KR20180030207A - 혈액 세포의 세포 표면 수용체 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 액체 전혈 샘플 또는 이로부터 유래된 샘플에서, 관심있는 혈액 세포(BCoI)(예를 들어, CD4+ 세포 및 CD8+ 세포)의 하나 이상의 서브클래스를 신속하게 평가하는 신규한 방법; 이러한 세포의 세포 수를 결정하는 방법; CD4/CD8 비율을 결정하는 방법; 샘플에서 이러한 수용체의 양을 결정하는 방법; 뿐만 아니라 이러한 분석을 수행하는 수직 유동 어세이 장치에 관한 것이다.

Description

혈액 세포의 세포 표면 수용체 분석 방법

본 발명은 액체 전혈 샘플 또는 이로부터 유래된 샘플에서, 관심있는 혈액 세포(BCoI)(예를 들어, CD4+ 세포 및 CD8+ 세포)의 하나 이상의 서브클래스를 신속하게 분석하는 신규한 방법; 이러한 세포의 세포 수를 결정하는 방법; CD4/CD8 비율을 결정하는 방법; 샘플에서 이러한 수용체의 양을 결정하는 방법; 뿐만 아니라 이러한 분석을 수행하는 수직 유동 어세이(assay) 장치에 관한 것이다.

전혈이란 표준 혈액 기증 또는 혈액 샘플링으로부터의 인간 혈액에 사용되는 용어이다. 상기 혈액은 일반적으로 수집 과정 동안 혈액응고 방지제와 섞고, 다른 방법으로는 처리되지 않는다. 전혈은 혈장, 적혈구 및 백혈구 및 혈소판을 포함한다. 헤파린, 시트르산 및 EDTA(Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid)는 실험실 분석 용도의 혈액 샘플에서 응고를 방지하기 위해 첨가되는 주로 사용되는 혈액응고 방지제이다.

CD4+ T 도움 세포는 인간 면역 체계의 필수적 부분인 백혈구이다. 그들은 종종 CD4 세포, T-도움 세포 또는 T4 세포로 지칭되며, 림프구의 부분 모집단이다. 이들의 주된 역할 중 하나는 CD8 살해 세포를 포함하는, 다른 타입의 면역세포에게 신호를 보내는 것이기 ‹š문에 도움 세포라고도 불린다. CD4 세포는 신호를 보내고 CD8 세포는 감염성 입자를 부순다. 만약 예를 들어, 치료되지 않은 HIV 감염 또는 이식 전 면역 억제 후와 같이 CD4 세포가 감소된 경우라면, 신체는 그렇지 않았다면 싸울 수 있었던 다양한 범위의 감염에 취약하게 된다.

상기 혈액 세포는 종종 세포 표면 수용체(막 수용체, 종종 막관통 수용체의 형태)를 포함한다. 이 분자들은 세포와 외부 환경 사이의 의사소통에 참여하는 내재막 단백질로 전문화된다. 세포외 신호전달 분자(보통 호르몬, 신경전달 물질, 사이토카인, 성장인자 또는 세포 인식 분자)는 수용체에 붙어서, 세포의 기능을 변화시키기 시작한다. 이 과정은 신호전달 과정이라고 불린다: 상기 결합은 막의 세포내 면에서 화학적 변화를 일으킨다. 이러한 방식으로 수용체는 세포 의사소통 및 신호전달에서 독특하고 중요한 역할을 한다. 많은 막관통 수용체는 집합적으로 작동하고 리간드 결합, 탈락, 또는 그들의 “활성” 사이클의 또 다른 단계에서 해리될 수 있는, 2개 또는 그 이상의 단백질 서브유닛으로 구성된다(Wikipedia citation July 24, 2014).

CD4(cluster of differentiation 4)로 불리는 수용체는 T 도움 세포, 단핵 세포, 대식세포, 및 수지상 세포와 같은 면역 세포의 표면 상에서 발견되는 당단백질이다. 이것은 1970년대 후반에 발견되었고, 1984년에 CD4로 명명되기 전까지는 원래 leu-3 및 T4로 알려졌었다(OKT4 단일 클론 항체가 그것에 반응한 후). 인간에서 상기 CD4 단백질은 CD4 유전자에 의해 암호화된다[Isobe M, Huebner K, Maddon PJ, Littman DR, Axel R, Croce CM (June 1986). "The gene encoding the T-cell surface protein T4 is located on human chromosome 12". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (12): 4399-4402, 및 Ansari-Lari MA, Muzny DM, Lu J, Lu F, Lilley CE, Spanos S, Malley T, Gibbs RA (April 1996). "A gene-rich cluster between the CD4 and triosephosphate isomerase genes at human chromosome 12p13". Genome Res. 6 (4): 314-26.]

HIV 감염은 CD4를 발현하는 T 세포의 수를 점진적으로 감소시킨다. 의료 전문가는 HIV 감염 도중 치료를 시작하는 경우 또는 질병 중에 약물을 어떻게 조절할 지 결정하기 위해 “CD4 수”를 참조한다. 정상적인 혈액 값은 보통 혈액의 마이크로리터(μL)(또는 세제곱 밀리리터, mm³) 당 세포의 수로서 표시되고, CD4 세포의 정상적인 값은 500-1200개 세포/mm³이다. CD4 수는 CD4를 발현하는 T 세포의 수로서 측정한다. CD4 수가 직접적인 HIV 테스트 아니지만(즉, 바이러스 DNA의 존재 또는 HIV에 대해 특이적인 항체를 확인하는 것은 아니다) 환자의 면역 시스템을 분석하는 데에 사용된다. 유럽에서는 350개 세포/μL 수준, 미국에서는 보통 약 500개 세포/μL 수준에 도달한 경우에 환자가 종종 치료를 받고; 200개 세포/μL보다 낮은 사람들은 에이즈(AIDS)로 정의된 질병에 걸릴 위험이 높다. 최근 국립보건원은 CD4 수와 관계없이, HIV-양성인 사람에게 치료를 권장한다. 의료 전문가는 또한 치료의 효능을 결정하기 위해 CD4 검사를 참조한다.

T 도움 세포만이 표면 및 세포질에 CD4 수용체를 지니고 있는 것은 아니다. J Immunol Methods. 1990 Dec 31;135(1-2):59-69, Filion et al.은 모든 단핵 세포가 CD4 양성이라고 한다. 전혈에서 단핵세포의 수는 일반적으로 많다. 따라서 T 도움 세포와 관련된 CD4 수용체의 수를 결정하기 위한 방법은 CD4 수용체를 지니는 단핵 세포를 분류하는 방법의 단계 또는 부분을 포함하는 것이 필요하다.

CD4를 지니는 다른 혈액 세포(대식세포 같은)는 낮게 포함되어 있으며, 이 문맥에서 혈액 내에서 무시할 수 있는 비율이다.

유세포 분석은 세포를 확인하고 세기 위한 강력한 도구이다. 상기 유세포 분석기는 레이저빔을 통과하는 줄기 내의 개별 세포를 검출하고 계수한다. 다수의 세포를 조사함으로써, 유세포 분석은 다른 분자(예를 들어, B 세포를 특징으로 하는 표면 면역 글로불린, CD3으로 알려진 T-세포 수용체-관련된 분자, 및 주요 T-세포 서브셋을 구별할 수 있는 CD4 및 CD8 공-수용체 단백질)를 함유한 세포의 백분율에 대한 정량적 데이터를 제공할 수 있다. 혼합된 집단 내의 개별세포에는 형광 염료로 표지된 특이적 항체, 또는 예를 들어 항-면역 글로불린 항체가 표지된 특이적 항체가 부착된다. 표지된 세포의 현탁된 혼합물은 개구부를 통해 강제로 밀려나, 간격을 두고있는 세포를 함유하는 미세한 액체의 줄기를 만든다. 각 세포가 레이저 빔을 통과할 때 레이저 광을 산란시키고 세포에 결합된 임의의 염료 분자는 여기되어 형광을 낸다. 민감한 광전자 배증관 튜브는 세포의 크기 및 입상에 대한 정보를 제공하는, 산란광 및 표지된 항체의 결합 및 각 세포에 의한 세포-표면 단백질의 발현에 대한 정보를 제공하는, 형광 방출 둘 다를 감지한다. 만약 각각 다른 염료가 연결된, 2개 이상의 항체를 사용하는 경우, 하나의 염료가 표지된 항체의 형광은 두번째 염료가 표지된 항체의 형광에 대해 플롯되어, 상기 데이터는 2차원 산포도 또는 등고도의 형태로 표시될 수 있고, 하나의 항체가 표지된 세포의 집단은 두번째 항체에 반응성을 기초로하여 더 세분화할 수 있다.

일반적으로, CD4 수는 상기 유세포 분석법을 사용하여 실험실에서 측정할 수 있다. 비싸고 정교한 장비가 필요하고 고도로 숙련된 인력이 필요하며 깨끗한 물 공급과 시약을 위한 저온 유통 보관이 일반적으로 필요하므로, 중앙 위치에서 테스트를 수행해야 한다. 테스트와 결과 획득 사이의 지연은 또한 환자의 상당한 '후속 조치 상실'을 초래할 수 있으며 종종 인명-구조 치료를 받는 기회가 돌아가지 않을 수 있다.

또한, HIV에 가장 큰 영향을 받는 국가의 비-표준 실험실 및 진료소의 대부분은 정기적으로 CD4 수를 모니터링 할 수 없기 때문에 농촌 지역에서는 테스트에 대한 접근이 어렵거나 불가능할 수 있다.

인근 환자의 테스트를 용이하게 하고 매우 진보되고 복잡한 유세포 분석 기기를 갖는 중앙 실험실의 필요를 줄이기 위해, Alere Inc, US는 이른바 PIMA 시스템을 개발했다(Sekesai Mtapuri-Zinyowera et al.,J Acquir Immune Defic Syndr 2010;55:1-7, “Evaluation of the PIMA Point-of-Care CD4 Analyzer in VCT Clinics in Zimbabwe”). 상기 문헌에는 다음과 같이 기재하고 있다: 각 참가자는 손끝으로부터 PIMA CD4 카트리지로 직접 수집되는 란셋(lanset) 손가락 스틱으로 혈액 1-2 방울을 제공했다. 충분한 모세 혈관 혈류를 얻기 위해 블레이드-타입의 란셋(Sarstedt)을 사용하여 1.8mm의 천자 깊이를 사용했다. PIMA 카트리지는 25 μL 용기로 혈액을 수집했다. 이 초기 부피 중, 5 μL의 혈액을 PIMA 카트리지로 가져와서 유세포 분석에 추가로 사용했다. 상기 카트리지를 덮고 즉시 PIMA 분석기에 삽입하여 테스트를 실행했다. 분석 과정 동안, 혈액은 자동적으로 카트리지에 함유된 동결-건조된 형광 표지된 항체(항-CD3 및 항-CD4)와 섞이고 혈액의 ML 당 CD4 세포의 수를 계산하기 위해 표지가 부착된 세포의 이미지를 얻는 검출 챔버로 옮겼다.

상기 PIMA 시스템은 인근-환자 테스트에서 좋은 진보였지만, 여전히 PIMA 시스템은 생산 비용이 많이 드는 복잡한 카세트를 포함하는 정교한 장비를 기반으로 한다.

면역어세이법은 또다른 항체-항원 반응의 특이성, 강도 및 다양성을 이용하여 시료를 분석하고 시료 내 특이적 성분을 검출하는 또 다른 유용한 형태의 분석법이다. "The Immunoassay Handbook" Nature Publishing Group, 2001에 기술된 바와 같이, 넓은 범위의 면역어세이 기술이 이용가능하고, 특이적 항원에 대한 항체의 넓은 범위의 검출 방법 또한 알려져 있다. 예를 들어, 효소결합면역흡착측정법(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay) 또는 방사성-면역어세이법(RIA: radio-immunoassay)는 실험실에서 주로 사용한다. 어레이 및 고속 대량 스크리닝 방법 또한 이용된다. 이 방법들을 일반적으로 실험실 기술에서 높은 수준의 기술이 필요하다. 기술이 거의 필요 없고 수행이 신속하며, 따라서 치료 시점에서의 특이적 항원에 대한 항체 검출 및/또는 특정 항원 검출에 적합한 다양한 방법이 개발되어 왔다. 특히, 바이러스 감염을 포함하는 다수의 감염에 대한 분석을 위해 측면-유동, 계량봉 및 모세관 키트가 개발되어 왔다.

CD4 세포를 검출하기 위한 하나의 방법에서 항-CD4 항체로 코팅된 다이나비드(dynabeads)는 CD4 + T-림프구를 결합하는데 유용하다. CD14 및 CD4를 발현하는, 단핵세포는 비드가 코팅된 항-CD14 항체를 사용하여 신선한 혈액 샘플로부터 제외시킨다. 이는 문헌을 참조하였다(“T regulatory-1 cells induce IgG4 production by B cells: role of IL-10”, Satoguina JS, Weyand E, Larbi J, Hoerauf A, J Immunol (2005) 174:4718-4726.). 그 후 분리된 CD4 T-림프구를 용해하고, 아크리딘 오렌지로 염색하고 염색된 핵을 형광 현미경으로 계수하였다.

Paxton et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2(1):104-114, 1995에서 "TRAx CD4" 테스트 키트를 기술한다. 이 키트는 전혈 샘플에서 전체 CD4를 측정하기 위한 ELISA에 기반한 방법이다. 상기 사용된 항체는 세포-결합 및 가용성 CD4를 구별할 수 없었다(Lyamuya et al., J. Imm Methods, 195:103-112, 1996).

WO 2006/115866는 CD4 항원을 측정하기 위한 면역크로마토그래피 장치를 기술한다. 그러나, 이 문헌에는 피험자로부터의 샘플에서 세포질 도메인이 결여된 세포-결합된 CD4 및 가용성 CD4를 구별할 수 있는 포획 시약이 다시는 개시되어 있지 않다. 또한, WO 2006/115866에 기술된 장치는 테스트 스트립상의 연속적인 포획 영역을 포화시킴으로써 CD4를 포획하여 일련의 번호가 매겨진 포획 영역에 걸친 샘플의 흐름에 의존하여 샘플에서 CD4 세포의 농도를 시각적으로 표시한다.

예시적인 구현예에서, 상기 방법은 세포질(cytosolic) 및 세포외(ecto) 도메인을 포함하는 T-세포 관련 CD4의 수준 또는 CD4 T-세포의 수준을 피험자로부터의 혈액 샘플에서 평가하는데 사용되며, 상기 방법은

(i) 선택적으로 샘플을 CD4 T-세포를 용해시키거나 투과성있게 할 수 있는 제제와 접촉시키는 단계;

(ii) 샘플을 CD4의 세포질 도메인에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 및

(iii) 샘플에서 결합된 CD4의 수준 또는 존재를 직접적 또는 간접적으로 평가하는 단계

를 포함한다.

Anderson et al, US 8,409,818은 세포질(cytosolic) 및 세포외(ecto) 도메인 을 포함하는 T-세포 관련 CD4의 수준 또는 CD4 T-세포의 수준을 피험자로부터 평가하는 측면 유동 방법을 기술한다. 상기 방법은

a) 면역크로마토그래피 장치의 샘플 부분에 테스트 샘플을 적용하는 단계로서, 상기 샘플 부분은 장치의 포획 부분과 작동 가능하게 연결되고 상기 테스트 샘플의 성분은 샘플 부분으로부터 세포질 도메인을 포함하지 않는 가용성 CD4가 아닌 세포질 도메인을 포함하고 CD4 만이 항체 또는 이의 단편에 결합하여 포획된 CD4 형태를 형성하도록 CD4의 세포질 도메인에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 포획 부분까지 흐르는 단계;

b) 세포질 또는 세포외 도메인을 포함하는 CD4에 결합하고 검출 마커를 포함하거나 또는 검출 마커를 포함하는 제3 또는 이후의 결합 파트너에 결합 할 수 있는 제2 결합제와 포획 부분을 접촉시키는 단계; 및

c) 선택적으로 상기 제2 결합제를 검출 마커를 포함하는 제3 또는 이후의 결합제와 접촉하고; 검출 마커의 존재를 평가하는 단계

를 포함한다.

상기 기술은 Omega Diagnostics, UK에서 제조한 상업용 제품 "VISITECT® CD4"로 개발되었다. 상기 장치는 일회용이고, 세포 표면에 노출된 CD4 수용체 부분 및 세포의 CD4 수용체의 세포내 부분을 둘 다 포함하는, CD4의 결정을 위한 인근-환자 테스트 장치이다. 이러한 방식으로, 혈장에 존재하고 백혈구에 결합되지 않은 CD4 수용체의 가용성 부분의 공동 측정을 피할 수 있다. 또한, 단핵구의 자성 분리는 테스트 장치의 필수적인 부분이다. 상기 테스트는 사용이 간편하며 테스트를 수행하기 위해 손가락으로 뽑은 혈액 샘플만 있으면 된다. 이 장비는 정교한 실험 장비를 이용할 수 없는 곳에서의 테스트에 적합하다. 그러나, 그것은 40분의 시간이 걸리는 테스트이며, 17분 후에 별도의 액체 시약을 수동으로 추가해야 해서, 작업자에 의한 열림은 테스트 처리에 있어서 오류를 유도한다. 또한, 자성 분리 장치가 내장된 복잡한 제조 및 분리 단계를 처리하기 위한 자성 입자가 필요하다.

