CN116990512A - 一种基质金属蛋白酶-9检测试剂盒 - Google Patents

一种基质金属蛋白酶-9检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基质金属蛋白酶‑9检测试剂盒，涉及生物检测技术领域。所述的试剂盒包括金标垫，所述的金标垫使用金标液包被，将胶体金标记的基质金属蛋白酶‑9抗体1使用重悬液复溶后得到金标液；所述的重悬液包括牛血清白蛋白、皂苷、亚氨基乙二酸、Brij、蔗糖和对羟基苯甲酸。本发明的试剂盒检测的灵敏度和准确性高，并且可快速检测人眼分泌物中是否含有基质金属蛋白酶‑9，可用于判断被检者是否患有干眼症。

Description

一种基质金属蛋白酶-9检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基质金属蛋白酶-9检测试剂盒。
背景技术
干眼症是由泪液的含量、性质或泪液动力学异常引起的泪膜稳定性下降或眼表受损，从而导致眼部不适症状及视功能障碍的一类疾病。干眼症发病程度由轻到重，轻度为眼部不适的偶发症状，重度为介入治疗的慢性病，发病过程中有眼表炎症和泪膜渗透压增高现象。其中炎症机制被认为是慢性干眼症的一个潜在原因。
MMP-9（基质金属蛋白酶，matrix metalloproteinases）是由眼表上皮细胞应激状态下产生的蛋白水解酶，MMP-9位于染色体的20q11.1-13.1，26-27kbp，是由13个外显子和9个内含子构成的，其相对分子质量为92kDa。基质金属蛋白酶-9的活性升高破坏角膜上皮，从而导致眼表屏障功能紊乱，角膜上皮脱落增加，角膜表面不规则。MMP-9是一种非特异性炎症标志物，而干眼症患者泪液中MMP-9水平明显高于正常人，表明MMP-9在干眼症的发生发展中具有重要的临床价值。目前临床上常用于诊断干眼症的检查包括泪膜破裂时间、角膜荧光素染色和泪液分泌实验等。
中国专利CN114252609A中公开了一种基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒及其检测方法，所述的试剂盒的组分包括：磁珠微球试剂M盒酶标试剂R，所述的磁珠微球试剂M包括包被有第一基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的磁性微球，所述酶标试剂R的组分包括标记有第二基质金属蛋白酶-9单克隆抗体的酶液。该专利中提供的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒基于磁微粒化学发光免疫分析法，用试剂盒中磁珠微球试剂M和酶标试剂R检测待测样本，通过仪器增强终反应信号，产生光信号在103-108之间，相比其他检测平台，大大提高了检测试剂的线性范围，从而提高了敏感性和精密度，使试剂盒的检测线性范围宽，为20pg/mL-40000pg/mL。
中国专利CN110824164A中公开了一种同时检测基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-2的系统及其制备方法和应用，所述的系统包括聚多巴胺纳米微球-修饰荧光素的核酸适配体纳米传感器和脱氧核糖核酸酶；所述的聚多巴胺纳米微球-修饰荧光素的核酸适配体纳米传感器由修饰FAM荧光素的基质金属蛋白酶-9特异性结合的适配体和修饰TexasRed荧光素的基质金属蛋白酶-2特异性结合的适配体，加入到聚多巴胺纳米微球中形成。该发明的基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒具有反应条件温和，成本低廉的优点，但其灵敏度和准确性等有待改善。
