CN217787113U - 一种基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种基质金属蛋白酶‑3胶体金免疫快速检测试剂板，包括外壳和设于外壳内的试纸条，试纸条包括背衬板，背衬板上沿层析方向依次设有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫和胶体金结合垫之间、胶体金结合垫和硝酸纤维素膜之间、硝酸纤维素膜和吸水垫之间均为重叠连接，胶体金结合垫上包被有基质金属蛋白酶‑3抗体1与胶体金的结合物，硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设有检测T线和质控C线，检测T线包被有基质金属蛋白酶‑3抗体2，质控C线包被有羊抗鼠IgG抗体。本实用新型检测速度快，体积小，便于携带，且成本低，操作简便，易于在社区及基层医疗机构广泛使用。

Description

一种基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板

技术领域

本实用新型涉及生物检测装置技术领域，特别是涉及一种基质金属蛋白酶-3 胶体金免疫快速检测试剂板。

背景技术

基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP-3)是一种主要由滑膜细胞、软骨细胞产生，能够破坏胶原、降解关节软骨的蛋白酶，在类风湿关节炎的骨破坏中发挥重要作用。有研究表明，人体血液循环中MMP-3的水平与类风湿关节炎(RA)患者骨破坏程度相关。

研究表明，早期RA患者的MMP-3水平显著升高，即使在C-反应蛋白(CRP) 和/或红细胞沉降率(ESR)正常的RA患者中，MMP-3水平也显著高于骨关节炎(OA)组和健康对照组。CRP和ESR是常用于评价RA疾病活动性的实验室指标，但病程较短的早期RA患者这些指标的变化不明显。在病程较短的RA患者中，MMP-3有较高的阳性率，病程6个月内的极早期RA患者MMP-3阳性率高于CRP，MMP-3对于CRP正常的患者有辅助诊断和评估的价值，尤其是在CRP或ESR这样的常用实验室指标正常的情况下，MMP-3较高的阳性率提示MMP-3水平的检测可以为早期RA患者的诊断提供帮助。

MMP-3常用的检测方法有：化学发光法、胶乳颗粒增强免疫比浊法等。但化学发光法、胶乳颗粒增强免疫比浊法需要使用大型分析仪器进行检测，仪器费用高，占地面积比较大，仅大型医疗机构能够使用，广泛存在的社区诊所及基础医疗机构则没有条件配备。

实用新型内容

为此，本实用新型的目的在于提出一种基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板，检测速度快，体积小，便于携带和搬移，且成本低，操作简便，易于在社区及基层医疗机构广泛使用。

一种基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板，包括外壳和设于所述外壳内的试纸条，所述试纸条包括背衬板，所述背衬板上沿层析方向依次设有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫和所述胶体金结合垫之间、所述胶体金结合垫和所述硝酸纤维素膜之间、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫之间均为重叠连接，所述胶体金结合垫上包被有基质金属蛋白酶-3 抗体1与胶体金的结合物，所述硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设有检测T线和质控C线，所述检测T线包被有基质金属蛋白酶-3抗体2，所述质控C线包被有羊抗鼠IgG抗体；所述样品垫和所述胶体金结合垫之间、所述胶体金结合垫和所述硝酸纤维素膜之间、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫之间的重叠区域长度为1-2mm。

作为一种可选的实施方式，所述样品垫和所述胶体金结合垫之间的重叠区域中，所述样品垫位于所述胶体金结合垫的上方；所述胶体金结合垫和所述硝酸纤维素膜之间的重叠区域中，所述胶体金结合垫位于所述硝酸纤维素膜的上方；所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫之间的重叠区域中，所述吸水垫位于所述硝酸纤维素膜的上方。

作为一种可选的实施方式，所述外壳包括顶盖和底盖，所述顶盖与所述底盖可拆卸连接，所述顶盖上设有加样孔和观察孔，所述加样孔与所述样品垫对应设置，所述观察孔与所述硝酸纤维素膜对应设置。

