CN114527283A - 一种多合一农药残留定量检测试纸和检测方法 - Google Patents

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CN114527283A CN202210163764.7A CN202210163764A CN114527283A CN 114527283 A CN114527283 A CN 114527283A CN 202210163764 A CN202210163764 A CN 202210163764A CN 114527283 A CN114527283 A CN 114527283A
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Abstract

本发明属于农药检测技术领域，具体涉及一种多合一农药残留定量检测试纸和检测方法。该检测试纸的胶体金结合垫上附着有至少两种农药的金纳米颗粒标记抗体；层析膜上设置有质控线和至少两条检测线，每条检测线采用一种农药的抗原包被而成；所述农药选自毒死蜱、甲拌磷、乐果、啶虫脒、多菌灵、腐霉利、甲氰菊酯、克百威、异丙威、百菌清、氟虫氰、对硫磷、涕灭威、三唑酮、水胺硫磷或对硫磷。通过优选农药种类及其抗原和抗体的制备方法，本发明克服了对多种农药进行同时检测时检测目标相互干扰的问题，具有特异性好、灵敏度高、能够准确定量、能够同时检测多种组分和前处理简单等优点，因而具有很好的应用前景。

Description

一种多合一农药残留定量检测试纸和检测方法
技术领域
本发明属于农药检测技术领域，具体涉及一种多合一农药残留定量检测试纸和检测方法。
背景技术
农药残留(Pesticide residues)是农药使用后一个时期内没有被分解而残留于生物体、收获物、土壤、水体、大气中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。
施用于作物上的农药，其中一部分附着于作物上，一部分散落在土壤、大气和水等环境中，环境残存的农药中的一部分又会被植物吸收。残留农药直接通过植物果实或水、大气到达人、畜体内，或通过环境、食物链最终传递给人、畜。农残剥离器可以降解水果蔬菜表面的农药残留。
越来越严峻的贸易技术壁垒和食品安全问题，要求不断提高我国的检验检疫水平，以突破技术壁垒。面对目前食品安全中日益增多的检测项目和日渐严格的残留限量标准，开发高通量、快速、准确、灵敏的农药多残留分析技术，同时对多种类不同极性残留物质进行分析，监督控制食品污染和保证食品质量，已成为刻不容缓的任务。
胶体金免疫层析法是一种常用的检测方法，其原理是基于抗原和抗体的特异性识别和结合反应。将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。
针对农药残留的检测，也可使用胶体金免疫层析法，例如，中国发明专利“CN1203317C克百威农药的纳米胶体金标记免疫测定方法”提供了一种利用胶体金免疫层析法检测克百威农药的方法。其以改良活性酯法将克百威免疫半抗原BFNH与BSA偶联，合成人工免疫抗原复合物，免疫动物，制备特异性高效价抗BFNH抗体，抗体经分离纯化后，将纳米级的胶体金标记于抗克百威的特异性抗体，然后将此标记结合物、偶联卵清蛋白的克百威以及羊抗鼠IgG分别固化在一载体上，根据竞争抑制免疫层析原理，进行克百威农药的半定量分析测定，所建立的检测体系对克百威农药的最小检测量为0.25mg/kg，且在10分钟内完成快速检测。
然而，现有的胶体金免疫层析法用于农药检测时，只实现对单一一种农药的检测。而如果希望在同一试纸上进行多种农药的同时检测，则对检测的特异性存在着极高的要求，否则易出现各检测农药分子间的相互干扰，这导致了基于胶体金免疫层析法的多合一农药检测试纸和检测方法的开发存在着较大的困难。因而，目前还未实现基于胶体金免疫层析法的多合一农药检测。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供一种多合一农药残留定量检测试纸和检测方法，目的在于通过克服农药多合一检测中对特异性高要求的障碍，实现对多种农药的同时检测。
一种多合一农药残留定量检测试纸，包括依次连接的样品垫、胶体金结合垫和层析膜；
所述胶体金结合垫上附着有至少两种农药的金纳米颗粒标记抗体；
所述层析膜上设置有质控线和至少两条检测线，每条检测线采用一种农药的抗原包被而成；
所述农药选自毒死蜱、甲拌磷、乐果、啶虫脒、多菌灵、腐霉利、甲氰菊酯、克百威、异丙威、百菌清、氟虫氰、对硫磷、涕灭威、三唑酮、水胺硫磷或对硫磷；
所述农药的抗原通过将农药分子与大分子蛋白偶联形成，采用如下方法之一合成：
方法1，对于含有羧基的农药，采用碳二亚胺法、活化酯法或混合酸酐法，
方法2，对于含有氨基的农药，采用重氮法、碳二亚胺法或戊二醛法，