目前，现有技术中公开的检测基质金属蛋白酶-9的试剂盒较少，且检测方法还有待改进，检测的灵敏度和准确性等较差，因此，提供一种检测范围宽、灵敏度高、稳定性好的基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种基质金属蛋白酶-9检测试剂盒，具体是一种灵敏度和准确性高的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒，解决了现有技术中基质金属蛋白酶-9检测试剂盒灵敏度和准确性较低的问题。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种基质金属蛋白酶-9检测试剂盒，所述的试剂盒包括金标垫，所述的金标垫使用金标液包被，将胶体金标记的基质金属蛋白酶-9抗体1使用封闭液封闭后再采用重悬液复溶后得到金标液；
所述的重悬液包括牛血清白蛋白、皂苷、亚氨基乙二酸、Brij、蔗糖和对羟基苯甲酸。
优选地，所述的重悬液包括以下浓度的组分：1-5%牛血清白蛋白、0.1-1%皂苷、0.5-3%亚氨基二乙酸、0.1-1%Brij、1-2%蔗糖和0.1-0.5%对羟基苯甲酸。
进一步优选地，所述的重悬液包括以下浓度的组分：3%牛血清白蛋白、0.5%皂苷、2%亚氨基二乙酸、0.8%Brij、2%蔗糖和0.3%对羟基苯甲酸。
具体地，所述的重悬液中上述各组分的浓度为各组分在体系中的终浓度。
进一步优选地，所述的重悬液中还包括缓冲液，所述的缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种。
再进一步优选地，所述的缓冲液为PBS缓冲液。
进一步优选地，所述的缓冲液的pH为7-9。
再进一步优选地，所述的PBS缓冲液的浓度为0.01-0.5mol/L。
优选地，所述的重悬液复溶前还包括加入封闭液进行封闭步骤。
进一步优选地，所述的封闭液包括PBS缓冲液、牛血清白蛋白、蔗糖和吐温20。
再进一步优选地，封闭液中各组分按照终浓度包括0.1-0.5M PBS缓冲液、1-4%牛血清白蛋白、1-5%蔗糖和0.1-0.5%吐温-20。
更进一步优选地，封闭液中各组分按照终浓度包括0.2M PBS缓冲液、2%牛血清白蛋白、3%蔗糖和0.3%吐温-20。
优选地，所述的试剂盒包括反应垫，所述的反应垫上包括包被有基质金属蛋白酶-9抗体2的检测线和包被有羊抗鼠免疫球蛋白IgG的质控线；所述的检测线上包被的基质金属蛋白酶-9抗体2的浓度为0.8-1.5mg/mL；所述的质控线上包被的羊抗鼠免疫球蛋白IgG的浓度为0.5-1.5mg/mL。
进一步优选地，所述的基质金属蛋白酶-9单克隆抗体2的浓度为1mg/mL。所述的羊抗鼠免疫球蛋白IgG的浓度为1mg/mL。
优选地，所述的试剂盒的检测样本选自眼分泌物、房水、泪液、玻璃体中的一种或多种。
进一步优选地，所述的试剂盒的检测样本为眼分泌物。
再进一步优选地，所述的试剂盒的检测样本为人眼表冲洗液。
更进一步优选地，所述的人眼表冲洗液的采集包括以下步骤：
（1）使被检者脸部保持水平，用手指拉开下眼睑，暴露出下眼睑穹窿部，被检者眼球向上眼睑方向转动，将100μL生理盐水缓慢滴入下眼睑穹窿部；
（2）被检者转动眼球，使生理盐水充分混合眼表液，5秒后头部向颞侧倾斜，用EP管紧贴被检者外眦处收集自然流出的液体。
优选地，所述的试剂盒的检测方法为：将待测样本加入到上述的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒中，进行结果分析。
进一步优选地，所述的试剂盒中待测样本的上样量为50-80μL。
再进一步优选地，所述的待测样本的上样量为50μL。
进一步优选地，所述的结果分析为：
（1）当待测样本加入到试剂盒中8-10分钟时，检测线和质控线均可见，判定检测结果为阳性；
（2）当待测样本加入到试剂盒中8-10分钟时，质控线可见，检测线不可见，判定检测结果为阴性；
（3）当待测样本加入到试剂盒中8-10分钟时，检测线和质控线均不可见，判定检测结果为无效。
具体地，所述的试剂盒包括检测试纸条和用于包装检测试纸条的卡盒。
进一步具体地，所述的检测试纸条包括底板、样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫。
再进一步具体地，所述的样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫顺次粘在底板上。