作为一种可选的实施方式，所述背衬板的底部设有PVC板。

作为一种可选的实施方式，所述样品垫和所述胶体金结合垫均由玻璃纤维制成。

作为一种可选的实施方式，所述吸水垫由滤纸制成。

根据本实用新型提供的基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板，具有以下有益效果：

(1)操作简便快速，本实用新型将免疫层析反应所需的耗材都整合到试剂条中，在样品垫上滴样后，抗原抗体反应在硝酸纤维素膜上快速进行，大大缩短了检样时间，且样品无需处理，整个检测过程仅需5～15min分钟；

(2)该检测试剂板体积小、成本低、便于携带，配合小型的仪器(如POCT 设备)还能实现定量检测，易于在社区及基层医疗机构广泛使用。

附图说明

本实用新型实施例的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是本实用新型一实施例提供的基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板中试纸条的结构示意图；

图2是本实用新型一实施例提供的基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板中顶盖的结构示意图；

图3是本实用新型一实施例提供的基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板的测试标准曲线；

图4是本实用新型一实施例提供的基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板测试的检测值与胶乳免疫比浊法测试结果的相关性。

具体实施方式

为使本实用新型实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本实用新型一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。

请参阅图1，本实用新型一实施例提供的一种基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板，包括外壳和设于所述外壳内的试纸条10，所述试纸条10包括背衬板11，所述背衬板11上沿层析方向依次设有样品垫12、胶体金结合垫13、硝酸纤维素膜14和吸水垫15。

本实施例中，所述背衬板11的底部设有PVC板16。具体可以通过使用不干胶将PVC板16固定在背衬板11的底部，起固定支撑作用。

本实施例中，所述样品垫12由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液的作用。

所述胶体金结合垫13上包被有基质金属蛋白酶-3抗体1与胶体金的结合物。本实施例中，所述胶体金结合垫13均由玻璃纤维制成，其上标记有基质金属蛋白酶-3抗体1与胶体金的结合物，是检测样本与金标抗体发生反应的场所。

所述硝酸纤维素膜14是样本结果检测区，所述硝酸纤维素膜14上沿层析方向依次设有检测T线141和质控C线142，所述检测T线141包被有基质金属蛋白酶-3抗体2，所述质控C线142包被有羊抗鼠IgG抗体。

所述吸水垫15由滤纸制成，其作用是将层析过来多余的溶液吸收。

所述样品垫12和所述胶体金结合垫13之间、所述胶体金结合垫13和所述硝酸纤维素膜14之间、所述硝酸纤维素膜14和所述吸水垫15之间均为重叠连接，能够保证层析作用从样品垫12到吸水垫15相邻各部分顺利进行，同时也保证了样品溶液与样品垫12有充分反应时间，样品垫12上的缓冲体系可以中和样品溶溶液的酸碱度，保证样品溶液中的有效成分与胶体金结合垫的金标抗体顺利反应。

优先的，所述样品垫12和所述胶体金结合垫13之间、所述胶体金结合垫 13和所述硝酸纤维素膜14之间、所述硝酸纤维素膜14和所述吸水垫15之间的重叠区域长度为1-2mm。

本实施例中，所述样品垫12和所述胶体金结合垫13之间的重叠区域中，所述样品垫12位于所述胶体金结合垫13的上方；所述胶体金结合垫13和所述硝酸纤维素膜14之间的重叠区域中，所述胶体金结合垫13位于所述硝酸纤维素膜14的上方；所述硝酸纤维素膜14和所述吸水垫15之间的重叠区域中，所述吸水垫15位于所述硝酸纤维素膜14的上方。

请参阅图2，本实施例中，所述外壳包括顶盖21和底盖(图未示)，外壳用于固定试纸条10及标示功能区。

所述顶盖21与所述底盖可拆卸连接，所述顶盖21上设有加样孔211和观察孔212，所述加样孔211与所述样品垫12对应设置，便用从加样孔211中将待测样品加到样品垫12上，所述观察孔212与所述硝酸纤维素膜14对应设置，便于观察检测T线141和质控C线142。