方法3，对于含有羟基的农药，采用琥珀酸酐法、过碘酸氧化法或氯乙酸钠法。
优选的，所述农药的金纳米颗粒标记抗体通过将农药的抗体与金纳米颗粒结合得到，所述农药的抗体通过将农药的抗原免疫动物得到。
优选的，所述金纳米颗粒为银包金纳米颗粒，和/或，所述金纳米颗粒的尺寸为10-50nm。
优选的，所述大分子蛋白为牛血清蛋白或卵清蛋白。
优选的，所述农药的种类为毒死蜱、甲拌磷和乐果，所述毒死蜱的抗原采用碳二亚胺法制备得到，所述甲拌磷的抗原采用碳二亚胺法制备得到，所述乐果的抗原采用碳二亚胺法制备得到。
优选的，所述农药的种类为腐霉利、克百威、多菌灵和毒死蜱，所述腐霉利的抗原采用琥珀酸酐法制备得到，所述克百威的抗原采用重氮法制备得到，所述多菌灵的抗原采用活化酯法或混合酸酐法制备得到，所述毒死蜱的抗原采用碳二亚胺法制备得到。
本发明还提供上述检测试纸的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，制备农药的抗原和金纳米颗粒；
步骤2，在层析膜上进行划线包被，每一种农药的抗原各划一条检测线，用抗鼠IgG划一条质控线；
步骤3，利用农药的抗原制备得到农药的抗体；
步骤4，将所述农药的抗体和金纳米颗粒结合，制成金纳米颗粒标记抗体；
步骤5，将金纳米颗粒标记抗体喷在胶体金结合垫上；
步骤6，将所述胶体金结合垫和所述层析膜作为部件，加上其他胶体金免疫层析法试纸的必要部件，组成得到多合一农药残留定量检测试纸。
优选的，步骤2中，用划膜仪以0.5-2μL/cm的速度进行划线包被，包被用的溶液中农药的抗原浓度各为0.1-3mg/mL；
和/或，步骤5中，将含有农药的抗体的金纳米颗粒标记抗体的溶液以2-10μL/cm的用量喷在胶体金结合垫上，所述含有农药的抗体的金纳米颗粒标记抗体的溶液含有如下成分：PBS 2mM、BSA 0.1-5wt.％、蔗糖1-20wt.％、tween-20 0.01-1wt.％、农药的抗体各0.1-2mg/mL。
本发明还提供一种农药残留的检测方法，包括如下步骤：
步骤1，采用提取剂提取样品，分离后得上清液；
步骤2，用稀释液稀释所述上清液，得到供试品溶液；
步骤3，将供试品溶液滴至上述检测试纸的样品垫进行检测。
优选的，所述提取剂为甲醇水溶液，和/或，所述稀释液含有如下成分：PBS 0.2M、tween-20 0.1-10wt.％。
本发明中，所述“金纳米颗粒”可以是单质金构成的单一组分的纳米颗粒，也可以是在金单质纳米颗粒的表面进行修饰或包被形成的纳米颗粒，例如银包金纳米颗粒。本发明中，所述碳二亚胺法、活化酯法、混合酸酐法、重氮法、戊二醛法、琥珀酸酐法、过碘酸氧化法和氯乙酸钠法均属于现有的制备抗原的方法。对于各种方法，本领域技术人员可参考如下文献实现：
碳二亚胺法：甲拌磷人工抗原的合成及多克隆抗体制备，王翀，魏松红，李兴海，高伟，胡沙，河南农业科学，2009年第3期；
活化酯法：甲萘威人工抗原的合成及偶联比的测定，瞿巧钰，陈姗姗，刘潇威，李培武，张奇，中国油料作物学报，2013年10月；
混合酸酐法：混合酸酐法合成雌二醇酶标抗原偶联工艺影响因素探讨，李桂林，孙国龙，张春鸽，赵巧辉，付光宇，吴学炜，医药论坛杂志，2017年9月第38卷第9期；
重氮法：重氮化法合成磺胺间甲嘧啶免疫抗原的研究，韩占江，王伟华，南海娟，陈阳，吴峥，张彦杰，孙磊，张鑫潇，河南科技学院，广东微量元素科学，2008年15卷第3期；
戊二醛法：甲基苯丙胺与蛋白偶联物的合成，陈燕忠，刘安华，刘晓云，王继华，现代食品科技，2008，Vol.24，No.5；
琥珀酸酐法：腐霉利人工抗原制备研究，胡骁飞,邢云瑞,孙亚宁-《中国农学通报》–2021；
过碘酸氧化法：黄芪甲苷人工抗原的合成及单克隆抗体的制备，任雅君，北京中医药大学，2015；
氯乙酸钠法：紫铆素人；工抗原的合成与鉴定，万凤，孔慧，屈会话，张越，冯会宾，赵琰，王庆国，中草药，第45卷，第3期，2014年2月；
本发明提供了多合一单卡农药残留定量检测农药残留的试纸和方法，通过优选农药种类及其抗原和抗体的制备方法，克服了对多种农药进行同时检测时检测目标相互干扰的问题。本发明具有特异性好、灵敏度高、能够准确定量、能够同时检测多种组分和前处理简单等优点，因而具有很好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1和实施例2提供的检测试纸的结构及检测方法示意图。
图2为实施例1和实施例2提供的检测试纸的检测结果示例。
具体实施方式
以下实施例和实验例中所用的试剂和材料均为市售品。
实施例1毒死蜱、甲拌磷、乐果三合一定量检测试纸
本实施例的检测试纸结构和检测方法如图1所示，检测结果示例如图2所示，所述检测试纸的制备方法如下：
1、银包金纳米颗粒合成
1.1纳米金颗粒合成
取0.01％氯金酸水溶液100mL加热至沸，搅动下准确加入1％柠檬酸三钠水溶液1.8mL，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为红色，继续煮沸15分钟。