优选地，所述的金标垫上喷涂有金标液。
优选地，所述的反应垫的材质为硝酸纤维素膜，所述的硝酸纤维素膜上包括检测线和质控线。
进一步优选地，所述的硝酸纤维素膜的孔径为6μm。
又一方面，本发明提供了基质金属蛋白酶-9检测试剂盒的制备方法，包括金标液的制备，金标液的制备包括以下步骤：
（1）胶体金的制备：在沸腾的氯金酸溶液中加入柠檬酸三钠溶液，当溶液的颜色由灰黑色变为酒红色时，继续反应，室温冷却，得胶体金溶液；
（2）抗体标记：将基质金属蛋白酶-9抗体1加入至胶体金溶液中进行反应，得到胶体金标记的基质金属蛋白酶-9抗体1；
（3）封闭：将胶体金标记基质金属蛋白酶-9抗体1溶液中加入封闭液；
（4）重悬：将封闭后的胶体金标记基质金属蛋白酶-9抗体1进行离心，弃上清，沉淀用重悬液进行重悬，得胶体金试剂。
优选地，步骤（1）中所述的氯金酸溶液的浓度为1-3%；
进一步优选地，步骤（1）中所述的氯金酸溶液的浓度为1%；
优选地，步骤（1）中所述的柠檬酸三钠溶液的浓度为0.5-2%；
进一步优选地，步骤（1）中所述的柠檬酸三钠溶液的浓度为1.5%。
优选地，步骤（1）中所述的氯金酸溶液与柠檬酸三钠溶液的体积比为1：（0.5-3）；
进一步优选地，步骤（1）中所述的氯金酸溶液与柠檬酸三钠溶液的体积比为1:1.2。
优选地，步骤（1）中所述的继续反应的时间为6-10min；
进一步优选地，步骤（1）中所述的继续反映的时间为8min。
优选地，制备成胶体金溶液后，用紫外-可见光分光光计在400-600nm范围内扫描胶体金溶液，最大的吸收波长为525nm，而且吸收峰的宽度较小，说明胶体金溶液的质量较好。
优选地，所述的胶体金的粒径为20-30nm。
进一步优选地，步骤（2）中所述的胶体金溶液的pH为8.0。
再进一步优选地，调节pH的试剂选自硼酸溶液、碳酸钾溶液中的一种或多种。
进一步优选地，步骤（2）中所述的反应的时间为20-60min；再进一步优选地，所述的反应的时间为30min。
优选地，步骤（2）中所述的基质金属蛋白酶-9抗体1与胶体金溶液的质量体积比（μg/mL）为（10-50）：1。
进一步优选地，步骤（2）中所述的基质金属蛋白酶-9抗体1与胶体金溶液的质量体积比（μg/mL）为40：1。
优选地，步骤（3）中所述的封闭液包括PBS缓冲液、牛血清白蛋白、蔗糖和吐温20。
进一步优选地，步骤（3）中所述的封闭液各组分按照终浓度包括0.1-0.5M PBS缓冲液、1-4%牛血清白蛋白、1-5%蔗糖和0.1-0.5%吐温-20。
进一步优选地，步骤（3）中加入封闭液后还包括混匀步骤，所述的混匀的时间为5-30min；更进一步优选地，所述的混匀的时间为10min。
优选地，步骤（4）中所述的重悬液包括缓冲液、牛血清白蛋白、皂苷、亚氨基乙二酸、Brij、蔗糖和对羟基苯甲酸。
进一步优选地，步骤（4）中所述的重悬液包括1-5%牛血清白蛋白、0.1-1%皂苷、0.5-3%亚氨基二乙酸、0.1-1%Brij、1-2%蔗糖和0.1-0.5%对羟基苯甲酸。
再进一步优选地，步骤（4）中所述的重悬液包括3%牛血清白蛋白、0.5%皂苷、2%亚氨基二乙酸、0.8%Brij、2%蔗糖和0.3%对羟基苯甲酸。
进一步优选地，步骤（4）所述的重悬液还包括缓冲液；
再进一步优选地，所述的缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种。
更进一步优选地，所述的缓冲液为PBS缓冲液。
更进一步优选地，所述的PBS缓冲液的浓度为0.01-0.5mol/L。
优选地，步骤（4）中所述的离心的条件为4℃，8000-12000rpm下，离心30-50min；
再进一步优选地，步骤（4）中所述的离心的转速为10000rpm，离心的时间为45min。
根据本发明的一些实施方式，所述的试剂盒的制备包括以下步骤：
（1）用胶体金标记的基质金属蛋白酶-9单克隆抗体溶液（金标液）喷涂金标垫，制得金标垫；