측면 유동 기술에서, 시약 및 샘플의 흐름은 일반적으로 여과 장치인, 장치의 표면과 평행하고, 주로 건조된 상태인 시약은 필터 안에 연결되거나 배치되거나 고정된다. 많은 수의 피분석물의 정성, 반-정량 및 정량 측정을 위한 수많은 테스트 장치가 만들어졌다. In Anal Bioanal Chem (2009) 393:569-582, Geertruida A. Posthuma-Trumpie & Jakob Korf & Aart van Amerongen은 “Lateral flow immunoassay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats.”이라는 제목의 리뷰를 제공한다.

일반적으로, 측면 유동 기술의 대안적 기술은 수직 유동 기술일 수 있다. 샘플 및 시약은 여과 장치를 수직으로 통과하고, 선택적으로 필터에 고정된 특이적 결합제가 있는 상응하는 제품이 만들어졌다. “Alternative Algorithms for Human Immunodeficiency Virus Infection Diagnosis Using Tests That Are Licensed in the United States”의 제목을 갖는 Owen et al in Journal of Clinical Microbiology, May 2008, p. 1588-1595 Vol. 46, No. 5, 문헌에 기재된 바와 같이, 필터 장치 내 고정된 항원 또는 항원 단편을 사용하여 HIV 바이러스에 대한 항체 테스트가 이루어졌다.

상기 NycoCard CRP 테스트는 박테리아 또는 바이러스 원인의 감염을 나타내는 2분 - 현장 테스트이다. NycoCard CRP는 감염이 시작된 후 급속히 증가하는 급성기 단백질인, C-반응성 단백질(CRP: C-reactive protein)를 측정한다(“Evaluation of a near-patient test for C-reactive protein used in daily routine in primary healthcare by use of difference plots” by Dahler-Eriksen et al, Clinical Chemistry November 1997 vol. 43 no. 11 2064-2075).

상기 수직 유동 어세이는 5μL의 샘플 부피, 2분의 어세이 시간, 전혈, 혈청 또는 혈장의 샘플 재료, 측정 범위: 전혈 샘플의 경우 8 - 200 mg/L 및 혈청 및 혈장 샘플의 경우 5 - 120 mg/L을 특징으로 한다. 샘플 크로스 오버가 없으며, 니트로셀룰로오스 막에서 CRP에 대한 고정화된 항체가있는 일회용 테스트 장치를 사용하고, 항-CRP 항체에 접합된 금 콜로이드 입자를 사용한다. 샘플 접촉의 위험성은 낮으며, 막 상의 색상에 대한 간단한 반사광 측정 판독은 테스트되는 샘플 내의 CRP 농도와 상관관계가 있다.

전혈 샘플에서 예를 들어 T-세포 관련 CD4 수용체와 같은 진단적 또는 치료적 관심의 혈액 세포의 서브클래스에 대한 특이적 세포 표면 수용체의 분석을 위한 간단하고 빠르며, 낮은 비용의 방법 및 장치가 필요하다.

상기 문제는 청구항에서 정의되고 본원의 하기에 보다 상세히 설명된 방법 및 장치에 의해 놀랍게도 해결되었다.

발명의 요약

본 발명은 매우 놀랍게도 특정 혈액 세포의 분석에 특히, 필터에 임의의 고정된 특이적 결합제를 사용하지 않고 신속한 수직 유동 원리를 적용하는 것이 가능하게 만들었다. 본 발명은 수직 유동 면역어세이에서 잘 알려진 필터 표면의 발색된 비색 측정을 이용하지만, 필터에서의 항체 고정은 필요치 않다.

하나의 구현예에서 본 발명은 전혈 샘플 또는 전혈로부터 유래된 샘플에서 세포의 '특이적 클래스' 또는 '특이적 군'(관심있는 혈액 세포(Bcol)로도 지칭함)에 결합된 수용체의 특이적인 클래스의 수용체 분자의 양을 분석하는 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 상기 수용체 분자의 클래스는 CD4 수용체 클래스이고, 일반적으로 상기 수용체 분자를 지니는 상기 세포의 클래스(서브클래스, 서브셋 또는 부분모집단이라고 지칭함)는 T-림프구이다.

본 발명의 상기 어세이 방법은 “제1 단계”에서 상기 샘플 또는 상기 샘플의 분액을 상기에서 언급한 세포의 특이적 군(또는 클래스)과는 다르지만 상기 수용체를 지닌 “다른 세포”(상기 “다른 세포”는 방해 혈액 세포(DBC)로 지칭함)의 표면 상에 다른 구조에 결합하는 항체를 포함하는 “제1 액체”와 혼합하여, 상기 세포의 특이적 군에서 상기 세포의 크기보다 유의하게 큰 입자, 입자 또는 세포의 응집체 또는 클러스터를 형성하는 단계를 특징으로 한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 “제1 액체”의 상기 항체는 단핵 세포(단핵세포 또한 CD4 수용체를 지니고, 따라서 마찬가지로 상기 어세이를 방해한다)에 매우 풍부한, CD14에 대한 특이적 친화성을 갖는다.

일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 추가로 상기 "다른 세포"의 클러스터를 형성하는 상기 "다른 세포"에 대한 항체를 지니는 상기 "제1 액체" 또는 항체를 세포의 “상기 특이적 군”에서 상기 세포의 크기보다 유의하게 큰 입자, 입자 또는 세포의 응집체 또는 클러스터의 형성을 용이하게 하는 입자 또는 중합체 또는 다른 큰 분자 상에 중합시키거나 또는 고정화시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 “제1 액체”의 항체는 수용체 CD14에 대한 특이적 친화성을 갖고, 따라서, 상기 세포의 “특이적 군”에서 상기 세포의 크기보다 유의하게 큰 상기 샘플의 단핵세포를 포함하는 입자, 입자 또는 세포의 응집체 또는 클러스터 형성을 가능하게 한다.

우선적으로, 상기 “제1액체”는 샘플의 적혈구를 신속하게 용해시키기 위해, 낮은 이온 강도 및 분석되는 샘플을 혼합한 후에도 상기 낮은 이온 강도를 유지하기 위한 충분히 높은 부피를 갖는다.

백혈구의 용해 없는 적혈구의 저삼투성 용해는 공지된 문헌에서 설명된다(Cunha et al in Anal. Methods, 2014,6, 1377-1383, “Kinetics of hypotonic lysis of human erythrocytes”). 적혈구의 용해는 전혈 샘플의 수직 유동 면역어세이가 매우 일반적이다.

상기 본 발명의 방법의 “제2 단계”는 분석되는 세포의 “특이적 군”보다 유의하게 크기가 큰 상기 입자, 클러스터 또는 응집체를 필터를 통해 분석되는 세포의 "특이적 군"을 허용하는 제1필터를 통해 여과시키는 여과 단계이다.

상기 발명의 하나의 구현예에서, 샘플의 단핵 세포와 같이 CD14 수용체를 포함하고, CD14 수용체에 대한 특이적 반응성을 갖는 항체 - 선택적으로 중합체에 접합되거나 입자에 고정된 항체 - 와의 반응에 의해 클러스터를 형성하는 세포를 필터를 통해 T 세포(및 CD4 수용체를 지니는 T 세포)를 보내는 필터를 이용하여 여과한다. 상기 “제1필터”는 분석되는 세포의 “특이적 군”의 통과를 가능하게 하는 기공 크기를 가져야 한다. 본 발명의 임의의 구현예에서, 상기 “특이적 군”의 세포는 T-림프구로 구성되므로, - 상기 구현예에서 - 상기 “제1필터”는 필터를 통해 T-림프구가 지나가는 것을 가능하게 하는 기공-크기를 가져야 한다.

세포에 대한 낮은 비특이적 결합성을 갖으며 오히려 좁은 기공 크기의 분포를 갖는 필터 재료가 바람직하다. 나일론 웹 필터의 기공-크기는 잘 정의되고, 다소 낮은 비특이적 결합성을 갖기 때문에 나일론 웹 필터는 매우 좋은 선택이다. T-림프구는 30μM 필터를 쉽게 통과할 수 있으나, 특히 항-CD14 수용체 항체를 지니는 다소 큰 입자(예를 들어, 직경 1.0μm 내지 50μm)에 응집된 경우, 단핵세포의 응집체는 그러한 필터에 의해 보류된다.

비제한적인 의미에서, 상기 “제1 필터”는 유리, 유리섬유, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 플루오르중합체, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 폴리아마이드 및 이들의 혼합물로 구성될 수 있다. 일반적으로, 단백질 및 세포의 비특이적 결합에 대한 블락킹 처리가 바람직하다. 전혈 샘플 또는 혈액으로부터 유래된 샘플에서 상기 특이적 군의 세포가 T-림프구인 경우, 18 내지 50 μm 기공 크기의 필터가 적절하지만, 바람직한 기공 크기는 22 내지 40 μm이고, 더 바람직하게는 25 내지 33nm의 기공 크기이다.

다음 단계(“제3 단계”)에서, 본 발명의 방법은 남아있는 혼합물을 상기 샘플에서 상기 세포의 “특이적 군”을 유지하게 하는 “제2 필터”에 통과시키지만, 용액의 수용체 분자는 상기 필터를 통해 통과하게 하는 단계를 포함한다. 따라서, 상기 “제2 필터”의 기공 크기는 제1필터의 기공 크기보다 작다.

비-제한적의 의미에서, 상기 “제2 필터”는 유리, 유리섬유, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 플루오르중합체, 셀룰로오스, 나일론, 니트로셀룰로오스, 폴리아마이드 및 이들의 혼합물로 구성될 수 있다. 일반적으로, 단백질 및 세포의 비특이적 결합에 대한 블락킹 처리가 바람직하다. 만약 상기 세포의 “특이적 군”이 T-림프구라면, T-세포를 포획하기 위한 상기 막의 적합한 기공 크기는 평균 1-10 μM의 기공 크기를 갖는 막이고, 바람직하게는 3-9μm, 보다 바람직하게는 5-8μm이며, 저삼투성 용액 후에 샘플 물질로부터 더 작은 미립자 물질이 막을 통과하게 허용한다. 만약 상기 세포의 “특이적 군”이 다른 세포로 구성되는 경우, 다른 기공 크기가 바람직하다.

상기 “제2 필터”는 선택적으로 세척 완충액 또는 세척 용액에 의해 세척될 수 있다.

상기 발명의 하나의 구현예에서, 상기 세포의 “특이적 군"은 CD4+ T-세포라고 불리는 T-림프구를 포함하는 림프구로 구성된다.

본 발명의 방법의 다음 단계(“제4 단계)에서, 상기 “제2 필터”를 상기 수용체에 특이적으로 반응하는, 효소 또는 발색 또는 형광 입자로 구성된 표지로 표지된 항체가 포함된 액체에 노출시키는 단계로서, 선택적으로 뒤이어 세척하는 단계를 포함한다.