1.2银包金纳米颗粒合成
将上述溶液温度调节至40-80℃，加入硝酸银溶液使其含量为0.001-0.1％，搅动下滴加还原剂1％柠檬酸三钠水溶液1.0mL，继续搅拌反应10min，所得液体即为银包金纳米溶液。
2、抗原的制备
农药分子量小无免疫原性，必须与大分子物质偶联成人工合成抗原(完全抗原)才能获得免疫原性，因此需要相应蛋白载体相偶联形成具有免疫原性的全抗原。根据农药分子中所含活性基团(羧基、氨基、羟基)的不同，采取相应的合成方式制得所需的半抗原。
现将毒死蜱的人工抗原制备过程叙述如下：
采用碳二亚胺法是将毒死蜱小分子先与碳二亚胺反应，使羧基脱水，生成一个加成中间产物，再与载体蛋白上的氨基反应形成酰胺键。
碳化二亚胺法制备毒死蜱半抗原的操作步骤：
1)取EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)100mg,用pH8.0的10mmol/L，PBS液2.5mL使之充分溶解(I液)；
2)取毒死蜱25mg,用0.2mol/L NaOH溶液2mL溶解(II液)；
3)取牛血清蛋白(BSA)25mg,溶于10mmol/L PBS(pH8.0)液中(III液)；
4)将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液(余下0.5mL)；
5)室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液；
6)4度搅拌12小时；
7)静置10小时(4度)；
8)有蒸馏水使之充分透析(约48小时)，得免疫原。
甲拌磷的人工抗原制备过程：
1)在50ml反应瓶中放入11.1g五硫化二磷，然后逐滴滴入无水乙醇9.66g，温度逐步上升。当温度上升至80℃左右时，控制滴加速度，水浴恒温，搅拌1h，待粉末全部溶解，溶液呈淡黄色后，停止反应。
2)将反应混合液用蒸馏水萃取，硫化物存在于水相的杂质，得硫化物。
3)在反应瓶中放入硫化物，在室温下，滴加10g 30％甲醛水溶液，磁力搅拌20min后，加入7.9g 2-巯基乙醇在60℃反应5h。将初步合成的甲拌磷半抗原，浓缩后过83μm硅胶层析柱，收集样品，得到甲拌磷半抗原。
4)在反应瓶中，放入纯化后的甲拌磷半抗原与丁二酸酐，以DMAP作为催化剂，在70℃条件下反应6h左右，得到甲拌磷半抗原的衍生物。
5)取40mg甲拌磷半抗原衍生物溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入20mg二环己基碳二亚胺，室温下磁力搅拌，反应过夜。
6)将反应液加入到溶解20mg BSA的硼酸盐缓冲溶液中，磁力搅拌反应5h。
7)待反应完成后，装入透析袋。用pH＝7.4的磷酸缓冲溶液透析3d，每天换透析液4次。冷冻干燥后，即得免疫抗原，4℃保存。
乐果的人工抗原制备过程：
1)取10g乐果中间体O,O-二甲基-S-(甲氧基羰基甲基)-二硫代磷酸酯加入至50mL氯仿中。
2)在10mL水中加入1g 1,4-二氨基丁烷和1g环糊精40℃反应5h，下生产乐果半抗原。
3)取40mg乐果半抗原衍生物溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入20mg二环己基碳二亚胺，室温下磁力搅拌，反应过夜。
4)将反应液加入到溶解20mg BSA的硼酸盐缓冲溶液中，磁力搅拌反应5h。
5)待反应完成后，装入透析袋。用pH＝7.4的磷酸缓冲溶液透析3d，每天换透析液4次。冷冻干燥后，即得免疫抗原，4℃保存。
3、抗体的制备
3.1小鼠免疫
将免疫抗原用pH8.0 PBS缓冲液配制成1μg/μL的溶液备用，取健康7周龄的雌性小鼠6只，编号后按常规免疫方案分批进行免疫。第一次免疫，将免疫抗原的PBS溶液与等体积的弗氏完全佐剂充分混合，抽取混匀的乳液进行腹腔多点注射，每只鼠的注射量为200μL；两周后进行第二次免疫，注射方法、注射体积不变，但改用弗氏不完全佐剂；以后按照第二次免疫方案以一周为间隔进行免疫；第三次免疫一周后，从小鼠尾部取少量血，通过间接ELISA法检测小鼠血清抗体效价；待效价至少达到1∶1000后，于融合前三天取同量免疫抗原不加佐剂对小鼠进行尾静脉注射以强化免疫。
3.2细胞融合