（2）在反应垫的检测线和质控线上分别喷涂基质金属蛋白酶-9单克隆抗体2和羊抗鼠免疫球蛋白IgG，制得包被后的反应垫；
（3）将样品垫、金标垫、反应垫、吸水垫依次粘贴在底板上，制得检测试纸条；
（4）将检测试纸条装入卡壳制得检测试剂盒。
优选地，步骤（1）中，金标液喷涂量为1-3μL/mm。
优选地，步骤（2）中检测线的基质金属蛋白酶-9抗体2的浓度为0.8-2.0mg/mL，喷涂量为0.05-0.2μL/mm；质控线上羊抗鼠免疫球蛋白IgG的包被浓度为0.5-1.5mg/mL，喷涂量为0.05-0.2μL/mm。
进一步优选地，所述的样品垫的宽度为20-30mm，金标垫的宽度为5-10mm，反应垫的宽度为20-30mm，吸水垫的宽度为15-30mm。
根据本发明的一些实施方式，所述的检测线与质控线的间距≥5mm。
又一方面，本发明提供了上述的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒或上述的制备方法制得的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒在制备检测干眼症产品中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明使用胶体金免疫层析法检测基质金属蛋白酶-9的含量，本发明提供的检测基质金属蛋白酶-9的试剂盒所需要的样本量少，检测的性能稳定，具有较高的灵敏性和特异性，操作简便，检测结果的准确性高，适用于干眼症的快速检测。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
实施例1 基质金属蛋白酶-9的检测试剂盒的制备
一、金标垫的制备
（1）胶体金的制备
向100mL的锥形瓶中加入1mL 1%沸腾的氯金酸溶液，再加入0.8mL 2%柠檬酸三钠溶液，当溶液的颜色由灰黑色变为酒红色时，继续反映8min，室温冷却，用超纯水定容至100mL，用紫外-可见光分光光计在400-600nm范围内扫描胶体金溶液，最大的吸收波长为525nm。
（2）抗体标记
用硼酸溶液调节胶体金溶液的pH为8.5，将30μg基质金属蛋白酶-9抗体1加入至1mL胶体金溶液中进行反应30min，反应期间不断搅拌，得到胶体金标记的基质金属蛋白酶-9抗体1。
（3）封闭
向步骤（2）中制备的胶体金标记基质金属蛋白酶抗体的溶液中再加入200μL 封闭液，封闭液中包括0.1M PBS缓冲液、3%牛血清白蛋白、0.2%吐温-20和5%蔗糖，混匀10min。
（4）重悬
将封闭后的金标抗体在4℃，10000rpm条件下，离心30min，弃上清，沉淀用重悬液进行重悬。所述的重悬液包括0.1mol/L PBS缓冲液、3%牛血清白蛋白、0.5%皂苷、2%亚氨基二乙酸、0.8% Brij、2%蔗糖和0.3%对羟基苯甲酸，PBS缓冲液的pH为8.0。
（5）将上述的胶体金以1.66 μL/cm的喷涂量喷在玻璃纤维膜上，玻璃纤维膜的宽度为5mm，干燥3h后制得金标垫。
二、反应垫的制备
在硝酸纤维素膜的检测线（T线）和质控线（C线）上分别喷涂1mg/mL的基质金属蛋白酶-9抗体2和1.2mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白IgG，喷涂量均为0.1μL/mm，检测线与质控线相距5mm，干燥12h。
三、样品垫的制备
将玻璃纤维在室温、湿度＜20%的条件下干燥12h，将剥离纤维切割为19mm宽，密封于铝箔袋中干燥备用。
四、试剂盒的组装
在底板上按照样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫的顺序进行粘贴，将其裁剪成4mm宽的试纸条，将裁剪好的试纸条装进盒体内。
实施例2 基质金属蛋白酶-9检测试剂盒的制备
一、金标垫的制备
（1）胶体金的制备
向100mL的锥形瓶中加入1mL 2%沸腾的氯金酸溶液，再加入2mL 1.5%柠檬酸三钠溶液，当溶液的颜色由灰黑色变为酒红色时，继续反映10min，室温冷却，用超纯水定容至100mL。
（2）抗体标记