下面以一具体示例对上述基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板的检测效果进行验证。

1.基质金属蛋白酶3抗体的制备

取6～8周龄雌性Balb/c小鼠，将基质金属蛋白酶3抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化，皮下注射，剂量为100μg/只，以后每隔2周加强免疫1次，改用不完全佐剂，腹腔注射。融合前3d强化免疫1次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行：将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:5的比例混合，在50％PEG作用下融合，然后用HAT培养液悬浮，再分种于96孔培养板中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

由于杂交瘤细胞通过选择性培养而获得的杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。所以融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/8时，即采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞，筛选出能分泌特异性抗体的细胞系。以15mg/L 基质金属蛋白酶3抗原包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRP(1：1000)，OPD显色。经2～3次筛选找出均呈阳性的孔，该细胞系即为可制备抗体的细胞株。

用有限稀释法对所选择的细胞株进行克隆化。制备饲养细胞悬液(同融合前准备)。对阳性孔细胞计数，并调整细胞数在(1～5)×10³/ml。取100个细胞放入5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔，加A、B、C 三排，为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100μl/孔，加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下 2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100μl/ 孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl/孔。第8～9天时，待肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。

体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。BALB/c鼠先腹腔注射0.5ml液体石蜡，1～2周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多而小鼠濒于死亡之前，处死小鼠，抽取腹水。

经过测试所选的第一种基质金属蛋白酶3抗体来源于细胞株克隆号：Clone#5E3；所选的第二种基质金属蛋白酶3抗体来源于细胞株克隆号： Clone#7B4。

2.胶体金溶液的制备

取约1L双蒸水，放入带搅拌棒的洁净锥形瓶内，煮沸后弃去(保证洁净度)。取495ml新鲜制备的双蒸水，加热至沸腾；加入5ml 1％HAuCl4，不停搅拌；取1.4ml 1％柠檬酸三钠，迅速加入沸腾的金溶液中，继续搅拌煮沸30min，冷却后，透射电镜下直接观测金颗粒平均直径大约为100nm，即保存备用。

3.基质金属蛋白酶-3抗体1与胶体金的结合物的制备

取制备好的100ml胶体金溶液，用0.2mol/L碳酸钾溶液调pH到7.0置于磁力搅拌器上，800rpm速率搅拌下加入1.5mg第一种基质金属蛋白酶3抗体(细胞株克隆号：Clone#5E3)，搅拌30min，再逐滴加入2ml 3％的PEG8000，搅拌 15min。所得溶液18000rpm离心45min，弃上清液，加入10mLpH 7.4PBS缓冲液清洗2次。沉淀粒子加入含2％BSA的PBS缓冲液(pH7.4)5mL重悬，4℃保存备用。

4.试纸条的标记及检测试剂板的组装

参照图1的结构，将得到的基质金属蛋白酶-3抗体1与胶体金的结合物喷涂到胶体金结合垫13上，37℃干燥。将羊抗鼠IgG抗体和第二种基质金属蛋白酶3抗体配制成质控线工作液(C)和检测线工作液(T)，用点膜划线机将质控线和检测线工作液划膜至硝酸纤维素膜14上，以形成检测T线141和质控C线 142，37℃烘干备用。将样品垫12、胶体金结合垫13、硝酸纤维素膜14、吸水垫15切割至适合尺寸，依次贴在底部粘有PVC板16的背衬板11上，使样品垫 12和所述胶体金结合垫13之间、所述胶体金结合垫13和所述硝酸纤维素膜14 之间、所述硝酸纤维素膜14和所述吸水垫15之间的重叠区域长度均为2mm，且所述样品垫12和所述胶体金结合垫13之间的重叠区域中，所述样品垫12位于所述胶体金结合垫13的上方；所述胶体金结合垫13和所述硝酸纤维素膜14 之间的重叠区域中，所述胶体金结合垫13位于所述硝酸纤维素膜14的上方；所述硝酸纤维素膜14和所述吸水垫15之间的重叠区域中，所述吸水垫15位于所述硝酸纤维素膜14的上方。