도 1은 적어도 하나의 원형 액체 샘플 공급 개구(102) 및 상부 커버 시트(101)에 고정된 하부 흡수층(105)이 제공된 상부 커버 시트(101); 적어도 하나의 원형 개구(102) 안으로 제거 가능하게 삽입된 제1원형 필터(106); 상기 상부 커버 시트(101) 및 상기 하부 흡수층(105) 사이에 고정되고, 상기 적어도 하나의 공급 개구(102)와 그 내부에 삽입된 상기 원형 필터(106)를 상기 흡수층(105)으로부터 분리시킨 제2필터(104)를 포함하는 수직 유동 어세이 장치를 나타낸다.
도 2는 상부 회전가능한 케이싱(casing) 요소(1) 및 하부 케이싱 요소 (2) 및 샘플 공급 개구(3) 및 판독 개구(4)를 포함하는 상기 발명의 수직 유동 어세이 장치 구현예의 또 다른 시점에서의 투시도를 나타낸다.
도 3은 카드(10)에 제공된 상응하는 개구(10a)로 삽입 가능한 도 2의 장치를 나타낸다.
도 4는 도 2에 따른 어세이 장치의 단면도를 나타낸다.
도 5는 2쌍의 공급 개구 및 판독 개구(3, 4 및 3', 4')이 제공된 샘플을 상기 발명의 어세이 장치의 또 다른 구현예의 상면도를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
A. 일반적 정의
상기 발명에 따른 어세이 방법에서 사용되는 “전혈” 샘플은 포유동물, 특히 인간으로부터 유래된 샘플이다. 임의의 “전혈 샘플”이 사용될 수 있다. 상기 샘플은 “그대로”, 즉 헌혈자로부터 얻어 전처리 없이 곧바로 사용되거나, 또는 어세이 전에 전처리될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 이 문맥에서 전혈은 전혈의 비-변형 샘플 또는 혈액응고방지제가 첨가된 샘플 또는 전혈로부터 유래된 샘플, 즉 완충액 또는 또 다른 액체가 첨가된 샘플을 의미한다. 적절한 샘플의 예는 천연의, 처리되지 않은 전혈 및 EDTA 혈액, 시트르산 혈액, 헤파린 혈액과 같은 전처리된 전혈 혈액이다. 원래 획득한 샘플은 추가적인 희석에 의해 변형될 수 있다. 어세이를 방해할 수 있는 구성 성분을 제거하기 위한 전혈의 분획이 일반적으로 요구되지 않는다. 희석은 성분의 농도, 예를 들어 피분석물의 농도를 조절하기 위해, 적절한 완충액과 같은 적절한 샘플 액체와 원래의 샘플을 혼합함으로써 수행될 수 있다. 상기 샘플은 또한, 예를 들어 적혈구의 선택적 용혈과 같은 용혈에 의해 전처리 될 수 있다. 그러한 변형된 샘플은 포유동물의 신체에서 수집되거나 또는 분리된 원래 전혈 샘플 "로부터 유래된" 샘플의 전형적인 예가 된다.
상기 발명에 따라 분석된 “피분석물”은 세포 마커, 특히 세포 표면 마커, 보다 특히 CD4 또는 CD8이다.
“CD4(cluster of differentiation 4)”는 T 도움 세포, 단핵 세포, 대식세포, 및 수지상 세포와 같은 면역 세포의 표면 상에서 발견되는 당단백질이다. 이것은 1970년대 후반에 발견되었고, 1984년에 CD4로 명명되기 전까지는 원래 leu-3 및 T4로 알려졌었다.
“CD4+ T 도움 세포”는 인간 면역 체계의 필수적인 부분인 백혈구이다. 이들은 종종 CD4 세포, T-도움 세포 또는 T4 세포로 불린다. 이들의 주된 역할 중 하나는 감염성 입자를 부수는 CD8 살해 세포를 포함하는, 다른 타입의 면역세포에게 신호를 보내는 것이기 ‹š문에 도움 세포라고도 불린다. 만약 예를 들어, 치료되지 않은 HIV 감염 또는 이식 전 면역 억제 후와 같이 CD4 세포가 감소된 경우라면, 신체는 그렇지 않았다면 싸울 수 있었던 다양한 범위의 감염에 취약하게 된다.
“CD8(cluster of differentiation 8)”은 T 세포 수용체(TCR: T cell receptor)에 대한 공-수용체의 역할을 하는 막관통 당단백질이다. TCR과 같이, CD8은 주요 조직 적합 유전자 복합체(MHC: histocompatibility complex) 분자에 결합하고, 특이적으로 class I MHC 단백질에 특이적이다. 상기 단백질은 각각 다른 유전자에 의해 암호화되는, 알파 및 베타의 2종류의 동형 단백질이 있다. CD8 공-수용체는 대게 세포독성 T 세포의 표면 상에 발현되지만, 자연 살해 세포, 피질 흉선 세포, 및 수지상 세포에서도 또한 발견될 수 있다.
CD14로도 알려져 있는 “CD14(cluster of differentiation 14)”는 인간 유전자이다. 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 선천적 면역 체계의 구성 요소이다. CD14는 2가지 형태로 존재하는데, 하나(mCD14)는 글리코실 포스파티딜 이노시톨 꼬리에 의해 막에 고정되고, 다른 하나(sCD14)는 가용성 형태이다. 가용성 CD14는 mCD14(48 kDa)의 발산 후 나타나거나 또는 세포내 소포로부터 직접 분비된다(56kDa). CD14는 주로 대식세포(10배 정도 적게) 및 호중구에 의해 발현된다. 이것은 또한 수지상 세포 및 단핵 세포에 의해 발현된다.
본원에서 언급된 “관심있는 혈액 세포(BCoI: Blood cell of interest)”는 클래스 또는 모집단에 속하며 또는 보다 특히 본 발명에 따라 분석되는 전혈 샘플에 일반적으로 존재하는 세포의 서브-클래스 또는 서브-모집단에 속한다. 이러한 (서브)-클래스 또는 (서브)-모집단은 특정한 세포 표면 마커 또는 이러한 마커의 패턴에 기초하여 테스트 환경(전혈 샘플)에서 각각 구별할 수 있고, 이는 상기 마커 또는 마커의 패턴에 특이적인 상응하는 항체 분자에 의해 분석될 수 있다.
세포의 “서브-클래스”, “서브-셋” 또는 “서브-모집단”은 기능적으로 및 항원성으로 관련된 혈액 세포의 군을 의미한다. 그 예로서, (CD4+) T-도움 세포 또는 (CD8+) 세포독성 T 세포가 있다.
혈액 세포의 “클래스” 또는 “모집단”의 예는 T-림프구 및 B-림프구이다.
본 발명의 문맥에서, “구별할 수 있는”는 상기 특정 BCoI에 대해 "특이적", 즉 임의의 다른 신체 세포를 검출할 수 없거나; 또는 “서브클래스-특이적”이어서, 분석되는 혈액 샘플의 또 다른 세포 모집단을 검출할 수 없거나; 또는 “비-특이적”이어서 전혈 샘플에 존재하는 다른 혈액 세포를 검출할 수 있지만, 매우 낮은 비율로 존재하여, 어세이 결과에 부정적인 영향을 미치지 않거나 또는 조작되지 않고, 또는 BCoI의 분석을 수행하기 전에 샘플로부터 제거되는 특정 마커를 의미한다.
따라서, 본 발명의 문맥에서 세포의 클래스, 모집단, 서브-클래스 또는 서브-모집단에 "특이적인"은 다른 언급이 없다면 폭넓게 이해되어야 한다.
“분석하는” 또는 “분석”은 샘플에 존재하는 피분석물의 양 또는 농도의 절대값을 얻는 의미에서 양적 및 질적 결정 둘 다를 포함하며, 샘플에서 피분석물의 지표, 비율, 백분율, 시각적 또는 기타 값을 나타내는 수준을 얻는 것을 포함한다. 분석은 직접적 또는 간접적일 수 있으며 실제로 검출된 화학종은 물론 피분석물 자체일 필요는 없지만 예를 들어 이의 유도체일 수 있다.
본 발명의 분석 방법의 “정확도”는 더욱 신뢰성있는 기준 방법에 의해 결정된 농도와 비교하여, 샘플 내의 피분석물의 농도를 정확하게 결정하는 능력이다.
본 발명의 분석 방법의 "정밀도"는 샘플 내의 파분석물의 농도가 반복적으로 결정될 때의 결과의 차이이다.
본 발명에 따르는 어세이의 “견고성(robustness)”은 피분석물 농도 결정의 결과값에 영향을 미치지 않고 어세이 조건에서 간섭 물질 및 어세이 조건의 변화를 허용하는 능력이다.
상기 발명의 문맥에서 사용된 “불활성 단백질”은 상기 발명의 어세이 방법을 방해하지 않는 임의의 기원(예, 인간 또는 비-인간 포유동물, 미생물)의 단백질이다; 특히, 이것은 상기 발명의 어세이 방법에서 사용되는 항체 및/또는 분석되는 피분석물에 대한 검출가능한 친화성을 실질적으로 갖지 않거나 또는 갖지 않아야 한다.
"입자 크기"라는 용어는 본원에 달리 언급되지 않으면 "평균 입자 크기"로 정의된다. 바람직하게는 본 발명의 입자, 특히 나노입자 및 그에 대한 항체의 연결에 의해 유래된 면역입자는 좁게는, 특히 “필수적으로 단일모드” 또는 “단일모드” 입자 크기 분포를 특징으로 한다. 입자 크기 결정은 예를 들어 Malvern Mastersizer기기에서 입자 크기 분포 측정을 이용하는 것과 같이 그 자체로 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 일반적으로, 측정은 0.1M NaOH에서 수행될 수 있다. 본원에서 언급된 평균 입자 크기 값은 약간 상이할 수 있는 D(0.5) 또는 D(4.3) 값일 수 있지만, 그럼에도 불구하고 표시된 파라미터 범위 내에 있고, D (0.5)는 분포의 50 %가 더 작고 크기 분포의 50%가 더 큰 평균 입자 크기 (μm)를 나타낸다. D(4.3)은 부피 평균 직경을 나타낸다. 평균 입자 크기는 또한, 예를 들어 투과 전자 현미경에 의해, 현미경으로 결정될 수 있다.
“항체”는 “면역글로불린 분자”의 임의의 클래스(IgA, D, E, G, M, W, Y와 같은) 및 제한 없이 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 동종형을 의미한다. 특히, 상기 용어는 특정한 항원에 결합할 수 있는 기능성(즉, 항원에 결합하는 능력을 가진) 단일클론 또는 다증클론 항체(Ab) 또는 항체 단편(fAb)을 의미한다. 상기 Ab 및 fAb는 화학적으로 또는 효소적으로 제조된 분자로부터 선택되거나 또는 원핵 또는 진핵 미생물 또는 세포주에 의해 비-재조합 적으로 또는 재조합적으로 제조될 수 있거나 또는 포유 동물, 바람직하게는 비-인간 포유동물 또는 비-포유동물 종, 바람직하게는 조류 종 또는 식물과 같은 고등 생물에서 제조될 수 있다. 상기 fAb는 1가 항체(1개의 중쇄 및 1개의 경쇄로 구성됨), Fab, F(ab')₂ (or Fab₂), Fab₃, scFv, bis-scFv, minibody, diabody, triabody, tetrabody, tandab; 및 V_H 및 V_L 도메인과 같은 단일 항체 도메인, 및 그의 단편으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고; 이의 다가 단편은 다른 또는, 바람직하게는, 특히 CD4 또는 CD8과 같은, 동일한 항원의 동일한 항원 결정기에 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 “표지된 항체”는 항체의 확인을 위해 제공하는(바람직하게는 각각의 항원에 결합한 후) 표지가 결합된 상기 정의된 항체 분자를 의미한다. 특히, 즉, 방사성-표지된 아미노산의 결합 또는 표지된 아비딘(예를 들어, 광학적 방법 또는 비색법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 바이오틴 잔기의 폴리펩티드에 대한 부착과 같은 표지는 “검출가능한 마커” 이다. 항체에 대한 표지의 예는 이제 제한되는 것은 아니지만 하기를 포함한다:
- 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예, ³H_, ¹⁴C_, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho, 또는 ¹⁵³Sm)
- 형광 표지(예, FITC, 로다민, 란탄계 형광체)
- 효소적 표지(예, 홀스래디쉬 페록시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제);
- 화학 발광의 마커
- 바이오틴 군;
- 2차 리포터에 의해 인식되는 미리결정된 폴리펩티드 에피토프(예, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 택(tag)); 및
- 중합체 입자(예, 발색된 나노입자)
- 금속 입자(금 나노입자와 같은)
- 가돌리늄 킬레이트와 같은 자성 제제 및
- 올리고뉴클레오티드
“에피토프” 또는 “항원 결정기”는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드 결정기를 포함한다. 특정 구현예에서, 에피토프 결정기는 아미노산, 당측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적으로 활성 표면군을 포함하고, 특정 구현예에서, 특이적 3차원 구조 특성 및/또는 특이적 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 특정 구현예에서, 항체는 단백질 및/또는 거대 분자의 복합 혼합물에서 그의 표적 항원을 적어도 우선적으로 또는 배타적으로 인식할 때 항원에 "특이적으로" 결합한다고 한다.
세포의 “표면 상에 존재”는 상기 분자(세포 표면 마커와 같은)가 세포 표면 또는 세포막의 필수적인 부분에 결합되고 또한 세포막을 넘어선 세포외 공간 및 선택적으로 세포내 공간(예, 세포질)까지 연장된 것을 의미한다.
표적(특히 CD4 또는 CD8과 같은 항원과 같은)에 대한 결합제(항체와 같은)의 결합을 포함하는 반응의 문맥에서 “특이적”은 분석되는 샘플에 또한 존재할 수 있는 다른 표적(특히, 항원)과 교차-반응성을 보여주지 않으면서, 결합제가 상기 특정 의도된 표적에 특이적으로 인식하고 결합하는 능력을 정의한다.
"용해된(Haemolysed)" 또는“용혈(Haemolysis)”은 전혈 샘플에 포함된 적혈구(RBC)가 본 발명에 따른 분석적 평가 동안, 바람직하게는 본 분석적 평가 전에 용혈성 세포 파괴를 겪는 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 이는 특히 백혈구의 용해 없는 적혈구의 저삼투성 용해를 의미한다(예를 들어, Cunha et al in Anal. Methods, 2014,6, 1377-1383, “Kinetics of hypotonic lysis of human erythrocytes”에서 설명됨).
“교착(Aggulutination)” 및 “응집”및 "교착시키다" 및 "응집시키다"는 본원에서 동의어로서 사용된다. 이 용어들은 입자의 군집을 설명한다. 응집은 항원이 해당 항체 (동종응집소라고 불림)와 혼합되면 발생한다. 적혈구와 같은 세포의 군집은 항체 또는 보체 또는 렉틴과 같은 다른 분자의 존재 하에 응집된다. 항체 또는 다른 분자는 여러 입자와 결합하고 합쳐서 큰 복합체를 형성한다.
본 발명에 따른 “수직 유동 어세이” 또는 “수직 유동 면역 어세이”는 어세이 장치를 통한 유체의 수직 유동을 특징으로 한다. 상기 어세이 장치는 예를 들어, 선택적 투과성(크기 배제) 또는 액체에 대한 다른 흡수 특성과 관련하여 동일하거나, 바람직하게는 다른 기능성의 층이 쌓여있는 다중성(즉, 적어도 2개 이상 특히 3개) 층을 포함한다. 이러한 기능층은 그리드, 필터 막 및 흡수층으로부터 선택될 수 있다.
“흡수층(absorbent layer)”은 분석되는 샘플의 액체상, 어세이 방법동안 첨가되는 세척액 뿐만 아니라 장치 내에 첨가되는 액체 시약 매체의 액체상(액체상에서 필요한 시약의 용액 또는 분산액) 뿐만 아니라 상기 시약 매체의 미반응 성분을 물리적으로 흡수하는 능력을 갖는 적절한 천연 또는 합성 물질을 포함한다. 상기 흡수층의 크기(부피)는 흡수되는 액체의 총 부피 및 흡수성 물질의 흡수 용량에 의존하며, 바람직하게는 흡수되는 액체의 부피를 초과한다.
달리 언급하지 않는 한, “상부”는 분석되는 샘플(예를 들어 선택적으로 전처리된 혈액 샘플)이 첨가되어 장치에 들어가는 장치의 면을 의미한다.
달리 언급하지 않는 한, “내부”는 주변 환경과 직접 접촉하지 않거나 실질적으로 접촉하지 않는 장치의 부분을 의미한다.
장치의 “제1 구성(configuration)”은 또한 “샘플 추가 구성”으로 지칭될 수 있다.
장치의 “제2 구성(configuration)”은 또한 “시약 추가 구성” 또는 “판독 구성” 또는 “리딩 구성”으로 지칭될 수 있다.
장치의 “제1 개구”는 또한 “샘플 추가 개구” 또는 “샘플 공급 개구”로 지칭될 수 있다. 상기 개구에 선택적으로 전처리된 혈액 샘플을 첨가하고 제1 필터 층을 세척함으로서, 상기 샘플에서 선택적으로 형성된 세포 응집체는 상기 필터에 유지된다.
장치의 “제2 개구”는 또한 “시약 추가 개구”, “리딩 개구” 또는 “판독 개구”로 지칭될 수 있다. 피분석물(예를 들어, 분석되는 세포 또는 세포 표면 마커)에 특이적인 시약의 첨가시 형성된 검출 가능한 신호는 상기 개구로부터 검출되고 판독될 수 있다.
“다중” 검출은 동일한 샘플에서, 바람직하게는 동일한 어세이 장치에서, 동일 또는 다른 스팟에서 다른 피분석물(항원 같은)의 동시 검출을 의미한다.
다중화는 어세이 장치에서 하나 이상의 미리 결정된 위치 및/또는 패턴에서 동일한 샘플을 스팟팅함으로서 쉽게 달성된다. 보다 쉬운 시각화를 위해, 다중화는 예를 들어 다른 색상의 입자가 연결된 구별할 수 있는 표지를 지닌 분석 프로브(예를 들어 항체)가 연결될 수 있다. 만약 다른 스팟을 다른 피분석물에 적용하는 경우 특정 항원의 존재는 상응하는 표지(색상) 신호의 출현에 의해 쉽게 검출가능할 수 있다. 만약 하나의 단일 스팟에 혼합된 표지(색상)가 존재하는 경우, 만약 2개 이상의 다른 항원이 샘플에 존재한다면 혼합된 표지(색상)의 조성은 예를 들어, 분광적 방식과 같은 적절한 방법으로 분석되어야 한다.