用硼酸溶液调节胶体金溶液的pH为8.5，将40μg基质金属蛋白酶-9抗体1加入至1mL胶体金溶液中进行反应60min，反应期间不断搅拌，得到胶体金标记的基质金属蛋白酶-9抗体1。
（3）封闭
向步骤（2）中制备的胶体金标记基质金属蛋白酶抗体的溶液中再加入200μL 封闭液，封闭液中包括0.2M PBS缓冲液、2%牛血清白蛋白、0.1%吐温-20和2%蔗糖，混匀30min。
（4）重悬
将封闭后的金标抗体在4℃，10000rpm条件下，离心30min，弃上清，沉淀用重悬液进行重悬。所述的重悬液包括0.05mol/L PBS缓冲液、2%牛血清白蛋白、0.2%皂苷、1%亚氨基二乙酸、0.2% Brij、1%蔗糖和0.1%对羟基苯甲酸，PBS缓冲液的pH为8.5。
（5）将上述的胶体金以1.66μL/mm的喷涂量喷在玻璃纤维膜上，玻璃纤维膜的宽度为5mm，干燥3h以上后制得金标垫。
二、反应垫的制备
在硝酸纤维素膜的检测线（T线）和质控线（C线）上分别喷涂1.5mg/mL的基质金属蛋白酶-9抗体2和1mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白IgG，喷涂量均为0.1μL/mm，检测线与质控线相距5mm，干燥12h。
三、样品垫的制备
将玻璃纤维在室温、湿度＜20%的条件下干燥12h，将剥离纤维切割为19mm宽，密封于铝箔袋中干燥备用。
四、试剂盒的组装
在底板上按照样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫的顺序进行粘贴，将其裁剪成4mm宽的试纸条，将裁剪好的试纸条装进盒体内。
实施例3 基质金属蛋白酶-9检测试剂盒的制备
一、金标垫的制备
（1）胶体金的制备
向100mL的锥形瓶中加入1mL 1%沸腾的氯金酸溶液，再加入3mL 2%柠檬酸三钠溶液，当溶液的颜色由灰黑色变为酒红色时，继续反映10min，室温冷却，用超纯水定容至100mL。
（2）抗体标记
用硼酸溶液调节胶体金溶液的pH为8.5，将50μg基质金属蛋白酶-9抗体1加入至1mL胶体金溶液中进行反应90min，反应期间不断搅拌，得到胶体金标记的基质金属蛋白酶-9抗体1。
（3）封闭
向步骤（2）中制备的胶体金标记基质金属蛋白酶抗体的溶液中再加入200μL 封闭液，封闭液中包括0.2M PBS缓冲液、3%牛血清白蛋白、0.5%吐温-20和3%蔗糖，混匀30min。
（4）重悬
将封闭后的金标抗体在4℃，10000rpm条件下，离心30min，弃上清，沉淀用重悬液进行重悬。所述的重悬液包括0.2mol/L PBS缓冲液、5%牛血清白蛋白、0.8%皂苷、3%亚氨基二乙酸、1% Brij、2%蔗糖和0.5%对羟基苯甲酸，PBS缓冲液的pH为8.0。
（5）将上述的胶体金以1.66μL/mm的喷涂量喷在玻璃纤维膜上，玻璃纤维膜的宽度为5mm，干燥15h后制得金标垫。
二、反应垫的制备
在硝酸纤维素膜的检测线（T线）和质控线（C线）上分别喷涂1.2mg/mL的基质金属蛋白酶-9抗体2和1.5mg/mL的羊抗鼠免疫球蛋白IgG，喷涂量均为0.1μL/mm，检测线与质控线相距5mm，干燥12h。
三、样品垫的制备
将玻璃纤维在室温、湿度＜20%的条件下干燥12h，将剥离纤维切割为19mm宽，密封于铝箔袋中干燥备用。
四、试剂盒的组装
在底板上按照样品垫、金标垫、反应垫和吸水垫的顺序进行粘贴，将其裁剪成4mm宽的试纸条，将裁剪好的试纸条装进盒体内。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于，金标垫的制备过程中重悬的步骤不同，其余皆相同。
对比例1的重悬：将封闭后的金标抗体在4℃，10000rpm条件下，离心30min，弃上清，沉淀用重悬液进行重悬。将实施例1重悬液中的皂苷替换为吐温，重悬液中其余组分皆与实施例1相同。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于，金标垫的制备过程中重悬的步骤不同，其余皆相同。
