢分次滴加400μL活化液，然后室温下搅拌反应3h，再将黄色反应液装入透析袋，用PBS(0.01mol/L，PH7.4)透析，每4h换液1次。换液7-8次，透析后离心，上清液冷冻干燥，4℃保存。)和1mg/mL羊抗鼠IgG1，形成一条测试线(T线)和一条对照线(C线)；将NC膜组装在PVC板上，将样品垫和吸收垫粘贴在NC膜的两端，重叠1.5mm；然后，将组装好的板切成宽4mm的条，将条密封到玻璃瓶中并在4℃下储存直至使用；即得到了呋喃丹试纸。
基于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸在检测食品中呋喃丹的应用方法为：将呋喃丹试纸条浸入含有待测物的拉曼免疫探针溶液中，进行显色，然后再用拉曼光谱分析仪进行分析，即完成了呋喃丹检测。其中，将待测样品粉碎成均匀样品，称取20g粉碎后样品加入80mL70％甲醇溶液，高速匀浆2min，过滤后得到含有待测物的拉曼免疫探针溶液；将100μL含有待测物的拉曼免疫探针溶液滴加至含有免疫探针溶液的96孔酶标板的孔中，将试纸条样品垫端浸入，样品溶液与SERS免疫探针一起通过毛细管作用流向吸收垫，12分钟后，ICA将完成并且可以通过肉眼观察对照线的颜色变化；通过SERS测量由测试线上的包被抗原捕获的免疫复合物探针的信号强度确定待测液浓度，其中激发源为785nm激光，激光功率为10mW，积分时间为10s，1081cm-1处的峰强度即为本实验使用拉曼标记物(PATP)的特征峰，由此可得到呋喃丹的含量。
本实施例中将含有待测物的拉曼免疫探针溶液滴入含有免疫探针溶液的96孔酶标板的孔中，然后将试纸条的样品垫末端浸入其中，该溶液将通过毛细作用迁移至吸收垫；如果待测样品中不含呋喃丹溶液，免疫探针因其标记的抗体，由于抗原抗体的特异性结合，将被涂在NC膜上的BFNH-BSA捕获。过量的免疫探针将被继续迁移，被羊抗鼠-IgG捕获并获得对照线。在这种情况下，由于红色胶体金的积聚，T线和C线上将出现两个红色条带；相反，含有大量的呋喃丹溶液滴入含有免疫探针溶液的96孔酶标板的孔中，探针上的特异性抗体结合位点将被呋喃丹占据，免疫探针-呋喃丹复合物不再与T线包被的BFNH-BSA结合，但它将被继续迁移被羊抗鼠-IgG捕获以获得对照线，因此，仅有C线上的红色条带出现。并且T线颜色的深浅与呋喃丹浓度间接成比例，如图6所示。试纸条完成初步检测后，可通过肉眼观察T线上的颜色，对呋喃丹进行半定量检测。本实施例使用拉曼光谱分析仪，激发源为785nm激光，激光功率为10mW，积分时间为10s，测量T线上被捕获的免疫探针的拉曼散射强度。
选择八种类型的真实样品，即黄瓜、白菜、土豆、苹果、橘子、大米、甜菜和茶叶用于加标实验，在所有八种类型的样品中加入浓度为0.005，0.05和0.5ng/g的呋喃丹标准品，最优实验条件下应用于SERS-ICA方法预测其理论浓度，如表3所示，平均回收率在97.7％-104.8％之间，RSD为1.1％-6.0％(n＝3)，由此可见，食品中呋喃丹的含量可以通过本发明的方法准确测量。
表3 SERS-ICA方法检测实际样品
Claims (9)
1.一种基于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法，其特征在于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法，按照以下步骤进行：
步骤一、制备呋喃丹单克隆抗体；
步骤二、制备胶体金；
步骤三、将拉曼标记分子及步骤一制备的呋喃丹单克隆抗体标记到胶体金上得到拉曼免疫探针；
步骤四、组装呋喃丹试纸条；即完成了试纸的制备。
2.根据权利要求1所述的SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法，其特征在于步骤一中的呋喃丹单克隆抗体的制备方法：利用呋喃酚制备呋喃丹人工抗原，利用免疫小鼠得到杂交瘤细胞株，然后制备单克隆杂交瘤，分离纯化得到呋喃丹单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的一种基于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法，其特征在于杂交瘤细胞株，其为杂交瘤细胞株1D05，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：c2020243，保藏日期为2020年12月9日。
4.根据权利要求1所述的基于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法，其特征在于步骤二中采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金。
5.根据权利要求1所述的SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法，其特征在于步骤四胶体金、拉曼标记分子、呋喃丹单克隆抗体的体积比为1000:1:6。
6.根据权利要求1所述的一种基于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸的制备方法，其特征在于步骤三中试纸条由样品垫、硝酸纤维素膜条和吸收垫组成。
7.如权利要求1所述的基于SERS免疫层析技术的试纸在检测食品中呋喃丹的应用。
8.根据权利要求5所述的基于SERS免疫层析技术的呋喃丹试纸在检测食品中呋喃丹的应用，其特征在于具体的应用方法如下：将权利要求1所述的呋喃丹试纸条浸入含有待测物的拉曼免疫探针溶液中，进行显色，然后再用拉曼光谱分析仪进行分析，即完成了呋喃丹检测。
9.一种杂交瘤细胞株，其特征在于杂交瘤细胞株，其为杂交瘤细胞株1D05，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：c2020243，保藏日期为2020年12月9日。
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| 高思远 等: "农药残留免疫分析技术研究进展", 《食品工业科技》 * |
| 龚航等: "基于三唑磷残留限量值的多检测线免疫试纸条的制备与应用", 《分析化学》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113238043B (zh) | 2023-04-07 |
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