B. 바람직한 구현예
B1. 본 발명은 하기의 특정 구현예에 관한 것이다.
1. 액체 전혈 샘플 또는 이로부터 유래된 샘플에서 관심 있는 혈액 세포(Bcol)의 하나 이상의 서브클래스를 분석하기 위한 어세이 방법으로서, 각각은 상기 관심있는 혈액 세포의 서브클래스에 대한, 바람직하게는 구별할 수 있는 제1 세포 표면 마커(또는 세포 표면 수용체 분자)(M1)를 지니고, 이것은 세포의 다른 서브-클래스에 대한 상기 마커(M1)는 서로 다른 것(즉, 항원성이 달라 구별할 수 있는)을 의미하며,
상기 샘플은 비-특이적 마커로서 적어도 하나의 상기 제1 세포 표면 마커(M1)를 지녀서 하나 이상의 상기 마커(M1)를 또한 지니는 BCoI의 상기 서브클래스의 분석을 방해하는 방해 혈액 세포(DBC)를 추가로 포함할 수 있고(또는 포함하는 것으로 의심될 수 있고), 및/또는 상기 샘플은 바람직하게는 상기 제1세포 표면 마커(M1)의 (예를 들어 가용성) 세포외 단편과 같은, 적어도 하나의 자유(예를 들어 용해된), 비-세포 표면 결합 형태를 추가로 포함할 수 있고(또는 포함하는 것으로 의심될 수 있고, 상기 방법은
(1) 또한 적어도 하나의 상기 제1 세포 표면 마커(M1)를 지니는, 임의의 방해 혈액 세포(DBC)를 상기 샘플에서 제거하는 단계;
(2) 단계 (1) 에서 얻은 상기 샘플로부터 제1 세포 표면 마커 각각의 임의의 자유, 비-세포 표면 결합 형태를 제거하는 단계; 및
(3) 단계 (2)에서 얻은 샘플에서 상기 제1 세포 표면 마커(M1)을 지니는 상기 Bcol의 서브-클래스를 각각 분석하는 단계를 포함한다.
특히, 상기 전혈 샘플은 포유 동물, 바람직하게는 인간, 헌혈자와 같은 개체, 또는 전혈 세포, 특히 적어도 하나의 상기 BCoI의 모집단의 세포 프로파일 또는 구성 요소에 영향을 미치는 질병을 겪거나 또는 질병을 겪고 있다고 의심되는 환자로부터의 혈액이다. 이것은 예를 들어, 바늘을 통한 정맥혈 채취, 또는 날카로운 물건에 의해 손가락이 찔린 후에 수집된 모세혈로부터 얻을 수 있다.
제1 특정 대안에서 본 방법은 BCoI의 하나의 단일 서브-클래스의 분석을 포함하고, 단계 (1) 내지 (3)은 한번에 수행된다. 바람직하게는, 상기 하나의 단일 서브-클래스는 CD4⁺ 세포를 포함하고, 상기 표면 마커 M1은 CD4이다. 상기 DBC는 M1 마커 CD4를 지닌 CD14⁺ 세포를 포함하고, 특히 상기 DBC는 CD14⁺ 단핵 세포를 포함한다. 상기 제1 세포 표면 마커 M1의 상기 비-세포 표면 결합 형태는 CD4로부터 유래되고, 즉 그의 가용성 단편을 포함한다.
제2 특정 대안에서 본 방법은 BCoI의 2가지 다른 서브-클래스의 다중성 분석을 포함하고 단계 (1) 내지 (3)은 세포의 각 서브클래스에 대해 개별적으로 수행된다.
상기 제2 특정 대안의 변형에서 본 방법은 BCoI(예를 들어 CD4⁺ 세포 및 CD8⁺ 세포)의 2가지 다른 서브-클래스의 다중성 분석을 포함하고 단계 (1) 내지 (3)은 BCoI의 제1 서브클래스(예를 들어 CD4+ 세포)에 대해 수행되고, 만약 다른 혈액 세포가 세포의 상기 제2 서브-클래스의 분석을 방해하지 않는다면 적어도 단계 (2) 및 (3)은 세포의 제2 서브-클래스(예를 들어 CD8+ 세포)에 대해 개별적으로 수행된다.
바람직하게, 상기 2가지 다른 서브-클래스는 CD4⁺ 세포(제1 서브클래스) 및 CD8⁺ 세포(제2 서브클래스)를 포함하고 분석되는 세포 표면 마커 M1은 CD4(즉, M1a) 및 CD8(즉, M1b)이다. 상기 DBC는 또한 상기 CD4 마커(M1a)를 지니는, CD14⁺ 세포, 특히 CD14⁺ 단핵세포를 포함한다. 상기 마커 M1a 및 M1b의 상기 비-세포 표면 결합 형태는 CD4 및/또는 CD8로부터 유래되고, 즉 CD4 및/또는 CD8의 가용성, 비-세포 결합 단편을 포함한다.
제3 특정 대안에서 본 방법은 BCoI의 2가지 다른 서브-클래스의 다중성 분석을 포함하고 단계 (1) 내지 (3)은 한번에 수행된다.
제4 특정 대안에서 본 방법은 BCoI의 2가지 다른 서브-클래스의 다중성 분석을 포함하고 단계 (3)은 각 상기 서브클래스에 대해 개별적으로 수행되는 반면 단계 (1) 및 (2)은 한번에 수행된다.
바람직하게는, 상기 제2, 제3 및 제4 대안에서, 상기 2가지 다른 서브-클래스는 CD4⁺ 세포(제1 서브-클래스) 및 CD8⁺ (제2 서브클래스)를 포함하고 분석되는 상기 표면 마커 M1은 CD4(즉, M1a) 및 CD8(즉, M1b)이다. 상기 DBC는 또한 상기 CD4 마커(M1a)를 지니는, CD14⁺ 세포, 특히 CD14⁺ 단핵세포를 포함한다. 상기 마커 M1a 및 M1b의 상기 비-세포 표면 결합 형태는 CD4 및/또는 CD8로부터 유래되고, 즉 CD4 및/또는 CD8의 가용성, 비-세포 결합 단편을 포함한다.
2. 구현예 1에 있어서, 수직 유동 어세이 방법이고 특히 수직 유동 면역어세이인 것인, 어세이 방법.
3. 전술한 구현예 중 하나에 있어서, 단계 (1)에서 상기 DBC는 여과에 의해 제거되고, 특히 그리드(grid) 또는 예를 들어 나일론 네트와 같은 네트를 통해 여과되는 것인, 방법.
4. 구현예 3에 있어서, 상기 DBC는 응집되고, 상기 응집체는 단계 (1)에서 이용한 필터에 의해 유지되는 것인, 방법.
5. 구현예 4에 있어서, 상기 DBC는 상기 BCoI에 결합하지 않는 면역 글로불린 분자에 의해 응집된 것인, 방법.
6. 구현예 5에 있어서, 상기 DBC는 상기 BCoI의 표면 상에 존재하지 않는 제2 세포 표면 마커(M2)에 결합하는 면역 글로불린 분자에 의해 응집된 것으로서(따라서 구별할 수 있는 마커로 확인할 수 있다), 특히 상기 제2 세포 표면 마커 (M2)는 상기 DBC에 대해 구별할 수 있거나, 또는 상기 DBC에 특이적일 수 있는 것인, 방법.
7. 구현예 5 또는 구현예 6에 있어서, 상기 DBC 결합 면역 글로불린은 자유 항체, 중합 항체 또는 고형 입자, 특히 중합체 입자의 표면에 결합된 항체로부터 선택된 것인, 방법.
8. 전술한 구현예 중 하나에 있어서, 단계 (2)에서의 상기 제1 세포 표면 마커(M1)의 비-세포 표면 결합 형태는 상기 제1 세포 표면 마커(M1)의 상기 비-세포 표면 결합 형태에 대해서는 투과성이 있지만, BCol은 유지되는 필터를 이용한 여과에 의해 제거된 것인, 방법.
9. 전술한 구현예 중 하나에 있어서, 상기 단계 (3)의 분석은 상기 제1 세포 표면 마커(M1), 바람직하게는 상기 마커의 세포외 부분과 (특이적으로) 반응하는 면역 글로불린 분자, 바람직하게는 단일클론 또는 다중클론, 설치류 또는 조류와 같은 비-인간 항체에 의해 수행되는 것인, 방법.
10. 구현예 9에 있어서, 상기 면역 글로불린 분자는 표지된 것인, 방법.
11. 구현예 10에 있어서, 상기 표지는 효소; 형광 또는 유색 분자 마커; 또는 형광 또는 유색 입자로부터 선택된 것인, 방법.
12. 전술한 구현예 중 하나에 있어서, 상기 BCoI는 림프구의 서브-클래스로부터 선택된 것으로서, 특히 T-림프구이고, 상기 DBCs는 단핵 백혈구인 것인, 방법.
13. 전술한 구현예 중 하나에 있어서, 상기 제1 세포 표면 마커(M1)는 T-림프구 마커(M1a)로서, 특히 CD4 세포 표면 수용체 분자인 것인, 방법.
14. 전술한 구현예 중 하나에 있어서, 상기 분석된 관심있는 혈액 세포(BCoI)의 하나 이상의 서브-클래스는 CD4⁺ 세포를 포함하는 것인, 방법.
15. 전술한 구현예 중 하나에 있어서, 상기 제1세포 표면 마커(M1a)는 CD4이고, 상기 세포의 특이적인 제1 서브-클래스는 T-도움 세포인 것인, 방법.
16. 전술한 구현예 중 하나에 있어서, 상기 방법은 또한 제1 세포 표면 마커(M1a)와 상이한, 바람직하게는 구별할 수 있는 제2세포 표면 마커(M1b)를 지니는 혈액 세포(BCoI)의 제2 서브-클래스의 분석을 포함하는 것인, 어세이 방법.
17. 구현예 16에 있어서, 상기 세포 표면 마커(M1b)는 (M1a)와 상이한 T-림프구 마커로서, 특히 표면 마커 CD8이고, 상기 세포의 제2 서브-클래스는 CD8⁺ 세포를 포함하는 것인, 방법.
18. 구현예 17에 있어서, 상기 표면 마커(M1b)는 CD8이고, 상기 세포의 특이적인 제2 서브-클래스는 세포독성 T-세포인 것인, 어세이 방법.
19. 구현예 16 내지 구현예 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 세포 표면 마커 (M1b)를 지니는 상기 BCoI의 제2 서브-클래스의 분석은 제1세포 표면 마커(M1a)를 지니는 상기 BCoI의 제1 서브클래스의 분석과 함께 수행되는 것으로서, 특히 동일한 샘플에서 수행되는 것인, 방법.
20. 구현예 16 내지 구현예 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 마커(M1b)를 지니는 상기 BCoI의 제2 서브-클래스의 분석은 별도로 수행되는 것인, 방법.
21. 구현예 20에 있어서, 상기 방법은
(4) 선택적으로 상기 샘플로부터 분석을 방해할 수 있는 임의의 방해 거대분자 불순물을 제거하는 단계;
(5) 상기 샘플(선택적으로 단계 (4)에서 얻은)로부터 상기 제1 세포 표면 마커(M1b)의 임의의 자유, 비-세포 결합 형태를 제거하는 단계; 및
(6) 단계 (5)에서 얻은 샘플에서 상기 세포 표면 마커(M1b)를 지니는 상기 BCol의 서브-클래스를 분석하는 단계
를 포함하는, 방법.
22. 구현예 21에 있어서, 단계 (5)에서 상기 제2세포 표면 마커(M1b)의 상기 비-세포 표면 결합 형태는 상기 세포 표면 마커(M1b)의 상기 비-세포 표면 결합 형태에 대해서는 투과성이 있지만, (M1b)를 지니는 BCol의 서브-클래스는 유지되는 필터를 이용한 여과에 의해 제거된 것인, 방법.
23. 구현예 22에 있어서, 상기 단계 (6)의 분석은 상기 세포 표면 마커(M1b), 바람직하게는 상기 마커의 세포외 부분과 반응하는 면역 글로불린 분자, 바람직하게는 단일클론 또는 다중클론, 설치류 또는 조류와 같은 비-인간 항체에 의해 수행되는, 방법.
24. 구현예 23에 있어서, 상기 면역 글로불린 분자는 표지된 것인, 방법.
25. 구현예 24에 있어서, 상기 표지는 효소; 형광 또는 유색 분자 마커; 또는 형광 또는 유색 입자로부터 선택된 것인, 방법.
26. 전술한 구현예 중 하나에 있어서, 상기 DBC는 CD14⁺ 단핵 백혈구인 것인, 방법.
27. 전술한 구현예 중 하나에 있어서, 단계 (1)에서의 DBCs의 응집은 면역 글로불린, 바람직하게는 단일클론 또는 다중클론, 설치류 또는 조류와 같은 비-인간 항체를 포함하는 제1 액체를 첨가하는 것에 의해 수행되는 것으로서, 상기 액체는 샘플에 함유된 적혈구를 용해시킬 수 있는 것인, 방법.
28. 전술한 구현예 중 하나에 있어서,
(1a) 상기 샘플 또는 상기 샘플의 분액을, 상기 CD4 수용체를 지니지만 상기 세포의 특이적 서브-그룹(특히 CD4⁺-세포)과는 상이한 다른 세포(특히 DBC)의 표면상의 다른 구조물에 결합하는 항체를 포함하는 제1 액체와 혼합하여, 상기 세포의 특이적 서브-그룹에서 세포의 크기보다 유의하게 큰 크기를 갖는 입자; 또는 입자 또는 세포의 응집체 또는 클러스터를 형성하는 단계;
(1b) 크기 배제 필터에 기초를 두고 있는 제1 필터에 의해 상기 형성된 입자; 또는 입자 또는 세포의 응집체 또는 클러스터를 여과하는 단계; 및
(2) 상기 샘플 내의 상기 세포의 특이적 서브-그룹(특히 CD4⁺-세포)은 유지하지만 용액 내의 CD4 수용체 분자는 통과하게 하는 제2 필터를 통해 나머지 혼합물을 통과시키고, 선택적으로 뒤이어 세척하는 단계;
(3a) 뒤이어 상기 제2 필터를 상기 CD4 수용체에 특이적으로 반응하는 표지된 항체를 포함하는 액체에 노출시키고, 선택적으로 뒤이어 세척하는 단계로서, 상기 표지는 효소 또는 발색 또는 형광 입자에 의해 구성된 표지인 단계;
(3b) 선택적으로 뒤이어 상기 효소에 기질을 첨가하여 발색 또는 형광 물질을 발생시키는 단계; 및
(3c) 상기 제2 필터에 발색 또는 형광 강도를 측정하고 상기 강도를 상기 세포의 특이적 서브-그룹(특히 CD4⁺-세포)의 표면에 CD4 수용체의 클래스의 농도와 상호비교하는 단계를 포함하는 방법.
29. 전술한 구현예 중 하나에 있어서, (선택적) 분석 전에(단계 (1)이 수행되기 전에) 상기 혈액 샘플에 적혈구의 저삼투성 용해를 수행하는 단계로서, 바람직하게는 백혈구의 용해 없이 적혈구의 저삼투성 용해[예를 들어, “Kinetics of hypotonic lysis of human erythrocytes” (Cunha et al in Anal. Methods, 2014,6, 1377-1383)에서 설명된]를 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
30. 전술한 구현예 중 하나에 있어서, 상기 CD4⁺ 세포군의 세포 수가 분석된 것인(세포 수/샘플 부피), 방법.
31. 구현예 30에 있어서, 상기 CD4⁺ 세포군 및 CD4⁺ 세포와는 다른 적어도 하나의 추가적인 세포군으로서, 특히 CD8⁺ 세포군에 대한 세포 수가 분석된 것으로서, 특히 CD4/CD8 비율이 분석된 것인, 방법.
32. 전혈 샘플 또는 혈액으로부터 유래한 샘플에서 CD4⁺ 세포의 표면상에 위치하는 CD4 수용체의 양을 분석하고 선택적으로 CD8⁺ 세포의 표면상에 위치하는 CD8 수용체의 양을 분석하는 방법으로서, 상기 방법은 구현예 1 내지 29 중 어느 하나의 방법을 수행하는 단계 및 세포-결합 CD4⁺ 수용체의 양과 함께 CD4⁺ 세포군의 분석을 위해 얻은 신호를 상호비교하는 단계, 선택적으로 세포-결합 CD8⁺ 수용체의 양과 함께 CD8⁺ 세포군의 평가를 위해 얻은 신호를 상호비교하는 단계를 포함하는, 분석 방법.
33. 전술한 구현예 중 하나에 있어서, 상기 방법에 이용되는 상기 면역 글로불린 분자는 단일 클론 또는 다중 클론 비-인간 항체와 같은 항체로서, 특히 조류와 같은 비-설치류 항체(특히 항 CD4, 항 CD8 및 항 CD14 항체)인, 방법.
34. 전술한 구현예 중 하나에 있어서, 상기 (M1a) 및/또는 (M1b) 특히, CD4⁺ 또는 CD8⁺ 세포에 결합하기 위해 이용된 면역 글로불린은 30 내지 500 nm 범위의 평균 입자 직경을 갖는 발색된 라텍스 입자에 공유 결합(면역 글로불린으로 코팅되기 전에)하는 것인, 방법.
35. 구현예 1 내지 34 중 어느 하나의 방법을 수행하기 위한 수직 유동 어세이 장치로서,
상기 장치는 적어도 하나의 원형, 바람직하게는 액체 샘플 공급 개구(102)이 제공된 상부 커버 시트(101) 및 상기 상부 커버 시트(101)에 고정된 하부 흡수층(105);
상기 적어도 하나의 원형 개구(102)에 제거 가능하게 삽입된 제1 원형 필터(106);
상기 상부 커버 시트(101) 및 상기 하부 흡수층(105) 사이에 고정되고, 상기 적어도 하나의 공급 개구(102)와 그 내부에 삽입된 상기 원형 필터(106)를 상기 흡수층(105)으로부터 분리시킨 제2 필터(104)
를 포함하는, 수직 유동 어세이 장치.
36. 구현예 35에 있어서, 상기 제1 원형 필터(106)는 캐리어 고리(108)을 통해 접착 테이프(107)에 고정되고, 상기 고리(108)는 샘플 공급 개구(102)보다 약간 작은 외부 직경을 갖고, 미리 결정된 샘플 부피를 정량적으로 차지하기에 충분한 자유 원형 공간이 정해지도록 선택된 내부 직경을 갖는 것인, 장치.
37. 구현예 36에 있어서, 상기 테이프(107)은 상기 상부 커버 시트(101)의 상부 면에 제거 가능하게 접착된 것인, 장치.
38. 구현예 35 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 원형 개구(102) 안으로 제거가능하게 삽입된, 상기 제1 원형 필터(106)는 상기 상부 커버 시트(101)로부터 테이프(107)를 제거함에 의해 장치로부터 제거된 것인, 장치.
39. 상부 케이싱(casing) 요소(1) 및 하부 케이싱 요소(2),
기능성 층(5, 6, 7)의 더미(stack)가 차지하기에 적합한 테스트 구획을 형성하는 방식으로 조립된 상부(1) 및 하부 케이싱 요소(2),
상부 케이싱 요소(1)의 상부 테스트 구획 내부 표면(1a) 및 하부 케이싱 요소(2) 의 하부 테스트 구획 내부 표면(2a)을 포함하는 테스트 구획,
하부 케이싱 요소(2)에 대해 이동 가능하여, 상기 어세이 장치의 제1 구성 및 제2 구성을 정하는 상부 케이싱 요소(1),
외부로부터 테스트 구획으로의 접근을 제공하는 제1 개구(3) 및 제2 개구(4)을 갖는 상부 케이싱 요소(1),
제1 구성에서 하부 케이싱 요소(2)에 대한 제1 개구(3)의 위치는 제2 구성에서 하부 케이싱 요소(2)에 대한 제2 개구(4)의 위치와 필수적으로 동일하도록 배열된 상기 제1 개구(3) 및 제2 개구(4)을 포함하는 어세이 장치.
40. 구현예 39에 있어서, 하부 케이싱 요소(2)에 대해 회전 가능한 상부 케이싱 요소(1)를 특징으로 하는, 어세이 장치.