对比例2的重悬：将封闭后的金标抗体在4℃，10000rpm条件下，离心30min，弃上清，沉淀用重悬液进行重悬。将实施例1重悬液中的亚氨基二乙酸替换为聚乙二醇，重悬液中其余组分皆与实施例1相同。
对比例3
对比例3与实施例1的区别在于，金标垫的制备过程中重悬的步骤不同，其余皆相同。
对比例3的重悬：将封闭后的金标抗体在4℃，10000rpm条件下，离心30min，弃上清，沉淀用重悬液进行重悬。所述的重悬液包括0.1mol/L PBS缓冲液、3%牛血清白蛋白、0.5%皂苷和2%蔗糖，PBS缓冲液的pH为8.0。
对比例4
对比例4与实施例1的区别在于，金标垫的制备过程中重悬的步骤不同，其余皆相同。
对比例4的重悬：将封闭后的金标抗体在4℃，10000rpm条件下，离心30min，弃上清，沉淀用重悬液进行重悬。所述的重悬液包括0.1mol/L PBS缓冲液、2%亚氨基二乙酸、0.8% Brij和0.3%对羟基苯甲酸，PBS缓冲液的pH为8.0。
实施例4 基质金属蛋白酶-9检测试剂盒的灵敏度检测
取实施例1-3和对比例1-4制得的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒，分别检测浓度为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的基质金属蛋白酶-9标准溶液。将50μL不同溶度的标准溶液滴加到检测卡中，每个浓度重复5次，在滴加样品5-10分钟判读结果，并记录检测结果。
结果判断：
阴性：检测线T不显色，质控线C显色；
阳性：检测线T和质控线C均显色。
无效：质控线C位置没有出现红色条带。
检出阳性结果的最低标准液的浓度即为该试剂盒的灵敏度，结果如下表1-2所示。
表1 实施例1-3试剂盒的灵敏度
对比例1-4制得的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒的灵敏度结果如下表2所示。
表2 对比例1-4试剂盒的灵敏度
由上表1-2的结果可知，本发明试剂盒的灵敏度为0.1ng/mL，对比例1-4试剂盒的灵敏度均较差于本发明的试剂盒，本发明的试剂盒具有较高的灵敏度。
实施例5 试剂盒的重复性实验
试剂盒的批内和批间重复性
实验步骤：
将同批和不同批次的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒分别检测0.1mg/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL和10ng/mL的基质金属蛋白酶-9标准品，每个浓度重复检测5次，观察试剂盒的重复性。
实验结果：
本发明的基质金属蛋白酶-9试剂盒的批内和批间的重复性为100%。
实施例6 试剂盒的特异性实验
分别配制了基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-3、血红素加氧酶-1、碳酸酐酶的标准溶液，浓度分别为0ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL，用试纸条进行检测，每个浓度重复5次，试纸条的特异性结果如下表所示。
表3 试剂盒的特异性检测结果
注：“-”代表阴性，“+”代表阳性。
从上表中可以看出，采用试剂盒对基质金属蛋白酶-9、基质金属蛋白酶-3、血红素加氧酶-1、碳酸酐酶进行检测，本发明的试剂盒仅对基质金属蛋白酶-9样本有特异性反应，本发明的试剂盒具有较好的特异性。
实施例7 基质金属蛋白酶-9检测试剂盒的临床试验
实验人群：
本次检测共检测了30名干眼症患者和20名正常健康人。
收集被检者的眼表冲洗液：
（1）被检者保持脸部与房顶几近平行体位，用手指拉开下眼睑，暴露出下眼睑穹窿部，被检者眼球向上眼睑方向转动，将100μL生理盐水缓慢滴入下眼睑穹窿部。
（2）被检者转动眼球，使生理盐水充分混合眼表液，5秒后头部向颞侧倾斜，同时用EP管紧贴被检者外眦处收集自然流出的液体。
测试前应注意：
被检者的眼部切勿有外伤；