测试结果一：基质金属蛋白酶3胶体金免疫快速检测试剂板的标准曲线

称取适量基质金属蛋白酶3抗原，加入到15mmol/L的pH 7.4PBS缓冲液中充分溶解，并分别配制0、25、50、100、200、400、800ng/ml系列浓度梯度的校准工作溶液。取100μl样本加入样品垫12上，反应10min。待反应完成，使用配套的检测仪检测数值，绘制标准曲线。

结果分析：结果见图3。从图3，可以看出，本实用新型制备的试剂检测板校准曲线经多项式拟合，线性相关性好，可准确用于临床检测。

测试结果二：本实用新型试剂板检测值与胶乳免疫比浊法测试结果的相关性

用本实用新型试剂板检测值与市售基质金属蛋白酶-3检测试剂(胶乳比浊法)测定血清样本中的基质金属蛋白酶-3含量，对两个试剂测定的结果进行回归分析，考察两种试剂盒检测结果的相关性。

结果分析：试验结果见图4。从试验结果可发现，运用本实用新型检测的样本值与市售产品有很好的相关性，相关系数R²为0.9596。但运用本实用新型检测样本中的MMP-3，检测试剂板体积小、成本低、便于携带和搬移，易于在社区及基层医疗机构广泛使用。

综上，根据本实用新型提供的基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板，具有以下有益效果：

(1)操作简便快速，本实用新型将免疫层析反应所需的耗材都整合到试剂条中，在样品垫上滴样后，抗原抗体反应在硝酸纤维素膜上快速进行，大大缩短了检样时间，且样品无需处理，整个检测过程仅需5～15min分钟；

(2)该检测试剂板体积小、成本低、便于携带，配合小型的仪器(如POCT 设备)还能实现定量检测，易于在社区及基层医疗机构广泛使用。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本实用新型的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本实用新型的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本实用新型的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本实用新型的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板，包括外壳和设于所述外壳内的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括背衬板，所述背衬板上沿层析方向依次设有样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫和所述胶体金结合垫之间、所述胶体金结合垫和所述硝酸纤维素膜之间、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫之间均为重叠连接，所述胶体金结合垫上包被有基质金属蛋白酶-3抗体1与胶体金的结合物，所述硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设有检测T线和质控C线，所述检测T线包被有基质金属蛋白酶-3抗体2，所述质控C线包被有羊抗鼠IgG抗体；所述样品垫和所述胶体金结合垫之间、所述胶体金结合垫和所述硝酸纤维素膜之间、所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫之间的重叠区域长度为1-2mm。

2.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板，其特征在于，所述样品垫和所述胶体金结合垫之间的重叠区域中，所述样品垫位于所述胶体金结合垫的上方；所述胶体金结合垫和所述硝酸纤维素膜之间的重叠区域中，所述胶体金结合垫位于所述硝酸纤维素膜的上方；所述硝酸纤维素膜和所述吸水垫之间的重叠区域中，所述吸水垫位于所述硝酸纤维素膜的上方。

3.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板，其特征在于，所述外壳包括顶盖和底盖，所述顶盖与所述底盖可拆卸连接，所述顶盖上设有加样孔和观察孔，所述加样孔与所述样品垫对应设置，所述观察孔与所述硝酸纤维素膜对应设置。

4.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板，其特征在于，所述背衬板的底部设有PVC板。

5.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板，其特征在于，所述样品垫和所述胶体金结合垫均由玻璃纤维制成。

6.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-3胶体金免疫快速检测试剂板，其特征在于，所述吸水垫由滤纸制成。

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