细胞融合当天从小鼠尾静脉采血测定抗血清效价，选择血清抗体呈阳性且效价较高者用于细胞融合。取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(PEG)作用下进行融合。融合方案为约1min加完50％PEG，前30秒逐滴加入，后30秒可稍快，吹打1min，静置1.5min，然后逐滴加入RPMI-1640培养基，约6min完成，再缓慢加入10mLRPMI-1640培养基以终止PEG作用，离心5min，弃上清夜，将细胞轻轻悬于20mLRPMI-1640培养基中，置于CO2培养箱待用。用RPMI-1640培养基将饲养细胞配成2×105个/mL的悬浮液，将饲养细胞与融合细胞1∶1混合，并转入培养瓶中培养12-24h。最后750g离心5min收集细胞，用50mLHAT培养基悬浮细胞，分装96孔细胞培养板，每孔加入0.2mL，置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养。
3.3阳性杂交瘤细胞筛选及克隆化
融合后每3-4天半量换液一次。2-3天，骨髓瘤细胞明显退化，5-7后天待骨髓瘤细胞全部死亡，用HT培养基取代HAT培养基，每3-4天半量换液一次。约6-7天出现杂交瘤细胞克隆，细胞大、圆且透亮，在培养板的盖板上画上克隆生长的标记，记录有杂交瘤细胞生长的孔数。采用间接ELISA与竞争ELISA联合应用的方法对杂交瘤进行筛选，先用间接ELISA对所有杂交瘤生长孔的抗体进行初筛，再对阳性孔用竞争ELISA进行抑制实验，对特异性抗体阳性孔的杂交瘤细胞以有限稀释法进行克隆和亚克隆，直至单克隆的杂交瘤克隆化后上清的阳性率是100％，以获得稳定的单克隆杂交瘤细胞株。扩大培养筛选出的单克隆杂交瘤细胞株，使用BALB/C小鼠体内诱生腹水的方法大量制备单克隆抗体。采用正辛酸-硫酸铵沉淀法(CAASP)纯化抗体，从纯化后得到的单克隆抗体溶液中吸取80μL，用PBS缓冲液稀释至2mL，随后用紫外分光光度计分别测定稀释液在260nm及280nm处的吸光度，计算抗体含量。
4、毒死蜱、甲拌磷、乐果抗体纳米颗粒标记
1)最适pH值测试
取若干1.5mL EP管，分别加入1mL银包金纳米颗粒溶液，用25mM K2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；每管分别加入0.01mg毒死蜱、甲拌磷、乐果抗体，混合均匀，室温下放置反应20-40min；每管分别加入100μL 10％NaCl溶液，混合均匀，室温下反应20-40min；观察溶液颜色变化，保持最低深红色pH即为最适pH值。
2)最适标记量测试
取若干1.5ml EP管，分别加入1mL银包金纳米颗粒溶液，用25mM K2CO3将pH调整为最适pH值；每管分别加入0.002、0.004、0.006、0.008、0.010mg毒死蜱、甲拌磷、乐果抗体，混合均匀，室温下放置反应20-40min；每管分别加入100μL 10％NaCl溶液，混合均匀，室温下反应20-40min；观察溶液颜色变化，保持最低深红色抗体量即为最适标记量。
3)免疫标记纳米颗粒制备
取上述银包金纳米颗粒的溶液，按每100mL加入25mM K2CO3调节最适pH值，分别加入最适标记量毒死蜱、甲拌磷、乐果抗体，反应20-40min。加入10％BSA溶液10mL，反应20-40min。在12000r/min条件下离心15min，去上清液，用复溶液定溶至原溶液体积的1/20，复溶液为20mM PBS含有1％BSA、5％蔗糖。将三种纳米颗粒标记复溶物混在一起，按2-10μL/cm喷在2cm宽玻璃纤维素膜上，37℃烘干18～24小时，即得制成银包金纳米颗粒标记抗体结合垫。
5、层析膜包被过程
以0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液将毒死蜱、甲拌磷、乐果抗原配制成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液，将抗鼠IgG配制成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液，用划膜仪以1μL/cm速度分别进行划线包被C、T1、T2、T3线，放置在37度烘箱干燥12小时。
6、检测卡的装配
检测卡装配在温度为20～30℃，湿度为<40％的室内进行，取塑料底板，将已包被的NC膜放置在塑料地板中部粘贴，将银包金纳米颗粒标记抗体结合垫搭在NC膜T线一侧，银包金纳米颗粒标记抗体结合垫搭在NC膜上1mm粘贴，银包金纳米颗粒标记抗体结合垫另一侧搭接粘贴上样品垫，样品垫与试纸下边缘对齐。在NC膜一侧搭接吸样纸，搭在NC膜上1mm粘贴。最后使用切条机将贴好的塑料板切成5mm宽试纸条，再装入塑料卡内，形成检测卡。
7、试纸条工艺参数调试
将不同喷金量的银包金纳米颗粒标记抗体结合垫、包被的试剂进行组合配对，制备成小样，使用标准样品对试剂进行测试，根据T值、C值、T/C值大小和测试梯度结果，寻找出最佳组合。
8、试纸条性能测试
利用上述步骤制备得到的试纸进行样品检测，具体方法如下：
1)提取剂：70％的甲醇水溶液。
2)稀释液：使用0.02M PBS溶液，加入终浓度为1％的tween-20配置成稀释液。
3)标准曲线制备、换算和录入