41. 구현예 39 및 40 중 어느 하나에 있어서, 기능성 층 더미(stack)는 서로의 위에 배열되고 상부 테스트 구획 표면(1a) 및 하부 테스트 구획 표면(2a)에 필수적으로 평행하게 연장된, 상부 막 층(6) 및 하부 흡수 층(7)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 어세이 장치.
42. 전술한 구현예 39 및 41 중 어느 하나에 있어서, 적어도 상부 막 층(6)이 하부 케이싱 요소(2)에 고정된 것을 특징으로 하는, 어세이 장치.
43. 구현예 39 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 이동 제한기(21)은 상부 케이싱 요소(1)안에 형성되고 또 다른 이동 제한기(22)는 하부 케이싱 요소(2)안에 형성되고, 상기 이동 제한기들(21, 22)이 상부 케이싱 요소(1)가 하부 케이싱 요소(2)에 대해 제1구성에 대응하는 제1 극단 위치 및 제2 구성에 대응하는 제2 극단 위치 사이를 이동 가능한 방식으로 제공되는 것을 특징으로 하는, 어세이 장치.
44. 구현예 39 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상부 케이싱 요소(1)는 여러 개의 제1 개구(3, 3') 및 제2 개구(4, 4')를 갖고, 상기 제1 개구(3, 3') 각각은 하나의 제2 개구(4, 4')와 관련되고, 상기 제1 개구(3, 3') 및 제2 개구(4, 4')는 상기 제1 구성에서 하부 케이싱 요소(2)에 대한 제1 개구(3, 3')의 위치가 제2 구성에서 하부 케이싱 요소(2)에 대한 제2 개구(4, 4')의 위치와 필수적으로 동일하도록 배열된 것을 특징으로 하는, 어세이 장치.
45. 구현예 35 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 원형 필터(106, 5)는 응집된 혈액 세포,특히, 응집된 CD14⁺ 단핵 세포를 유지하는 개구 또는 기공을 갖고, 비-응집된 혈액 세포, 특히 CD4⁺ 세포, 선택적으로 CD8⁺ 세포에 투과성이 있는 것인, 장치.
46. 구현예 45에 있어서, 상기 제1 원형 필터(106, 5)는 18 내지 50㎛, 바람직하게 22 내지 40㎛, 보다 바람직하게 25 내지 33㎛의 범위의 그리드 크기를 갖는 네트 필터인, 장치.
47. 구현예 35 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 필터(104) 또는 막 요소(6)는 비-응집된 혈액 세포를 유지하는 개구 또는 기공을 갖고, 상기 액체 샘플내 가용성 구성 성분에 대해 투과성이 있는 것인, 장치.
48. 구현예 47에 있어서, 상기 제2 필터(104) 또는 막 요소(6)는 1 내지 10㎛, 바람직하게는 3 내지 9㎛, 보다 바람직하게는 5 내지 8㎛ 범위의 기공 크기를 갖는 것인, 장치.
49. 구현예 35 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 흡수층(105, 7)은 수직 유동 어세이 과정 동안 상기 샘플 공급 개구(102, 3, 3')에 첨가된 샘플 및 시약의 임의의 액체 구성 성분 및 세척 용액을 흡수하기에 충분히 높은 흡수 용량을 갖는, 장치.
50. 분석 또는 진단 목적, 특히 의학적 진단 또는 분석 목적, 및 바람직하게는 구현예 1 내지 34 중 어느 하나에서 정의된 어세이를 수행하기 위한 구현예 35 내지 49 중 어느 하나에서 정의된 장치의 용도.
B2. 추가적인 바람직한 구현예
하기 구현예의 문맥에서 “수용체의 클래스”는 특히 “CD4 수용체”를 의미한다.
상기 “세포의 특이적 군”은 특히 “CD4+ 세포”를 의미한다.
Ⅰ. 전혈 샘플 또는 혈액으로부터 유래된 샘플에서 세포의 특이적 군의 표면에 위치한 수용체의 클래스의 양을 분석하는 방법으로서,
a) 상기 샘플 또는 상기 샘플의 분액을, 상기 수용체를 지니지만 상기 세포의 특이적 서브-그룹과는 상이한 다른 세포의 표면상의 다른 구조물에 결합하는 항체를 포함하는 제1 액체와 혼합하여, 상기 세포의 특이적 서브-그룹내 세포의 크기보다 유의하게 큰 크기를 갖는 입자; 또는 입자 또는 세포의 응집체 또는 클러스터를 형성하는 단계;
b) 크기 배제 필터에 기초를 두고 있는 제1 필터에 의해 상기 형성된 입자; 또는 입자 또는 세포의 응집체 또는 클러스터를 여과하는 단계; 및
c) 상기 샘플 내의 상기 세포의 특이적 서브-그룹은 유지하지만 용액 내의 CD4 수용체 분자는 통과하게 하는 제2 필터를 통해 나머지 혼합물을 통과시키고, 선택적으로 뒤이어 세척하는 단계;
d) 뒤이어 상기 제2 필터를 상기 수용체에 특이적으로 반응하는 표지된 항체를 포함하는 액체에 노출시키고, 선택적으로 뒤이어 세척하는 단계로서, 상기 표지는 효소 또는 발색 또는 형광 입자에 의해 구성된 표지인 단계;
e) 선택적으로 뒤이어 발색 또는 형광 물질을 발생시키는 상기 효소에 기질을 첨가하는 단계; 및
f) 상기 제2 필터상에 발색 또는 형광 강도를 측정하고 상기 강도를 상기 세포의 특이적 군의 표면에 수용체의 클래스의 농도와 상호비교하는 단계
를 특징으로 하는, 방법.
Ⅱ. 구현예 Ⅰ에 있어서, 전혈 샘플 또는 혈액으로부터 유래된 샘플에서 세포의 특이적 군의 표면에 위치한 수용체의 클래스의 양을 분석하는 방법으로서,
a) 상기 샘플 또는 상기 샘플의 분액을, 상기 수용체를 지니지만 상기 세포의 특이적 서브-그룹과는 상이한 다른 세포의 표면상의 다른 구조물에 결합하는 항체를 포함하는 제1 액체와 혼합하여, 상기 세포의 특이적 서브-그룹내 세포의 크기보다 유의하게 큰 크기를 갖는 입자; 또는 입자 또는 세포의 응집체 또는 클러스터를 형성하는 단계;
b) 크기 배제 필터에 기초를 두고 있는 제1 필터에 의해 상기 형성된 입자; 또는 입자 또는 세포의 응집체 또는 클러스터를 여과하는 단계; 및
c) 상기 샘플 내의 상기 세포의 특이적 서브-그룹은 유지하지만 용액 내의 CD4 수용체 분자는 통과하게 하는 제2 필터를 통해 나머지 혼합물을 통과시키고, 선택적으로 뒤이어 세척하는 단계;
d) 뒤이어 상기 제2 필터를 상기 수용체에 특이적으로 반응하는 표지된 항체를 포함하는 액체에 노출시키고, 선택적으로 뒤이어 세척하는 단계로서, 상기 표지는 발색 또는 형광 입자에 의해 구성된 표지인 단계;
e) 상기 제2 필터 상에 발색 또는 형광 강도를 측정하고 상기 강도를 상기 세포의 특이적 군의 표면에 수용체의 클래스의 농도와 상호비교하는 단계
를 포함하는 방법.
Ⅲ. 구현예 Ⅰ 또는 Ⅱ 중 어느 하나에 있어서, 상기 수용체는 CD4이고 상기 세포의 특이적 군은 T 림프구인 것인, 방법.
Ⅳ. 구현예 Ⅰ 내지 Ⅲ 중 어느 하나에 있어서, 상기 수용체를 지니지만 상기 세포의 특이적 군과는 상이한 다른 세포의 표면상의 다른 구조물에 결합하는 항체는 수용체 CD14에 대해 반응하는 항체인 것을 특징으로 하는, 방법.
Ⅴ. 구현예 Ⅰ 내지 Ⅳ 중 어느 하나에 있어서, 상기 수용체를 지니지만 상기 세포의 특이적 군과는 상이한 다른 세포의 표면상의 다른 구조물에 결합하는 항체는 중합된 항체이거나 또는 입자 또는 중합체 또는 상기 세포의 특이적 군의 세포의 크기보다 유의하게 큰 크기를 갖는 입자 또는 입자 또는 세포의 응집체 또는 클러스터를 형성하는데 유용한 다른 큰 분자에 고정된 것인, 방법.
Ⅵ. 구현예 Ⅰ 내지 Ⅴ 중 어느 하나에 있어서, 항체를 포함하는 상기 제1 액체는 샘플의 적혈구를 용해할 수 있는 액체인 것인, 방법.
Ⅶ. 구현예 Ⅰ 내지 Ⅵ 중 어느 하나에 있어서, 항체를 포함하는 상기 제1 액체는 CD14 수용체 분자에 대한 특이적 반응성을 갖는 항체를 포함하는, 방법.
C. 추가적인 구현예
C.1 CD4, CD8 또는 CD14 - 결합 면역글로불린
달리 언급되지 않는 한, 그러한 면역 글로불린은 바람직하게 상기 마커 중 하나의 세포외 부분(항원 결합 도메인)에 대해 지향된다. 만약 상기 마커 중 하나의 동형 단백질(isoform)이 존재한다면 상기 면역 글로불린은 제거되는 DBC 또는 본 발명에 따라 평가되는 BCoI 안에/표면 상에서 발견되는 각각 또는 모든 동형단백질에 지향될 수 있다.
C.1.1 다중클론 항체
다증클론 항-인간 CD4, CD8 또는 CD14 항체를 당업계에서 잘 알려진 방법(예를 들어, Chase, M. W., 1967, in "Methods of Immunology and Immunochemistry", ed. Williams, A. et al., M. W., pp. 197-209, Academic Press, New York에서 설명됨)으로 제조할 수 있다. 간략하게, 적합한 종(예를 들어 토끼, 염소, 또는 양, 또는, 바람직하게는 조류, 특히 닭과 같은 가금류)의 동물은 반복적으로 적절한 보강제, 예를 들어 프로인트(Freund) 완전 또는 불완전 항원보강제에서 정제된 항원으로 면역화시켰다. 면역화 후에 상기 동물의 피를 뽑아서 다중클론 항체를 예를 들어, 황산 암모늄 또는 염화 암모늄 침전법, 음이온 교환 크로마토그래피, 면역 친화성 크로마토 그래피, 및/또는 친화성 크로마토그래피와 같은 방법으로 정제하였다.
매우 우수한 신호를 얻기 위해, 높은 결합력의 항체가 바람직할 수 있다. 다중클론 항체는 많은 다른 항체 분자를 포함하기 때문에, 친화성 상수는 계산될 수 없지만, 높은 결합력 및 친화성은 통상적인 다중글론 항체 기술에 의해 얻어진다. 통상적인 방법으로 얻은 토끼 항체를 사용했지만, 양 항체로 더 좋은 결과를 얻었다. 또한 조류 항체를 사용했을 때 더 좋은 결과를 얻었다. 상기 조류 항체는 방법(Larsson A, Baaloew R-M, Lindahl T, and Forsberg P-O in Poultry Science 72:1807-1812, 1993에서 기재된 방법)에 따를 수 있다. 인간과 유전적으로 더 구별되는 조류가 다중클론 포유동물 항체보다 높은 결합력을 갖는 인간 CD4, CD8 또는 CD14에 대한 항체를 생성할 수 있는 것으로 고려된다.
다중클론 조류 항체는 일반적으로 난황으로부터 얻는다(따라서, IgYs로 지칭된다). 그러나, 난황에는 많은 양의 지질을 포함하여, 그들의 추가적인 사용에는 문제가 있다. IgY는 난황으로부터 황산 암모늄(예를 들어, 25 내지 40%) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전을 순차적으로 이용하여 분리할 수 있다. 초기 정제를 위해 Gallus Immunotch Inc, Cary, USA로부터 상업적으로 얻을 수 있는 IgY 정제 키트 또는 Pierce, Rockford, USA로부터 상업적으로 얻을 수 있는 Eggcellent Chicken IgY 정제 키트를 제조업체의 지침을 고려하여 이용할 수 있다.
또한, 예를 들어, www.piercenet.com으로부터 다운로드 한 “Affinity Purification of Proteins”(2006년, 4월)에서의 지시에 따른 항원 친화성 정제 방법을 사용하여 정제된 항체를 사용하여 다증클론 항체의 결합력을 추가적으로 증가시킬 수 있고, 상기 친화성 정제는 하기에서 더 자세히 설명된다.
“증가된 결합력”은 사용된 항체의 20%가 항원 친화성 정제된 경우 관찰되었고, 50%의 항체가 항원 친화성 정제된 경우 훨씬 더 많은 증가가 관찰되었고 75% 내지 100%와 같이, 75% 이상의 항체가 항원 친화성 정제 방법에 의해 얻어진 경우 훨신 더 많은 증가가 관찰되었다.
(예를 들어 조류) 다중클론 항-인간 CD4, CD8 또는 CD14 항체의 친화성 정제를 위해, 적합한 인간 CD4, CD8 또는 CD14 친화성 칼럼이 제조되어야 한다. 정제된 인간 CD4, CD8 또는 CD14을 표준 프로토콜에 의해 예를 들어 세파로오스(Sepharose) 또는 어피-겔(Affi-Gel)과 같은 적합한 고체 지지체에 고정시키고, 항원을 지지체에 공유결합으로 활성화 시켰다(적합한 활성화된 고체 지지체는 예를 들어 Pierce, Rockford, USA로부터 이용 가능하다). 친화성 컬럼은 상기 항원-운반 수지로부터 제조된다.
항체의 성공적인 친화성 정제는 항체의 결합 부위에 대한 항원 상의 관련 에피토프의 효과적인 제시에 의존한다. 만약 항원이 작고 다중 화학 결합에 의해 고체 지지체 표면에 직접적으로 고정된다면, 중요한 에피토프가 차단되거나 또는 입체적으로 방해될 수 있어, 효과적인 항체 결합을 하지 못하게 된다. 따라서, 독특한 작용기(예를 들어, 펩타이드 내 단일 말단 시스테인 쌍의 설피드릴)를 이용하여 항원을 고정시키고 반응성기가 여러 개의 원자 길이의 스페이서 암(arm)상에 발생하는 활성화된 지지체를 사용하는 것이 가장 좋다. 특히 다수의 고정화 부위를 갖는 더 큰 항원의 경우, 항원 자체가 지지 매트릭스와 에피토프 사이에 효율적인 스페이서로 작용하기 ‹š문에 스페이서 암 길이는 덜 중요하게 된다.
각 과정의 핵심은 각 항원에 대한 항체의 친화성이기 때문에 일반적으로 항체의 친화성 정제를 위한 전형적인 결합 및 용출 조건에는 거의 변화가 없다. 항체는 생리학적 조건 하에서 항원을 단단히 인식하고 결합하도록 설계되었기 때문에, 대부분의 친화성 정제 과정은 생리학적 pH와 이온 강도를 모방한 결합 조건을 사용한다. 가장 일반적인 결합 완충액은 pH 7.2 및 1.5M NaCl (미리 혼합된 완충액 팩은 예를 들어, Pierce, Rockford, USA로부터 입수 가능하다)의 인산 완충 식염수(PBS) 및 트리스 완충 식염수(TBS)이다. 일단 항체가 고정화된 항원에 결합되면, 추가적인 결합 완충액을 사용하여 지지체로부터 결합되지 않은 물질을 세척한다. 비-특이적 결합을 최소화하기 위해서는, 세척 완충액은 임의의 약한 상호작용을 방해하기 위해 추가적인 염 또는 계면활성제를 함유할 수 있다.
특이적, 정제된 항체를 완충액의 pH 및/또는 이온 강도를 변화시킴으로써 친화성 수지로부터 용출시킨다(일반적인 용출 완충액은 예를 들어, Pierce, Rockford, USA로부터 입수 가능하다). 항체는 일반적으로 활성 손실을 최소화하면서 2.5 내지 11.5의 pH 범위를 견딜 수 있는 회복력있는 단백질이며, 이는 가장 일반적인 용출 전략이다. 어떤 경우에는, 항체-항원 상호작용이 pH 변화에 의해 효율적으로 파괴되지 않거나 또는 pH에 의해 손상되므로, 대안 전략을 사용해야 한다.
친화성 정제 프로토콜의 예는 다음과 같다:
단계 1: 각 사용 전에 잔류 단백질을 제거하기 위해 하기의 완충액을 순서대로 10 칼럼 부피로 사용하여 칼럼(~ 1ml 수지 베드)을 세척한다:
1. 0.2 M 글라이신, pH 2.8 ~10 ml
2. 0.1 M PBS, pH 7,2, 0.15 M NaCl ~10 ml
3. 상기 완충액의 사이클을 2번 반복한다. 그 다음, 동일한 PBS 완충액 ~ 5ml로 칼럼을 평형화시킨다.
단계 2: 침전물을 제거하기 위해 10ml의 가공하지 않은 항체 제조물을 원심분리한다.
단계 3: 상기 가공하지 않은 항체 제조물을 느린 유속을 사용하여 컬럼에 적용한다.
단계 4: 칼럼을 10ml의 0.1 M PBS, pH 7.2, 0.15 M NaCl로 광범위하게 세척한다.
단계 5: 상기 항체를 3ml 0.15 M 수산화 암모늄, pH 10.5 ±0.2를 사용하여 용출한다. 적절한 튜브로 분획을 수집한다. 적절한 블랭크(즉, 0.15 M 수산화 암모늄, pH 10.5±0.2)를 이용하여 각 분획의 A₂₈₀을 판독한다.
단계 6: 적절한 분획을 모은다. 풀의 A₂₈₀을 얻고 항체를 최대 2주 동안 실온에서 성숙시킨다. 만약 항체를 성숙 후 즉시 사용한다면, 코팅 과정을 따른다. 만약 반대라면, 항체를 NaN₃ 또는 Proclin 950과 같은, 방부제가 함유된 PBS에 대해 투석하고, 4℃에 보관해야 한다.
단계 7: 마지막으로, 칼럼은 NaN₃ 또는 Proclin 950과 같은, 방부제가 함유된 PBS로 광범위하게 세척해야 한다.
C.1.2. 단일클론 항체
다중클론 항체는 종종 입자-강화 어세이에서 단일클론 항체보다 선호된다. 단일클론 항체와는 달리, 다중클론 항체는 본질적으로 항원(또는 피분석물) 상의 많은 다른 에피토프에 반응하므로, 항원 분자 그 자체의 사이 및 항원 및 항체가 고정된 입자 사이의 교차-결합 및 네트워크를 더 쉽게 만들 수 있다. 대조적으로, 단일클론 항체는 일반적으로 오직 에피토프의 한가지 타입에만 결합하고, 이것은 교차-결합 및 네트워크를 형성하는 것을 더 어렵게 만든다. 그러나, 단일클론 항체는, 특히 오랜 기간의 제품 수명 동안 표준화 및 미리정의된 표준에 대한 품질 관리가 쉽기 때문에, 진단 업계에서는 종종 단일클론 항체의 사용을 선호한다. 다른 단일클론 항체의 칵테일, 특히 CD4, CD8 또는 CD14에 높은 친화성을 갖는 많은 다른 단일클론 항체로 구성된 경우 본 발명의 바람직한 구현예가 야기될 것이다.
단일클론 항-인간 CD4, CD8 또는 CD14 항체는 당업계에 널리 알려진 방법(예를 들어, G. Kohler at al., 1975, Nature 256, 495, G. Galfre et al., 1981, Meth. Enzymol. 73, 3-46, or R. Kennet, 1980, in: "Hybridomas: a new dimension in biological analysis", ed. R. Kennet et al., Plenum press, New York & London에 기재됨)에 의해 제조될 수 있다. 면역화된 마우스 또는 랫의 비장 세포 또는 말초 혈액 세포가, 예를 들어 폴리에틸렌 융합 방법을 사용하여 골수종 세포주와 융합된다. 융합 후 세포를 적절한 조건 하에서, 예를 들어 배양 플레이트에서 성장시키고 예를 들어 하이포크산틴(hypoxanthine)/아미노프테린(aminopterin)/티미딘(thymidine) (HAT) 선별 방법을 사용하여 정확하게 융합된 세포의 선별을 수행하였다. 항체 생산 세포주를 EIA, RIA 또는 응집 분석과 같은 방법으로 확인하였다. 항체 생산 세포주를 확인한 후에, 새로운 성장 세포주가 하나의 단일 세포에서 유래되었음을 보증하기 위해, 예를 들어 제한된 희석 방법에 의해 상기 세포를 반복적으로 서브-클로닝하였다.