被检者采样前1小时不能使用滴眼液；
采集前被检者应保持舒适体位：坐位后仰头部或被检者处于仰卧位。
使用本发明制备的实施例1-3和对比例1-4试剂盒分别对上述采集的人眼表冲洗液样本进行检测，分别在试剂盒的加样孔加入50μL样品，滴加样品5-10分钟后判读结果。检测结果如下表所示。
表4 试剂盒的临床试验的检测结果
从上表4中可以看出，本发明实施例1-3制备的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒的总符合率较高于对比例1-4的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基质金属蛋白酶-9检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括金标垫，所述的金标垫使用金标液包被，将胶体金标记的基质金属蛋白酶-9抗体1使用重悬液复溶后得到金标液；
所述的重悬液包括牛血清白蛋白、皂苷、亚氨基乙二酸、Brij、蔗糖和对羟基苯甲酸。
2.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒，其特征在于，所述的重悬液包括以下浓度的组分：1-5%牛血清白蛋白、0.1-1%皂苷、0.5-3%亚氨基二乙酸、0.1-1%Brij、1-2%蔗糖和0.1-0.5%对羟基苯甲酸。
3.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒，其特征在于，所述的重悬液还包括缓冲液，所述的缓冲液选自Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液为PBS缓冲液，所述的PBS缓冲液的pH为7-9，所述的PBS缓冲液的浓度为0.01-0.5mol/L。
5.根据权利要求1所述的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括反应垫，所述的反应垫上包括包被有基质金属蛋白酶-9抗体2的检测线和包被有羊抗鼠免疫球蛋白IgG的质控线；
所述的检测线上包被的基质金属蛋白酶-9抗体2的浓度为0.8-1.5mg/mL；
所述的质控线上包被的羊抗鼠免疫球蛋白IgG的浓度为0.5-1.5mg/mL。
6.权利要求1-5任一项所述的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的检测样本选自眼分泌物、房水、泪液、玻璃体中的一种或多种。
7.权利要求1-6任一项所述的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括金标液的制备，金标液的制备包括以下步骤：
（1）胶体金的制备：在沸腾的氯金酸溶液中加入柠檬酸三钠溶液，当溶液的颜色由灰黑色变为酒红色时，继续反应，室温冷却，得胶体金溶液；
（2）抗体标记：将基质金属蛋白酶-9抗体1加入至胶体金溶液中进行反应，得到胶体金标记的基质金属蛋白酶-9抗体1；
（3）封闭：将胶体金标记基质金属蛋白酶-9抗体1溶液中加入封闭液；
（4）重悬：将封闭后的胶体金标记基质金属蛋白酶-9抗体1进行离心，弃上清，沉淀用重悬液进行重悬，得胶体金试剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中基质金属蛋白酶-9抗体1与胶体金溶液的质量体积比为10-50μg：1mL。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中基质金属蛋白酶-9抗体1与胶体金溶液的质量体积比为40μg:1mL。
10.权利要求1-6任一项所述的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒或权利要求7-9任一项所述的制备方法制得的基质金属蛋白酶-9检测试剂盒在制备检测干眼症产品中的应用。
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