确定好检测卡工艺参数后，分别用毒死蜱、甲拌磷浓度均为0、20、50、100、200、500、800、1000、1500、2500μg/kg和乐果浓度为0、5、10、20、50、100、200、500、1000μg/kg的混合标准样品对检测卡进行测定，不同浓度的标准样品显示出不同的强度T线，使用胶体金检测仪测定其强度。将标准添加样品浓度除以回收率90％作为测定样品中毒死蜱、克百威的浓度值；制作标准曲线，并将相应参数导入检测仪中，完成仪器曲线参数设置。
4)检测方法
a、使用粉碎机粉碎所需检测样品，并过20目筛网，或者粉碎成浆状；
b、使用小型天平准确称量2g检测待检样品到提取瓶中，加入8mL提取剂，室温下在震荡频率为2～60cpm条件下反应5min；
c、使用离心机或过滤装置过滤，取上清液，用移液器器准确移取40μL清液至160μL稀释液中混合均匀；
d、取出检测卡和上述混合液放入干式恒温仪中5min，温度设定为37℃；
e、用移液器取120μL上述混合液加入检测卡加样孔中，继续在37℃恒温环境下反应8min；
f、将反应完的试纸卡放入检测仪中即可一次性显示出样品中毒死蜱、甲拌磷、乐果的浓度。
5)样品测试
对在市场上或检测机构获得7份样品使用毒死蜱、甲拌磷、乐果三合一定量检测卡进行检测并与气相液相色谱法检测法对比分析其准确性；配制毒死蜱浓度分别为50ppb、100ppb、200ppb的标准样品溶液，甲拌磷浓度分别为10ppb、20ppb、50ppb的标准样品溶液，乐果浓度分别为50ppb、200ppb、500ppb的标准样品溶液，然后使用毒死蜱、甲拌磷、乐果三合一定量检测卡分析检测，每个浓度检测6次分析其精密度。
6)结果
a、准确度检测结果
Figure BDA0003515151550000101
对本组数据做配对样本T检验法，毒死蜱、甲拌磷、乐果的t值分别为0.056、0.013、0.019，t双尾临界(0.05，6)＝2.447，t<t双尾临界(0.05，6)，说明毒死蜱、甲拌磷、乐果三合一定量检测卡检测结果与气相液相色谱法检测结果无显著结果差异。
b、精密度检测结果
毒死蜱检测结果：
Figure BDA0003515151550000102
Figure BDA0003515151550000111
甲拌磷检测结果：
Figure BDA0003515151550000112
乐果检测结果：
Figure BDA0003515151550000113
Figure BDA0003515151550000121
由结果及分析可知，毒死蜱、甲拌磷、乐果三合一定量检测卡重复检测结果变异系数为10～12％之间，平均变异系数小于15％。
检测结果表明本发明毒死蜱、甲拌磷、乐果三合一定量检测卡性能良好，可以快速、准确的检测待检样品中毒死蜱、甲拌磷、乐果的含量，适用于实验室和取样现场的快速定量检测，满足客户对食品中毒死蜱、甲拌磷、乐果快速定量检测要求。
实施例2腐霉利、克百威、多菌灵、毒死蜱四合一定量检测试纸
本实施例的检测试纸制备方法如下：
1、银包金纳米颗粒合成
与实施例1相同。
2、抗原的制备
现将腐霉利的人工抗原制备过程叙述如下：
1)将5mg腐霉利和氟化钾溶于200μL的乙二醇中，90℃水浴加热并磁力搅拌反应24h。所得反应液加入少量单蒸馏水放入-20℃冷冻30min，然后10000r/min离心10min，离心得到的沉淀以200μL二甲基甲酰胺将其溶解，并加入2mg羰基咪唑磁力搅拌反应3h。
2)将15mg BSA(10mg OVA)溶解于400μL0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液中制备蛋白溶液。
3)将1)所得溶液缓慢滴加到2)的溶液中，室温下磁力搅拌过夜。用蒸馏水透析72h。收集偶联物，冷冻干燥即为完全抗原。-20℃保存。
克百威的人工抗原制备过程：
以芳香族伯胺为原料，通过亚硝酸重氮化使克百威生成芳胺重氮盐。再和卵清蛋白(OVA)载体蛋白偶联。
克百威与蛋白质重氮化偶联的操作步骤：
1)用0.1mol/L HCl溶液配制4m mol/L浓度的克百威溶液；
2)滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌；
注：NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/LKI进行监控。游离HNO2可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。
3)溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟；
4)用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解卵清蛋白(OVA)；
5)边搅拌，边加入重氮化的半抗原(防止局部发生酸过量现象)，调节pH到9.5；