C.1.3. 키메라 항체
키메라 항-인간 CD4, CD8 또는 CD14 항체는 G. L. Boulianne et al., 1984, Nature 312, 643-645에서 설명됨과 같이 당업계에서 널리 알려진 방법에 의해 얻을 수 있다. 상기 과정은 다음과 같은 간략하게 설명될 수 있다. 하나의 종 또는 그 일부의 단일클론 항체의 항원-결합 부위의 DNA를 다른 종의 또다른 항체의 항체 골격의 DNA로 전달시킨다. 이 새로운 제작물을 발현 벡터에서 클로닝하여, 항체를 생산하기 위한 상응하는 발현 시스템으로 전달한다.
C.1.4 재조합 항체
재조합 항-인간 CD4, CD8 또는 CD14 항체는 G. Winter et al., 1991, Nature, 349, 293 or J. S. Huston et al., 1988, Proc. Ntl. Acad. Sci. USA, 85, 5879.에서 설명됨과 같이 당업계에서 널리 알려진 방법에 의해 동물 비히클을 사용하지 않고 얻을 수 있다. 이러한 방법은 다음 단계가 포함된다: 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA(cDNA 또는 합성 DNA)를 숙주 세포, 예를 들어 대장균, 균류, 효모, 식물 또는 진핵 세포로 도입하는 단계, 원하는 특이성 및 친화성을 갖는 항체를 선별하고 상응하는 발현 시스템에서 상기 항체 또는 이의 단편을 발현시키는 단계.
C.1.5 항체 단편( fAb )
상기에서 설명된, 임의의 종의 다중클론 항체, 단일클론 항체(키메라 항체 및 또는 재조합 항체를 포함한다)의 Fab-, 및 F(ab')₂ -단편과 같은 단편은 예를 들어, A. Nissonoffet al., 1960, Arch Biochem Biophys, 89, 230, 또는 R. P. Porter, 1959, Biochem J, 73, 119 또는 E. Harlow et al, 1988, in "Antibodies--A Laboratory Manual", 626-631, Cold Spring Harbour Press, New York, USA에서 설명됨과 같이 당업계에서 널리 알려진 방법으로 제조될 수 있다.
C.1.6 인간 CD4, CD8 또는 CD14에 대한 다른 반응성의 항-인간 CD4, CD8 또는 CD14 항체의 선별
단일클론 항체 또는 이의 단편을 결합 파트너로 사용하는 경우, 다른 항체, 특히 고반응성 및 저반응성 항체의 선별을 각 단일클론 항체를 통상적인 코팅 방법에 의해 동일한 재료 및 크기의 나노입자 상에 개별적으로 코팅한 후, 피분석물과 교환하는 방식으로 나노 입자 시약을 주어진 비율, 예를 들어 1/1 v/v로 혼합하여 수행할 수 있다. 동일한 조건에서 나노 입자 시약의 교정 곡선을 생성한 후, 저농도의 피분석물에 대한 결과 교정 곡선의 가파른 정도가 면역학적 결합 파트너의 반응성에 대한 첫번째 표시를 제공한다.
결합 파트너로서 다중클론 항체를 사용하는 경우, 고반응성 및 저반응성 다중클론 항체의 제조는 다중클론 항체를 겔 매트릭스에 공유결합된 항원성 피분석물을 지니는, 친화성 크로마토그래피 칼럼에 도입함으로써 당업계에서 잘 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 용출 완충액의 구배로 저반응성 다중클론 항체 분획은 칼럼에서 첫번째로 용출될 것이고, 이어서 점점 더 높은 반응성을 갖는 분획이 용출될 것이다(S. Yamamoto et al., 1993, "Veterinary Immunology and Immunopathology" 36, 257-264, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam). 상기 분획의 반응성은 BIAcore 기기로 확인하거나 또는 이들을 동일한 크기 및 재료의 나노입자 상에 독립적으로 코팅하고 상응하는 교정(calibration) 곡선을 생성함으로서 확인할 수 있다.
항체의 선별은 나노입자 상에 코팅하는 전술한 과정에 의해 수행될 수 있으며, 검출 한계 분석 또는 전술한 바와 같은 그의 기능적 친화성의 결정이 뒤따른다. 만약 적절하다면, 인간 CD4, CD8 또는 CD14에 대한 그들의 친화성/친화력과 관련하여 상이한 다른 항-인간 CD4, CD8 또는 CD14 항체의 혼합물을 본 발명의 나노입자-항체 접합체의 제조에 사용할 수 있다. 적합한 혼합 비율은 제한된 일련의 실험으로 당업자에 의해 결정될 수 있다.
적합한 항-인간 CD4, CD8 또는 CD14 항체는 또한 다른 공급원으로부터 상업적으로 이용가능 할수 있다(실험 섹션 참조).
C.1.7 중합 항체
중합 다기능성 항체의 제조는 당업계에서 널리 알려져 있다. 적합한 방법은 예를 들어 유럽공개특허 제0957363호에서 설명된다.
C.3 나노입자(라텍스 입자) 및 항체와의 접합체
이러한 나노입자는 세포 표면 마커 M1의 검출에 이용되는 DBC 응집 단계에서 적용된다. 상기 발명에서 사용된 나노입자의 제조를 위한 재료는 임의의 입자 강화 광산란 어세이를 생성하고 수행하기에 적합한 임의의 천연 또는 합성, 무기, 유기, 비-중합체 또는 중합체 재료 일 수 있다. 이러한 재료는 예를 들어 셀레늄, 탄소, 금; 탄소, 규소 또는 게르마늄의 질화물, 예를 들어 Si₃N₄; 철, 티타튬 또는 규소의 산화물, 예를 들어 TiO₂ 또는 SiO₂; 및 예를 들어 폴리스티렌, 폴리(염화 비닐), 에폭시 수지, 폴리(염화 비닐리덴), 폴리(알파-나프틸 메타크리살염), 폴리(비닐나프탈렌), 또는 이들의 공중합체, 특히 스티렌의 공중합체 및 공중합 가능한 에틸렌계 불포화 화합물, 예를 들어 스티렌-(메트)아크릴레이트 공-중합체와 같은 중합체 재료일 수 있다. 또한, 예를 들어 미국공개특허 제4240723호에서 설명한 바와 같이 중합체 재료, 뿐만 아니라 스티렌으로부터 중합된 내부 코어 및 공중합 가능한 에틸렌계 불포화 화합물과 함께 스티렌으로부터의 공중합에 의해 형성된 외부 쉘로 구성된 코어-쉘 입자로 만들어진 입자도 적합하다.
접합을 위한 적합한 중합체 입자는 Bangs Particles Inc. 또는 Interfacial Dynamics Inc, Merck SA, France, 또는 다른 적합한 공급원으로부터 구입할 수 있다. 상기 입자는 항체에 결합시키기 위해 수많은 방법에 따라 활성화시킬수 있고, 이러한 커플링 화학의 철저한 교시는 Bangs Laboratories, Inc.의 웹사이트에서 다운로드 할 수 있는 TechNote 205, Rev. 003, for example March, 2002, “Covalent Coupling”(참조로 포함됨)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 연결은 그들의 표면 카르복시-, 아미노-, 하이드록실-, 하이드라지드- 또는 클로로 메틸기를 지니는 입자에 의해 달성 될 수 있다. 연결되는 분자는 그러한 그룹 또는, 예를 들어 카르보디이미드, 글루타르알데하이드 또는 브롬화시안와 같은 적합한 링커에 의해 직접 반응할 수 있다.
마커(M1)의 검출 목적을 위해 적합한 항 M1-항체와 접합된 나노입자는 형광단 또는 발색단과 같은 검출 가능한 마커의 부착에 의해 추가로 변형될 수 있다. 상응하는 입자를 상업적으로 입수 가능하거나 또는 당업계에서 널리 알려진 적합한 예비 방법에 의해 제조할 수 있다(예: 캐나다 공개특허 제2493309호에 기재된 시아닌 염료 리포터를 이용한 단백질의 부위-특이적 표지; 또는 미국공개특허 제4326008호에 기재된 단백질 표지용 단백질 특이적 형광 미소구체).
C.4 상기 발명의 방법 및 그 기기의 수행
C.4.1 장치
적합한 장치는 Gentian AS에 의한 공동 계류중인 EP 출원(출원 번호 EP16180938.9)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본원에 참조로 인용되어있다.
본 발명의 수직 유동 어세이를 수행하기 위한 간단한 장치의 비-제한적인 실시예는 도 1에서 보여준다. 도 1은 특히 어세이를 수행하는데 요구되는 필터 및 흡수제 재료의 다른 층의 순서를 나타내는 장치의 수직 단면도이다.
상부 사각형 디스크 층(101)에서 중앙 원형 개구부(102)가 제공된다. 상기 사각형 디스크의 하부 표면 아래에, 적합한 기공 크기를 갖는 필터(104)의 원형 조각을, 그 중심은 상기 디스크의 중앙 개구부(102)의 중앙에 있는 상기 디스크 층(101)의 하부 면에 고정하기 위해 접착제의 얇은 층(103)이 제공된다. 상기 접착제 층(103)은 또한 상기 디스크(101)의 하부 면에 상기 디스크(101)과 대략 동일한 크기의 사각 흡수 패드(105)를 고정한다. 상기 디스크(101)의 중앙 개구(102)에, 밑에 있는 필터(104)의 상부에는, 고리(108)에 부착된, 적합한 네트 필터(106)의 디스크가 중앙 개구부 내부에 삽입되고 고리(108)의 상부 면에 고정된 접착 테이프(107)에 의하여 디스크(101)의 상부 면에 제거 가능하게 고정된다. 테이프(107)에서 네트 필터(106) 위에 분석되는 샘플 및 세척 시약을 첨가할 수 있게 중앙 개구부를 형성한다. 샘플 첨가 및 세척이 완료된 후 상기 테이프(107)을 당김으로써 장치로부터 필터(106)를 제거할 수 있다. 나머지 “개방된” 장치에 세척 완충액 및 추가적인 시약을 개구부(102)를 통하여 필터(104) 상으로 직접적으로 첨가할 수 있다. 상기 테스트 결과(예를 들어, 발색 반응)를 시각적으로 조사할 수 있고 상기 개구부(102)를 통해 추가로 분석할 수 있다.
도 2, 3 및 4는 수직 유동 어세이 장치의 또 다른 비-제한척 구현예를 보여준다.
도 2에서 볼 수 있듯이, 상기 어세이 장치는 상부 케이싱 요소(1) 및 하부 케이싱 요소(2)를 포함한다. 상부 케이싱 요소(1)는 도시된 경우에는 샘플 공급 개구인 제1 개구(3) 및 도시된 경우에서 판독 개구(4)인 제2 개구(4)를 갖는다. 상기 상부(1) 및 하부(2) 케이싱 요소는 서로 맨 위에서 조립된다. 상기 상부(1) 및 하부(2) 케이싱 요소를 포함하는 조립체는 편평한 원형 디스크 모양을 갖고, 즉 최종 조립체의 반경은 디스크의 두께보다 크다.
이 구현예의 선택적 변형에서, 카드(10)에는 조립된 어세이 장치가 차지하기에 적합한 개구(10a)가 제공된다. 특히, 카드(10)의 개구(10a)의 모양은 하부 케이싱 요소(2)의 적어도 하나의 부분과 연동하기에 적합한 방식으로 형성된다. 상기 개구(10a)는 또한 하부 케이싱 요소(2)를 제 위치에 유지하고 카드(10)에 대한 회전을 방지하는 데에 적합한 노치를 포함할 수도 있다.
이 구현예의 또 다른 변형에서, 카드(10)상에 설명용 각인 즉, 예를 들어 상술한 바와 같이 기준발색된 스팟과 같은 어세이 장치의 사용을 위한 설명 또는 어세이 장치를 사용한 측정의 정량화를 용이하게 하는 정보가 제공될 수 있다.
도 4를 참고하면, 도 2에 따른 어세이 장치의 단면이 설명된다.
상기 상부(1) 및 하부(2) 케이싱 요소는 서로 마주하여 필수적으로 서로 평행하게 연장되는, 상부(1a) 및 하부(2a) 테스트 구획 내부 표면을 포함한다. 상부(1) 및 하부(2) 케이싱 요소는 또한 테스트 구획이 이들 사이에 형성되는 방식으로 형성된다. 상부(1a) 및 하부(2a) 테스트 구획 내부 표면은 원통형 테스트 구획의 상하 표면을 형성한다.
상기 테스트 구획은 서로의 맨 위에 배열되고 상부(1a) 및 하부(2a) 테스트 구획 내부 표면에 필수적으로 평행하게 연장된 상부 막층(6) 및 하부 흡수층(7)이 제공된다. 이 구현예에서, 상기 테스트 구획은 상부 막층(6) 및 하부 흡수층(7), 즉 형태-고정(form-locking) 방식으로 삽입된 상기 층들에 의해 필수적으로 채워진다. 추가의 구현예에서, 하부 테스트 구획에 형태-고정 방식으로 여전히 삽입된 반면에 상부 막층(6)은 상부 테스트 구획 내부 표면(1a)로부터 이격된다.
제2, 하부 테스트 챔버 내부 표면(2a)은 이의 이동성을 제한함으로서 하부 흡수층(7)이 제 위치에 유지하기 위해, 특히 어세이 과정 동안 어세이 장치의 회전 운동시의 임의의 이동성을 억제하고, 특히 테스트 구획 내부의 회전 운동을 완전히 피하기 위해 적합한 돌출부(2b)를 제공한다. 상기 발명의 다른 구현예에서, 상기 돌출부(2b)는 추가로 테스트 구획 내로 연장되고 또한 이는 상기 상부 막층(6)이 제 위치에 유지하기 위해 적합하다. 다른 구현예에서, 하부 흡수층 및/또는 상부 막 층은 대안적으로 또는 추가적으로, 예를 들어 접착제에 의한 다른 부착 수단에 의해 제 위치에 유지된다.
상기 조립체는 추가로 상기 도시된 구현예에서 제1 개구(3) 바로 아래 상부 테스트 구획 내부 표면(1a)의 리세션(5a) 내부에 배열되는 필터층(5)을 포함한다. 상기 필터층(5)은 상부 케이싱 요소(1)에 부착되고, 특히 상기 상부 케이싱 요소(1)에 대한 이동을 제한하기 위해 부착된다. 도시된 경우에, 상기 필터(5)는 상부 케이싱 요소(1)에 접착되어 제1 개구(3)는 테스트 구획을 향하는 면이 덮어지도록 한다.
이 구현예에서, 상부 케이싱 요소(1)의 제2 개구(4)는 주로 판독 개구(4)로 작용하며, 상기 제2 개구는 상부 케이싱 요소(1)를 통해 외부로부터 테스트 구획으로의 직접적인 광학 접근 및 상부 막 층(6)의 장애물 없는 시야를 제공한다. 제2 개구는 또한 상기 막층(6)의 표면 상에 유지된 피분석물(특정 혈액 세포와 같이)을 지니는 막층 상에 시약 용액 및 세척 용액을 첨가하기 위해 사용된다.
이 구현예에서, 상기 하부 흡수층(7)은 하부 분자 물질 및 상부 막(6)에 의해 유지되지 않은 액체를 흡수하기 위한 흡수 재료를 포함한다. 상기 상부 막층(6)은 피분석물, 특히 상기 세포, 또는 바람직하게는 상기 세포 표면상에 피분석물을 지니는 것으로 의심되는 특정 혈액 세포를 유지하는 반-투과성 막을 포함한다. 또한, 상기 필터층(5)은 상부 막의 표면 상의 분석 검출 반응을 최종적으로 수행하기 전에 제거되어야 하는 혈액 세포의 더 큰 응집체를 유지하는 반면, 비-응집된 혈액 세포 및 더 작은 샘플의 성분을 투과할 수 있는 반투과성막 또는 바람직하게는 그리드를 포함한다.
상기 상부(1) 및 하부(2) 케이싱 요소의 조립체는 상부 케이싱 요소(1)가 하부 케이싱 요소(2)의 부분을 차지하는 연동 메커니즘을 포함한다. 상부(1) 및 하부(2) 케이싱 요소의 연동 부분의 원형으로 인해, 상부 및 하부 케이싱 요소 (2)는 서로에 대해 회전될 수 있으며, 회전 각도는 두 개의 케이싱 요소(1, 2) 서로의 위치를 정의한다. 걸쇠(latch)(12)는 상기 하부 케이싱 요소(2)의 연동 부분상에 제공되고, 이는 상부(1) 및 하부(2) 케이싱 요소의 조립체를 제 위치에 단단히 유지시키고 케이싱 요소(1, 2) 서로의 상대적인 운동을 위한 회전 자유도만을 필수적으로 남겨두기에 적합하다.
또한, 걸쇠(13)는 도 3에서 보여준 바와 같은 카드(1)의 개구(10a)과 연동하는 하부 케이싱 요소(2)의 일부 상에 제공된다.
상기 걸쇠(12, 13)를 당업자라면 이해할 수 있는, 다른 방식으로 형성할 수 있다. 또한, 하부 케이싱 요소의 상기 걸쇠(12)에 상응하는 상부 케이싱 요소(1)에 대응하는 홈(groove)이 형성된다. 하부 케이싱 요소(2)와 연동 작용을 용이하게 하기 위해 카드(10)에 유사한 구조를 형성할 수 있다.
도 5에서 어세이 장치의 또다른 비-제한적 구현예의 상면도를 도시한다. 어세이 장치의 구성은 도 2 내지 도 4를 참조하여 전술한 구조와 유사하다.
간소화 목적을 위해, 회전 정지부(22)를 제외한 하부 케이싱 요소(2)는 도 5에서 도시하지 않았다. 상부 케이싱 요소(1)는 제1 및 제2 구성 각각에서 하부 케이싱 요소(2)의 회전 정지부(22)와 맞물리게 하는 2개의 회전 정지부(21)가 제공된다. 여기서, 어세이 장치의 상기 제1 구성은 보여지고 상기 제2 구성은 상부 케이싱 요소(1)를 하부 케이싱 요소(2)에 대해 반시계 방향으로 회전 정지부(21, 22)에 의해 한정된 제2 극단 회전 각도를 향해 회전시킴으로써 이를 수 있다.
제1(3, 3') 및 제2(4, 4') 개구의 제1(3, 4) 및 제2(3', 4') 쌍은 상부 케이싱 요소(1)에서 형성되고, 상기 제1 개구(3, 3')는 각각의 둘레 주위에서 릿지(3a, 3a')가 제공된다. 또한, 상부 케이싱 요소(1)의 바닥면 상의 제1 개구(3, 3')를 가로질러 연장하는 필터층 (5, 5')은 제1 개구(3, 3') 내부에 해칭으로 보여진다. 개구 쌍[(3, 4), (3', 4')]은 제2 구성 내에서(회전 후에) 이의 회전 정지부(22)로 표현되는, 하부 케이싱 요소에 대한 제2 개구(4, 4')의 위치는 상기 제1 구성에서의 제1 개구(3, 3')의 위치와 필수적으로 동일하게 하는 방식으로 배열된다.