6)冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0；
7)用PBS透析2天；
8)-20度保存(浓度为20mg/mL)。
多菌灵的人工抗原制备过程：
1)称取2g多菌灵溶于含少量乙醇钠的80mL无水乙醇的三口瓶中，边搅拌边用滴液管滴加1.2mL氯乙醇，升温，回流1h。
2)温度降至室温，过滤，滤饼用100mL50℃的蒸馏水漂洗，抽干后得浅黄色固体1-羟乙基-2-苯并咪唑氨基甲酸甲酯。
3)称取1-羟乙基-2-苯并咪唑氨基甲酸甲酯0.5894g，2.0g琥珀酸酐溶于5mL无水吡啶中。60℃加热搅拌，回流10h。
4)向吡啶中加入10mL二氯甲烷，之后混合物用10mL 5％的盐酸洗3次，分离二氯甲烷层，残留物用10mL乙醚溶解，之后用10mL水洗3次，乙醚层用无水硫酸镁干燥，得半琥珀酸酐，即1-氧羰乙基丙酸-2-苯并咪唑氨基甲酸甲酯固体。
5)称取1-氧羰乙基丙酸-2-苯并咪唑氨基甲酸甲酯0.2mmol溶于3mL无水DMF中(加无水MgSO4干燥过夜)，开启搅拌。
6)加入40μL三正丁胺，水浴下加入40μL(0.24mmol)由1.5mL无水DMF溶解的氯甲酸异丁酯。4℃搅拌下反应1h，后升至室温1h(反应液I)。
7)称120mg BSA溶于12mL 0.2mol/L pH8.7的硼酸盐缓冲液中，将反应液I于室温搅拌下逐滴加入到蛋白溶液中去，于15℃下搅拌过夜。
8)将偶联物溶液至于透析袋中，4℃搅拌透析。4h换水一次，共换6次，直到透析液中测不出半抗原紫外吸收为止。-20℃保存。
毒死蜱的人工抗原制备过程与实施例1相同。
3、抗体的制备
与实施例1相同。
4、腐霉利、克百威、多菌灵、毒死蜱抗体纳米颗粒标记
1)最适pH值测试
取若干1.5mL EP管，分别加入1mL银包金纳米颗粒溶液，用25mM K2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；每管分别加入0.01mg腐霉利、克百威、多菌灵、毒死蜱抗体，混合均匀，室温下放置反应20-40min；每管分别加入100μL 10％NaCl溶液，混合均匀，室温下反应20-40min；观察溶液颜色变化，保持最低深红色pH即为最适pH值。
3)最适标记量测试
取若干1.5ml EP管，分别加入1mL银包金纳米颗粒溶液，用25mM K2CO3将pH调整为最适pH值；每管分别加入0.002、0.004、0.006、0.008、0.010mg腐霉利、克百威、多菌灵、毒死蜱抗体，混合均匀，室温下放置反应20-40min；每管分别加入100μL 10％NaCl溶液，混合均匀，室温下反应20-40min；观察溶液颜色变化，保持最低深红色抗体量即为最适标记量。
3)免疫标记纳米颗粒制备
取上述银包金纳米颗粒的溶液，按每100mL加入25mM K2CO3调节最适pH值，分别加入最适标记量腐霉利、克百威、多菌灵、毒死蜱抗体，反应20-40min。加入10％BSA溶液10mL，反应20-40min。在12000r/min条件下离心15min，去上清液，用复溶液定溶至原溶液体积的1/20，复溶液为20mM PBS含有1％BSA、5％蔗糖。将三种纳米颗粒标记复溶物混在一起，按2-10μL/cm喷在2cm宽玻璃纤维素膜上，37℃烘干18～24小时，即得制成银包金纳米颗粒标记抗体结合垫。
5、层析膜包被过程
以0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液将腐霉利、克百威、多菌灵、毒死蜱抗原配制成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液，将抗鼠IgG配制成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的溶液，用划膜仪以1μl/cm速度分别进行划线包被C、T1、T2、T3、T4线，放置在37度烘箱干燥12小时。
6、检测卡的装配
与实施例1相同。
7、试纸条工艺参数调试
将不同喷金量的银包金纳米颗粒标记抗体结合垫、包被的试剂进行组合配对，制备成小样，使用标准样品对试剂进行测试，根据T值、C值、T/C值大小和测试梯度结果，寻找出最佳组合。
8、试纸条性能测试
利用上述步骤制备得到的试纸进行样品检测，具体方法如下：
1)提取剂：70％的甲醇水溶液。
2)稀释液：使用0.02M PBS溶液，加入终浓度为1％的tween-20配置成稀释液。
3)标准曲线制备、换算和录入
确定好试纸工艺参数后，分别用腐霉利浓度为0、100、200、500、800、1000、2000、5000、10000μg/kg，克百威浓度为0、10、20、50、100、200、500、800、1000μg/kg，多菌灵浓度为0、20、50、100、200、500、1000、2000、5000μg/kg，毒死蜱浓度均为0、20、50、100、200、500、800、1000、1500、2500μg/kg的混合标准样品对检测卡进行测定，不同浓度的标准样品显示出不同的强度T线，使用检测仪测定其强度。将标准添加样品浓度除以回收率90％作为测定样品中毒死蜱、克百威的浓度值；制作标准曲线，并将相应参数导入检测仪中，完成仪器曲线参数设置。
4)检测方法
与实施例1相同。
5)样品测试
对在市场上或检测机构获得7份样品使用腐霉利、克百威、多菌灵、毒死蜱四合一定量检测卡进行检测并与气相液相色谱法结果检测对比分析其准确性；配制腐霉利浓度为200、500、1000μg/kg，克百威浓度为20、50、100μg/kg，多菌灵浓度为50、100、200μg/kg，毒死蜱浓度均为50、100、200μg/kg的标准样品溶液，使用腐霉利、克百威、多菌灵、毒死蜱四合一定量检测卡分析检测，每个浓度检测6次分析其精密度。
6)结果
a、准确度检测结果
Figure BDA0003515151550000161
对本组数据做配对样本T检验法，腐霉利、克百威、多菌灵、毒死蜱的t值分别为0.022、0.212、0.040、0.127，t双尾临界(0.05，6)＝2.447，t<t双尾临界(0.05，6)，说明腐霉利、克百威、多菌灵、毒死蜱四合一定量检测卡检测结果与气相液相色谱法检测结果无显著结果差异。
b、精密度检测结果
腐霉利检测结果：
Figure BDA0003515151550000162
Figure BDA0003515151550000171
克百威检测结果：
Figure BDA0003515151550000172
多菌灵检测结果：
Figure BDA0003515151550000173
Figure BDA0003515151550000181
毒死蜱检测结果：
Figure BDA0003515151550000182
Figure BDA0003515151550000191
由结果及分析可知，腐霉利、克百威、多菌灵、毒死蜱四合一定量检测卡重复检测结果变异系数为10～12.5％之间，平均变异系数小于15％。
检测结果表明本发明腐霉利、克百威、多菌灵、毒死蜱四合一定量检测卡性能良好，可以一次性快速、准确的检测待检样品中腐霉利、克百威、多菌灵、毒死蜱的含量，适用于实验室和取样现场的快速定量检测，满足客户对食品中腐霉利、克百威、多菌灵、毒死蜱快速定量检测要求。
下面通过实验，对本发明的技术方案作进一步的说明：
实验例1纳米金和银包金纳米颗粒的对比
1.银包金纳米颗粒合成
1.1纳米金颗粒合成
取0.01％氯金酸水溶液100ml加热至沸，搅动下准确加入1％柠檬酸三钠水溶液1.8ml，金黄色的氯金酸水溶液在2分钟内变为红色，继续煮沸15分钟。
1.2银包金纳米颗粒合成
将上述溶液温度调节至40-80℃，加入硝酸银溶液使其含量为0.001-0.1％，搅动下滴加还原剂1％柠檬酸三钠水溶液1.0ml，继续搅拌反应10分钟，所得液体即为银包金纳米溶液。
2.银包金纳米颗粒灰度及表征
银包金纳米颗粒是在纳米金颗粒表面通过化学反应形成一层纳米银壳，该纳米粒子具有纳米金以及纳米银部分性质，既能有效与蛋白牢固结合，且其颜色相对于纳米金更深。用合成的银包金纳米颗粒与抗体偶联后制作成结合垫，制作免疫检测卡，通过扫描仪测试其灰度值，与传统的纳米金颗粒制作的检测卡对比，在同样标记抗体量和工艺条件下，检测同样样品浓度，检测卡层析完毕，如下表所示，在检测线位置滞留色带灰度银包金纳米颗粒是纳米金颗粒的2-5倍，因此其检测灵敏度对应提高2-5倍。
Figure BDA0003515151550000201
表中：限量值是国家标准所允许的最高含量值，“-”值太低检测仪已经不能很好的识别。
3.银包金纳米颗粒标记抗体相关数据，ph值、标记量、稳定性与胶体金对比
分别使用银包金纳米颗粒和常规的胶体金对毒死蜱抗体、克百威抗体、乐果抗体进行标记处理，标记后纳米粒子-抗体偶联物最大吸收峰在400～532nm之间，OD值变化波动小，当由于外界原因破坏其稳定性时，胶体金产生聚集，其颜色会先变黑，最后为无色；其最大吸收峰逐渐大于正常峰值；同时其OD值逐渐变小至0。对标记金标进行如下测试：
1)保存上述金标于4℃冰箱，观察随时间增加，使用紫外分光光度计测定金标吸收峰和OD值变化。
结果如下表：
Figure BDA0003515151550000202
Figure BDA0003515151550000211
由结果可知，新型银包金纳米颗粒金标有效提高了金标保存稳定性。且随着时间增加常规金标逐渐变紫色聚集。
2)向上述金标中加入不同量10％NaCl溶液，30min后使用紫外测定其吸收峰和OD值变化。
结果如下表：
Figure BDA0003515151550000212
由结果可知，新型银包金纳米颗粒金标有效提高了金标对盐的稳定性。
3)向上述金标中加入不同量0.1M盐酸，30min后使用紫外测定其吸收峰和OD值变化.