또한, 상기 표지(11)는 상부 케이싱 요소(1)의 상부 표면 상에 배열되고 설명용 각인(11b)은 어세이 장치의 사용자에게 보인다. 또한, 제2 개구(4, 4') 주위의 표지(11)에는 원주형 각인(4a, 4a')이 제공된다. 원주형 각인(4a, 4a')의 다른 해칭은 발색의 차이를 나타내는데, 이는 예를 들어 사용자가 개별적인 제2 개구(4, 4')를 서로 쉽게 구별하도록 돕거나 어세이의 비색 판독값의 해석을 위한 기준 색상을 제공한다.
C.4.2 상기 발명의 어세이 방법의 수행
C.4.2.1 CD4 분석
이 구현예는 CD4+ 림프구, 특히 특정 T 도움 세포 상의 CD4 수용체의 분석을 의미한다.
상기 발명의 상기 구현예에서, 표지된 항체는 CD4 수용체에 대해 반응성이 있고, 상기 표지는 효소 또는 발색 또는 형광 입자에 의해 구성된다. 만약 효소가 표지로 사용된 경우, 바람직한 구현예는 발색된 물질, 우선적으로 침전된 발색된 물질, 바람직하게는 침전된 발색된 물질을 형성하는 기질의 상기 필터에 후속 노출하는 것을 특징으로 한다.
상기 발명의 방법에서 생성된 발색 또는 형광과 수용체 분자의 상기 클래스의 농도와의 상호비교는 다음과 같이 수행될 수 있다: 결합된 발색된 입자의 양은 테스트되는 샘플 내에 존재하는 상기 특이적 수용체 분자의 양과 관련되기 때문에, 상기 특이적 수용체 분자의 양과 측정되는 색상은 직접적인 관계가 있다. 사전-평가된, 사전-교정된 및/또는 사전결정된 색상표와의 비교 또는 본 발명을 위해 표시되거나 개발된 자유롭게 이용 가능한 전자 색상 검출기에 의해 색상의 양을 측정에 의해 시각적으로 검출될 수 있다.
사용된 측정 기기는 사용된 발색 물질 또는 면역 입자, 색상 배열 및 검출 범위에 맞게 쉽게 교정 및 조정된다. 검출 기기의 교정에서 알려진 양의 피분석물이 사용되어 배경 대 신호의 우수한 비율을 제공하고, 사용자에게 정확한 계산된 판독값을 제공할 수 있다.
만약 발색 또는 형광 물질 대신에 효소(이에 제한되는 것은 아니나 퍼옥시다제 효소 또는 알칼리성 포스파타제를 포함한다)가 사용되는 경우, 상기 효모에 대한 발색 생성 또는 형광 생성 기질이 사용된다. 2개 이상의 파장에서의 반사율의 측정에 의해 필터 상에 증착된 다른 색을 갖는 2개의 성분의 측정은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이것은 이미 Frank Frantzen 등에 의한 Clinical Chemistry 43:12 2390 -2396 (1997), “Glycohemoglobin filter assay for doctors' offices based on boronic acid affinity principle”, Erling Sundrehagen 및 Frank Frantzen에 의한 US 5,702,952; 및 Sundrehagen 및 Frantzen에 의한 US 5,506,144에서 설명된다. Frantzen 등은 620 및 470nm에서 반사율(% R)을 측정하는 전문적인 반사계를 사용했다. 청색-발색된 붕산 접합체 및 적색 헤모글로빈(Hb)을 각각 정량화하기 위해 이 파장에서의 측정을 사용했다. 이 기기는 기록된 반사율 데이터를 선형화하기 위해 Kubelka-Munk 변환(Kubelka P. New contributions to the optics of intensely light scattering materials. J Opt Soc Am 1948;38:448-57)을 자동으로 수행하였다. "휴대용 고속 진단 테스트 판독기"는 EP 2 812 675에서 설명되고 "이동 전화상의 분광 센서"는 US 2006/0279732에 설명된다. 오늘날 휴대 전화의 카메라 기능은 진단 의학에서 필터 기반 테스트 장치의 반사 측정을 위해 일반적으로 사용된다.
이러한 시스템은 또한 Sundrehagen 및 Bremnes에 의한 EP 0 953 149 (B1)에 설명되어 있다. 오늘날 많은 회사들은 진단 장치 상의 테스트 스팟으로부터 반사광의 강도 및 파장을 측정하기 위해, 반사광의 강도와 파장으로부터 샘플의 농도를 계산하기 위한 교정 소프트웨어를 포함하는 반사측정 스캐닝 기기 또는 디지털 카메라 이미징 소프트웨어를 제공한다. Scansmart 시스템(Skannex AS, Oslo, Norway)은 이 적용을 위한 자동화된 전용 시스템의 예이고, 이는 노르웨이의 고객에게 수직 유동 테스트를 위한 반사측정 스팟 강도의 측정을 위해 판매되었다. 또한 디지털 카메라가 장착된 표준 “스마트폰”은 획득한 색상 신호의 디지털 이미지를 얻기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 디지털 이미지는 Adobe Photoshop 전자 프로그램으로 업로드된다. 이 방법은 결과의 그래픽 설명을 가능하게 한다. 또한 이 방법은 신호가 가장 강한 때 대 배경이 가장 낮을 때의 결정을 가능하게 한다. 신호의 표준화 또는 교정은 측정되는 피분석물의 잘 알려진 강도 및 농도를 갖는 기준 스팟을 이용하여 얻을 수 있다.
만약 효소 발색 시스템 생성이 사용된다면, 동역학 측정이 이용될 수 있고, 상기 측정은 “비디오” 모드를 사용하여 수행할 수 있다. HSL; 및 적색, 녹색 및 청색; 및 다른 색상 체계를 결정하기 위한 소프트웨어 Adobe Photoshop Elements 13ⓒ 및 프로그램 “Eyedropper tool”는 업로드된 이미지의 색상을 결정한다. 상기 HSL (색조, 채도 및 밝기) 체계는 색상을 설명하는 장치 독립적인 방법을 제공한다. 특히 인터넷 상의 http://www.handprint.com/LS/CVS/color.html (2015년 7 월)은 유익하다.
본 발명의 특별한 구현예에서, 기준 발색 스팟들은 고정화된 항체 또는 결합 분자 또는 그의 단편을 갖는 막에 근접하여 배치되거나 고정되고, 우선적으로 어세이 막의 홀더 상에 고정된다. 본 발명의 어세이의 측정의 일부로서, 이들 기준 스팟도 마찬가지로 측정된다. 측정 기기의 소프트웨어에 의한 기준 스팟의 측정을 어세이의 전반적인 정확도를 높이기 위해, 기기와 기기 사이 및 다른 하드웨어의 변형을 보정하기 위해 사용할 수 있다.
이 기준 스팟들은 분석적 측정에서 각 색상에 대한 색상 기준을 정의할 수 있다. 상기 기기(예를들어, 이동 전화의 카메라)로 측정되는 표면 및 장치 상의 기준 스팟을 한 장 또는 연속적으로 사진을 찍는다. 다른 소프트웨어 프로그램은 측정된 픽셀을 숫자값으로 전환시킬 수 있고 다른 숫자 시스템에서 색 공간을 정의 할 수 있다. RGB(적색, 녹색, 청색) 색 공간은 매우 일반적이다. RGB 색상 모델은 넓은 범위의 색상을 재현하기 위해 다양한 방법으로 적색광, 녹색광 및 청색광을 함께 추가하는 부가 색상 모델이다. 상기 모델의 이름은 적색, 녹색 및 청색의 3가지 부가 원색의 머리 글자에서 비롯된다((Wikipedia 16 July 2016).
HSL 및 HSV는 RGB 색상 모델에서 가장 일반적인 2가지의 점의 원통형-좌표 표현이다. 상기 2가지의 표현은 직교 (입방체) 표현보다 더 직관적이고 지각적으로 연관되도록 하기 위하여 RGB의 기하학적 구조를 재배열한다. 1970년대 컴퓨터 그래픽 응용 프로그램용으로 개발된, HSL 및 HSV는 오늘날 색상 선택기, 이미지 편집 소프트웨어에서 사용되고 덜 일반적으로 이미지 분석 및 컴퓨터 비전에서 사용된다.
오늘날 색상 스팟을 측정하고 분석하며 색 공간에서 그들의 숫자값을 제공하기 위해 사용된 매우 현대적이고 무료인 소프트웨어 패키지는 GIMP이다. GIMP / gimp / (GNU Image Manipulation Program)는 이미지 수정 및 편집, 자유 형식 그리기, 크기 조정, 자르기, 사진 짜집기, 다른 이미지 형식간의 변환 및 보다 전문화된 작업에 사용되는 무료 오픈-소스 래스터 그래픽 편집기이다. 모든 특성을 설명하는 www.gimp.org를 참조하라.
상기 결과는 부피 단위 당 CD4-림프구 및 CD8-림프구의 수 및/또는 상기 두 수 사이의 비율로 보고된다.
상기 CD4 분석은 도 1에 도시된 간단한 장치로 다음과 같이 수행할 수 있다:
1. 전혈 샘플을 백혈구를 용해시키지 않으면서 샘플에 함유되어 있는 적혈구의 저삼투성 분해에 맞춰진 희석 완충액과 혼합하였다. 상기 희석 완충액은 또한 CD14 단핵 세포를 응집하기 위해 적합한 형태로 항 CD14 항체를 함유하였다.
2. 짧은 시간동안 배양한 후 상기 혼합물의 분액을 도 1의 장치의 개구부(102)로 옮기고, 이를 즉시 상기 개구부에 삽입된 거친 (나일론 메쉬) 필터(106)로 빨아들이고 CD4+ T 도움 세포를 통과시키는 반면 응집된 CD14 세포는 유지하였다.
3. 그 후, 세척 용액을 여과 장치의 개구부(102)로 옮기고 나일론 메쉬 필터(106) 및 106의 아래에 위치한 필터(104)로 빨아들였다.
4. 그 후, 상기 나일론 메쉬 필터(106)를 장치에서 제거했다.
5. 그 후, 검출 가능한 마커(효소, 발색된 입자와 같은)를 갖는 항-인간 CD4 수용체 항체의 용액을 여과 장치의 개구부(102)로 옮기로 상기 필터(104)로 빨아들였다. 상기 필터(104)로 용액을 빨아들인 후에 상기 항체-접합체를 필터(104) 상에 유지된 상기 세포와 결합하게 했다.
6. 그 후, 세척 용액을 여과 장치의 개구(102)로 옮기고, 상기 필터(104)로 빨아들였다.
7. 그 후, 만약 마커로서 효소를 사용한 경우, 상응하는 기질을 여과 장치의 개구(102)로 옮기고 상기 필터(104)로 빨아들였다.
8. 정해진 시간(예를 들어 5분)이 지난 후, 발색된 색상을 예를 들어, Skannex AS, Norway에서 배포된 소프트웨어를 갖는 SkanSmart CE 판독기를 사용하여 반사광 측정으로 측정하였다.
9. 상기 판독값을 CD4+ 림프구의 공지된 함량을 갖는 교정 샘플에 의해 생성된 소프트웨어에 저장된 교정 곡선과 비교하고, 동일한 실험에서 분석하고, CD4+ 림프구의 함량을 계산하였다.
상기 CD4 분석은 도 2, 3, 및 4에 도시된 더 진보한 장치로 다음과 같이 수행할 수 있다:
1. 전혈 샘플을 백혈구를 용해시키지 않으면서 샘플에 함유되어 있는 적혈구의 저삼투성 분해에 맞춰진 희석 완충액과 혼합하였다. 상기 희석 완충액은 또한 CD14 단핵 세포를 응집하기 위해 적합한 형태로 항 CD14 항체를 함유하였다.
2. 짧은 시간동안 배양한 후 상기 혼합물의 분액을 도 4의 장치의 개구부(3)로 옮기고, 이를 즉시 상기 개구부(3) 밑에 위치한 거친 (나일론 메쉬) 필터(5)로 빨아들이고 다음 필터층(6)의 표면에 유지될 것인 CD4+ T 도움 세포를 통과시키는 반면 응집된 CD14 세포는 유지하였다.
3. 그 후, 세척 용액을 여과 장치의 개구부(3)로 옮기고 나일론 메쉬 필터(5), 및 상기 필터(6)로 빨아들였다.
4. 그 후, 개구(4)가 현재 정확히 상기 필터(6)(즉, 상기 CD4+ 도움 세포가 상기 필터 상에 흡착된 필터 섹션)에 대한 개구(3)의 이전 위치와 일치하도록 장치의 상부 케이싱 요소(1)을 비틀어서(약 180도의 각도로 회전) 상기 나일론 메쉬 필터(5)를 제거하였다.
5. 그 후, 검출 가능한 마커(효소, 발색된 입자와 같은)를 갖는 항-인간 CD4 수용체 항체의 용액을 여과 장치의 개구부(4)로 옮기로 상기 필터(6)로 빨아들였다. 상기 필터(6)로 용액을 빨아들인 후에 상기 항체-접합체를 필터(6) 상에 유지된 상기 세포와 결합하게 했다.
6. 그 후, 세척 용액을 여과 장치의 개구(4)로 옮기고, 상기 필터(6)로 빨아들였다.
7. 그 후, 만약 마커로서 효소를 사용한 경우, 상응하는 기질을 여과 장치의 개구(4)로 옮기고 상기 필터(6)로 빨아들였다.
8. 정해진 시간(예를 들어 5분)이 지난 후, 발색된 색상을 예를 들어, Skannex AS, Norway에서 배포된 소프트웨어를 갖는 SkanSmart CE 판독기를 사용하여 반사광 측정으로 측정하였다.
9. 상기 판독값을 T-세포 관련된 CD4 수용체 분자의 공지된 함량을 갖는 교정 샘플에 의해 생성된 소프트웨어에 저장된 교정 곡선과 비교하고, 동일한 실험에서 분석하고, T-세포 관련된 CD4 수용체 분자의 함량을 계산하였다.
만약 상기 검출 가능한 마커가 예를 들어 발색된 입자라면, 단계 7 및 단계 8에 따른 색상 발색은 필요치 않은 과정이다.
도 2, 3, 및 4에 도시된 더 진보된 장치로 설명된 CD4 분석은 2개의 혈액 샘플을 동시에 분석할 수있는 도 5에 도시된 장치로도 유사하게 수행할 수 있다. 상기 상부 케이싱 요소(1)의 회전 각도는 이 경우에는 약 90도이다.
C.4.2.2 CD4 및 CD8 분석
도 1의 장치 또는 도 2 내지 4에서 도시된 장치를 이용하여 상기 전술한 상기 CD4 분석과 유사하게 다음 단계가 포함된 상기 분석을 수행할 수 있다:
단계 1 내지 4 및 6은 동일한 방법으로 수행한다.
단계 5에서 다르고, 예를 들어 다른 색의 라텍스 입자(적색 카르복시화 라텍스 및 청색 카르복시화 라텍스와 같은)와 같이 구별할 수 있는 마커에 접합된 각각의 항-CD4 항체 및 항-CD8 항체 현탁액을 상기 장치로 옮기고 상기 필터로 빨아들였다.
그 후 즉시, 표준 애플 아이폰 및 이의 내장된 플래시를 이용한 반사광 측정으로 상기 필터(104 또는 6)의 색상을 측정하였다. 동시에 라텍스 입자의 색상에 따라 2개의 예의 적색 점(약함 및 강함) 및 2개의 예의 청색 점(약함 및 강함) 또한 장치의 상부에 배치된 것을 묘사하였다. 5개의 스팟 모두에 대해, 획득한 BGR 파일(상기 참조)을 사용하여(파일을 회색조로 변환하여) 점의 위치 및 한계를 결정하였다. GIMP(상기 참조) 프로그램에 의해, 모든 픽셀은 HSV 색상값으로 변환되었다. 2개의 청색 점에 대한 최대 및 최소 응답은 청색 색 공간에서 정의하고, 2개의 적색 점에 대한 최대 및 최소 응답은 적색 색 공간에서 정의한다.
상기 테스트 스팟(적색 및 청색 입자 둘 다)으로부터의 상기 HSV 값은 적색 및 청색 HSV 색 공간에서 보정되고, 모든 픽셀에 대한 HSV 값은 계산되고 표준화된다.
상기 획득한 표준화 값을 알려진 CD4 및 CD8 양성 림프구의 교정 샘플로부터 획득한 값과 비교하고(예를 들어 종래의 Becton Dickinson Excalibur 유세포 분석 시스템으로 분석되었다), 이는 아이폰 시스템 내의 컴퓨터의 교정 파일에 저장되었고, 상기 결과는 디스플레이 및 전차 출력으로 보고되었다. 상기 결과는 부피 단위 당 CD4-림프구 수 및 부피 단위 당 CD8-림프구의 수 및 상기 두 수 사이의 비율로 보고된다.
도 2, 3 및 4에 도시된 바와 같이 보다 진보된 장치에 대해 전술한 바와 같은 CD4 및 CD8 분석을 도 5에 도시된 장치로 또한 수행할 수 있으며, 하나는 CD4이고 다른 하나는 CD8인, 2개의 혈액 샘플을 다른 쌍의 개구[(3, 4) 및 (3', 4')]으로 동시에 분석할 수 있다. 상부 케이싱 요소(1)의 회전 각도는 이 경우 약 90도 이다.
1. 전혈 샘플을 백혈구를 용해시키지 않으면서 샘플에 함유되어 있는 적혈구의 저삼투성 분해에 맞춰진 희석 완충액과 혼합하였다. 상기 희석 완충액은 또한 CD14 단핵 세포을 응집하기 위해 적합한 형태로 항 CD14 항체를 함유하였다.
2. 짧은 시간동안 배양한 후 상기 혼합물의 분액을 도 4의 장치의 개구부(3 및 3')로 옮기고, 이를 즉시 상기 개구부(3, 3') 밑에 위치한 거친 (나일론 메쉬) 필터(5)로 빨아들이고 다음 필터층(6)의 표면에 유지될 것인 CD4+ T 도움 세포를 통과시키는 반면 응집된 CD14 세포는 유지하였다(CD8 분석에 관해서 CD14 세포는 어세이를 방해하지 않을 것이고 필터(5)는 CD8 샘플 개구를 위해 생략될 수 있다).
3. 그 후, 세척 용액을 여과 장치의 개구부(4, 4')로 옮기고 나일론 메쉬 필터(5), 및 상기 필터(6)로 빨아들였다.
4. 그 후, 개구(4, 4')가 현재 정확히 상기 필터(6)(즉, 상기 CD4+ 도움 세포가 상기 필터 상에 흡수된 필터 섹션)에 대한 개구(3, 3')의 이전 위치와 일치하도록 장치의 상부 케이싱 요소(1)을 비틀어서(약 90도의 각도로 회전) 상기 나일론 메쉬 필터(5)를 제거하였다.
5. 그 후, 검출 가능한 마커(제1 발색 또는 효소의 면역입자 같은)를 갖는 항-인간 CD4 수용체 항체의 용액을 여과 장치의 개구부(4)로 옮기고 검출 가능한 마커(제2 발색 또는 효소의 면역입자 같은)를 갖는 항-인간 CD8 수용체 항체의 용액을 여과 장치의 개구부(4')로 옮기고; 각 액체를 상기 필터(6)로 빨아들였다. 상기 필터(6)로 용액을 빨아들인 후에 상기 항체-접합체를 상기 2개의 다른 스팟에서 필터(6) 상에 유지된 상기 세포와 결합하게 했다.
6. 그 후, 세척 용액을 여과 장치의 개구(4 및 4')로 옮기고, 상기 필터(6)로 빨아들였다.
추가적인 단계(효소가 마커인 경우 발색 단계) 및 발색된 스팟의 측정은 전술한 바와 같이 수행할 수 있다.
하기 비 제한적인 실시예는 본 발명을 추가로 설명한다. 상기 교시에 기초하여, 당업자는 과도한 실험 또는 진보적 노력을 필요로 하지 않고, 본 발명의 다른 실시예들을 제공 할 수 있을 것이다.