结果如下表：
Figure BDA0003515151550000213
Figure BDA0003515151550000221
由结果可知，新型银包金纳米颗粒金标有效提高了金标对酸的稳定性。
4)向上述金标中加入不同量1M氢氧化钠，30min后使用紫外测定其吸收峰和OD值变化。
结果如下表：
Figure BDA0003515151550000222
由结果可知，新型银包金纳米颗粒金标有效提高了金标对碱的稳定性。
由上述结果可以看出，新型银包金纳米颗粒与抗体的结合更加稳定，不受酸碱环境和离子强度影响，耐酸、耐碱、耐盐。
通过上述实施例和实验例可以看到，本发明基于胶体金免疫层析法提供一种具有多合一检测功能的农药检测试纸，其具有特异性好、灵敏度高、能够准确定量、能够同时检测多种组分和前处理简单等优点。此外，本发明通过优选金纳米颗粒的选择，能够有效地提高标记抗体的稳定性。因而，本发明具有很好的应用前景。

Claims (10)

1.一种多合一农药残留定量检测试纸，其特征在于：包括依次连接的样品垫、胶体金结合垫和层析膜；
所述胶体金结合垫上附着有至少两种农药的金纳米颗粒标记抗体；
所述层析膜上设置有质控线和至少两条检测线，每条检测线采用一种农药的抗原包被而成；
所述农药选自毒死蜱、甲拌磷、乐果、啶虫脒、多菌灵、腐霉利、甲氰菊酯、克百威、异丙威、百菌清、氟虫氰、对硫磷、涕灭威、三唑酮、水胺硫磷或对硫磷；
所述农药的抗原通过将农药分子与大分子蛋白偶联形成，采用如下方法之一合成：
方法1，对于含有羧基的农药，采用碳二亚胺法、活化酯法或混合酸酐法，
方法2，对于含有氨基的农药，采用重氮法、碳二亚胺法或戊二醛法，
方法3，对于含有羟基的农药，采用琥珀酸酐法、过碘酸氧化法或氯乙酸钠法。
2.按照权利要求1所述的检测试纸，其特征在于：所述农药的金纳米颗粒标记抗体通过将农药的抗体与金纳米颗粒结合得到，所述农药的抗体通过将农药的抗原免疫动物得到。
3.按照权利要求1所述的检测试纸，其特征在于：所述金纳米颗粒为银包金纳米颗粒，和/或，所述金纳米颗粒的尺寸为10-50nm。
4.按照权利要求1所述的检测试纸，其特征在于：所述大分子蛋白为牛血清蛋白或卵清蛋白。
5.按照权利要求1所述的检测试纸，其特征在于：所述农药的种类为毒死蜱、甲拌磷和乐果，所述毒死蜱的抗原采用碳二亚胺法制备得到，所述甲拌磷的抗原采用碳二亚胺法制备得到，所述乐果的抗原采用碳二亚胺法制备得到。
6.按照权利要求1所述的检测试纸，其特征在于：所述农药的种类为腐霉利、克百威、多菌灵和毒死蜱，所述腐霉利的抗原采用琥珀酸酐法制备得到，所述克百威的抗原采用重氮法制备得到，所述多菌灵的抗原采用活化酯法或混合酸酐法制备得到，所述毒死蜱的抗原采用碳二亚胺法制备得到。
7.权利要求1-6任一项所述的检测试纸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，制备农药的抗原和金纳米颗粒；
步骤2，在层析膜上进行划线包被，每一种农药的抗原各划一条检测线，用抗鼠IgG划一条质控线；
步骤3，利用农药的抗原制备得到农药的抗体；
步骤4，将所述农药的抗体和金纳米颗粒结合，制成金纳米颗粒标记抗体；
步骤5，将金纳米颗粒标记抗体喷在胶体金结合垫上；
步骤6，将所述胶体金结合垫和所述层析膜作为部件，加上其他胶体金免疫层析法试纸的必要部件，组成得到多合一农药残留定量检测试纸。
8.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤2中，用划膜仪以0.5-2μL/cm的速度进行划线包被，包被用的溶液中农药的抗原浓度各为0.1-3mg/ml；
和/或，步骤5中，将含有农药的抗体的金纳米颗粒标记抗体的溶液以2-10μL/cm的用量喷在胶体金结合垫上，所述含有农药的抗体的金纳米颗粒标记抗体的溶液含有如下成分：PBS 2mM、BSA 0.1-5wt.％、蔗糖1-20wt.％、tween-20 0.01-1wt.％、农药的抗体各0.1-2mg/mL。
9.一种农药残留的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，采用提取剂提取样品，分离后得上清液；
步骤2，用稀释液稀释所述上清液，得到供试品溶液；
步骤3，将供试品溶液滴至权利要求1-6任一项所述的检测试纸的样品垫进行检测。
10.按照权利要求9所述的检测方法，其特征在于：所述提取剂为甲醇水溶液，和/或，所述稀释液含有如下成分：PBS 0.2M、tween-20 0.1-10wt.％。
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