A. 재료 및 방법

달리 언급하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 시약 및 화합물은 분석용 등급이다.

B. 실시예

실시예 1: 평균 기공 크기가 3, 5 및 8μm인 니트로셀룰로오스 필터 및 평균 기공 크기가 30μm인 나일론 네트 필터의 제조.

Whatman 니트로셀룰로오스 필터 [3μm 크기의 기공(cat no. 7193-002), 5μm 크기의 기공(cat no. 7195-004) 및 8μm 크기의 기공(cat no.10400112)] 및 Millipore 나일론 네트 필터(Prod. No. NY3002500)를 1% 소혈청 알부민 수용액에서 4시간 동안 실온에서 침지시켰다. 상기 블락킹 과정은 추후 수직 여과 장치에서 사용될 때 필터에, 단백질 및 세포가 비특이적 결합하는 것을 피하기 위해 수행하였다. 상기 나일론 네트 필터는 푹신한 재료이기 때문에, 바람직하게 나일론 네트 필터는 폴리스티렌 또는 다른 뻣뻣한 재료의 고리에 의해 주변부를 지지할 수 있다. 상기 뻣뻣한 재료는 고리와 나일론 네트 필터(하기의 실시예 7에서 묘사된 도 1의 필터(106) 및 고리(108) 참조) 사이로 액체가 새어 나오지 않도록, 나일론 네트 필터에 접착제(예, 예를 들어 Clearsol Casco)로 접착하거나 녹여야 한다.

실시예 2: 계란으로부터 다중클론 항체 항-인간 CD14 수용체 항체의 제조

Novoprotein Inc, US로부터 맞춤 제작한 하기의 아미노산 서열을 갖는(서열번호 1), 인간 CD14 수용체를 프로인트 완전 항원보강제(Freund's complete adjuvants: FCA)에 현탁하였다.

MNHKV HMELDDEDFR CVCNFSEPQP DWSEAFQCVS AVEVEIHAGG LNLEPFLKRV 61

DADADPRQYA DTVKALRVRR LTVGAAQVPA QLLVGALRVL AYSRLKELTL EDLKITGTMP 121

PLPLEATGLA LSSLRLRNVS WATGRSWLAE LQQWLKPGLK VLSIAQAHSP AFSCEQVRAF 181

PALTSLDLSD NPGLGERGLM AALCPHKFPA IQNLALRNTG METPTGVCAA LAAAGVQPHS 241

LDLSHNSLRA TVNPSAPRCM WSSALNSLNL SFAGLEQVPK GLPAKLRVLD LSCNRLNRAP 301

QPDELPEVDN LTLDGNPFLV PG

다중클론 항 인간 CD14 항체를 예를 들어, Chase, M. W., 1967, in "Methods of Immunology and Immunochemistry", ed. Williams, A. et al., M. W., pp. 197-209, Academic Press, New York에서 기술된 바와 같이 당업계에서 잘 알려진 방법으로 제조할 수 있다. 간략하게, 적합한 종(예를 들어 토끼, 염소, 또는 양, 또는, 바람직하게는 조류, 특히 닭과 같은 가금류)의 동물을 반복적으로 적절한 보강제, 예를 들어 프로인트 완전 또는 불완전 항원보강제에서 정제된 항원으로 면역화시켰다. 면역화 후에 상기 동물의 피를 뽑아서 다중클론 항체를 예를 들어, 황산 암모늄 또는 염화 암모늄 침전법, 음이온 교환 크로마토그래피, 면역 친화성 크로마토 그래피, 및/또는 친화성 크로마토그래피와 같은 방법으로 정제하였다.

다중클론 조류 항체는 일반적으로 난황으로부터 얻는다(따라서, IgYs로 지칭됨). 그러나, 난황에는 많은 양의 지질을 포함하여, 그들의 추가적인 사용에는 문제가 있다. 난황으로부터 IgY는 황산 암모늄(예를 들어, 25 내지 40%) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전을 순차적으로 이용하여 분리할 수 있다. 초기 정제를 위해 Gallus Immunotch Inc, Cary, USA로부터 상업적으로 얻을 수 있는 IgY 정제 키트 또는 Pierce, Rockford, USA로부터 상업적으로 얻을 수 있는 Eggcellent Chicken IgY 정제 키트를 제조업체의 지침을 고려하여 이용할 수 있다.

또한, 예를 들어, www.piercenet.com으로부터 다운로드 한 “Affinity Purification of Proteins”(2006년, 4월)에서의 지시에 따른 항원 친화성 정제 방법을 사용하여 정제된 항체를 사용하여 다증클론 항체의 결합력을 추가적으로 증가시킬 수 있고, 상기 친화성 정제는 하기에서 더 자세히 설명된다.

각 면역실험 마다 2 내지 4마리의 암탉을 사용했다. 1ml의 물에 용해된 0.1mg 펩타이드를 동등한 부피의 프로이트 완전 항원보강제로 유화시키고 암탉의 가슴 근육에 주사하였다. 상기 주사는 4주마다 반복하였다. 주사 시작으로부터 10주 후 계란을 수집했다. 상기 난황을 계란으로부터 분리하고, 당업계의 계란 항체 분리방법에 따른 통상적인 방법(예를 들어, Larsson A, Baaloew R-M, Lindahl T, and Forsberg P-O in Poultry Science 72:1807-1812, 1993)에 따라, 염화암모늄 침전에 의해 난황으로부터 IgY 분획을 분리하였다.

추가적인 면역은 매 4주마다 수행하였다. 10주 후, 계란을 수집하고, 난황을 계란 흰자로부터 수동으로 분리하였다. 당업계의 계란 항체 분리방법에 따른 통상적인 방법(예를 들어 Larsson A, Baaloew R-M, Lindahl T, and Forsberg P-O in Poultry Science 72:1807-1812, 1993)에 따라, 염화암모늄 침전에 의해 난황으로부터 전체 항체 분획을 분리하였다.

고순도 인간 CD14 수용체 10mg을 칼럼의 패키지 삽입물에 있는 지시에 따라, Amersham Pharmacia Biotech의 HITRAP NHS-Active HP 컬럼에 고정시켰다. 난황으로부터 분리된 IgY 분획을 인산 완충 식염수에 2mg/ml로 희석하였다. 상기 IgY 용액 200ml를 칼럼에 통과시키고, IgY가 없는 인산 완충 식염수 50ml를 통과시켰다. 고정된 CD14 수용체에 대해 특이적인 친화성을 갖는 항체를 pH=3.0의 0.1M 시트르산 완충액 35ml로 용출시켰다. 상기 용출된 특이적 항-CD14 항체는 인산 완충 식염수에 대해 투석하고 30.000Dalton 분자량의 컷-오프를 갖는 Amicon Centricon 원심분리 여과 장치를 이용하여 3mg/ml로 농축시켰다.

실시예 3a: 카르복시화 폴리스티렌 입자에 대한 항-인간 CD14 항체의 접합

1μm 카르복시화 폴리스티렌 입자(product no. PC04N/10356)를 미국 Bangs Particles, USA에서 구입했다. 상기 실시예 2에 따라 제조된 닭 항-인간 CD14 항체 31mg을 20 ㎖ 완충액(pH = 9.5, 5 mM 붕산염, 7.5 mM 염화나트륨)으로 투석 하였다. 상기 카르복시화 폴리스티렌 입자 300mg을 원심분리하여 세척하고 물 20ml로 현탁하였다. 12.5mg EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) (Sigma, US)를 상기 입자 현탁액에 용해시켰다. 상기 항체 용액을 라텍스 현탁액에 첨가하고, 5시간 동안 교반하였다. 상기 현탁액의 입자를 1 mM NaCl, 0.5 mM 붕산나트륨, 0.025 % Tween 20, 0.5 mM 글리신, pH = 9.5로 4번 세척하였다. 상기 모액을 30mM 붕산염 완충액(pH 9,1-9.3, 150mM 염화나트륨, 0.1% Tween 20, 0.5mg/ml 돼지 혈청 알부민(porcine serum albumin: PSA) 및 0.1% ProClinTM 950 살생물제)에 1:3으로 희석하였다.

실시예 3b: 항-CD14 항체의 중합

상기 실시예 2에서 설명한 바와 같이 제조된, 항 CD14 IgY 항체 10mg을 실온에서 교반하면서 4mg 디티오비스(설포숙시니미딜 프로피오네이트)(Pierce Corp에서 제조됨, 이하 DTSSP)의 PBS 용액 1ml에 한방울씩 첨가하였다. 상기 혼합된 용액을 35°C에서 30분 동안 교반한 후, 상기 혼합된 용액을 세파로오스 겔(Pharmacia Fine Chemical Inc에서 제조됨, 세파덱스 G25M 칼럼)을 통해 여과하였다. 이로써 IgY 중합체(이하, IgYagg)를 함유하는 PBS 용액 약 6ml를 얻었다. 상기 과정은 유럽공개특허 제0957636호에서 설명한 중합 과정과 유사하다.

실시예 3c: 세파로오스 입자에 연결된 단일클론 항-CD14 항체

단일클론 항-인간 CD14 항체 10mg(마우스 기원) (product no. 3110, Diatec Inc., Oslo, Norway)를 0.2M 탄산수소나트륨, 0.5M 염화나트륨 pH 7.9에 대해 투석하였다. Norwegian Antibodies Inc., Norway로부터의 난 알부민 37.5mg을 0.2M 탄산수소나트륨, 0.5M 염화나트륨 pH 7.9에 대해 투석하였다.

6ml의 NHS-활성화 세파로스(product no. 17-0906-01, GE Health Care Life Sciences)를 1mM HCl로 세척하고, 정치시킨 후, 정제된 물로 3회 세척하였다.

투석된 난 알부민 12.5mg과 투석된 항-인간 CD14 10mg을 혼합한 후, 6 ㎖의 NHS-활성화 세파로스와 혼합하였다. 상기 현탁액을 실온에서 4시간 동안 휘저었다. 그리고 나머지 25mg의 투석된 알부민을 첨가한 후, 상기 현탁액을 실온에서 4시간 더 휘저었다. 상기 세파로스를 정치키시고 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5, 0.15 M NaCl로 3번 세척하였다. 결국, 연결된 세파로스의 부피는 20ml이었다.

실시예 4a: 항-CD14 항체를 포함하는 샘플 희석 완충액

백혈구의 용해 없이 적혈구의 저삼투성 용해를 위해 10mM NaCl, 0.5mg/mL BSA 및 0.1% proclin, pH 7.5 완충액을 사용하였다.

본 발명의 방법을 이용하여 CD4 수용체에 대해 분석되는 전혈의 부피 내의 모든 단핵 세포를 결합 및 응집하기에 충분한 양으로 상기 완충액 용액에 상기 실시예 2에 따라 제조된 항-CD14 항체를 첨가하였다. 예를 들어, 만약 20μl 전혈을 분석한다면, 400 μl 부피의 샘플 희석 완충액을 이용하고, 20μl 혈액의 모든 단핵 세포에 결합하는 항-CD14 항체의 양이 400 μl의 샘플 희석 완충액에 존재하여야 한다. 필요한 양의 적정은 400 μl의 샘플 희석 완충액내에 상기 항체의 희석 시리즈를 설정하고, 다음 방법을 이용하여 테스트할 수 있다.

용혈 용액에 존재하거나 첨가되는 항-CD14의 양이 혼합물 내의 모든 CD14 분자를 결합시키는데 충분한지를 확인하기 위해 사용되는 방법은 하기 단계를 포함한다.

1. 알려진 많은 양의 단핵세포 및 CD14 수용체를 갖는 20μl의 전혈과 pH=7.5를 갖는 10 mM NaCl, 0.5 mg/ml 소혈청 알부민이 포함된 400ul 용액을 혼합하고 실시예 2에 따라 제조된 항-CD14 항체를 포함하여 용해 완충액을 만든다. 포함된 항-CD14 항체의 양은 하기 설명에 따라 다양하다.

2. 120분 동안 상기 혼합물을 휘젓는다.

3. 상기 혼합물을 실시예 1에 따라 Millipore 나일론 네트 필터(Prod. No. NY3002500)를 통과하여 여과시킨다.

4. 상기 여과된 용액내에 CD14의 존재를 하기와 같은 방법에 의해 테스트 하였다.

a) 3㎛의 기공 크기를 갖고, 상기 실시예 1에 따라 블락된 5mm 직경의 니트로셀룰로오스 필터 디스크를 상기 흡광도 패드 (Absorbent CF7, Whatman- article no. 8117 in a filter holder.)상에 놓는다.

b) 상기 니트로셀룰로오스 필터 상에 여과된 샘플 50μl를 놓고(상기 참조), 여과된 샘플에 남아있는 단핵세포를 포함하는 백혈구가 니트로셀룰로오스 필터 상에 유지되게 하면서, 필터와 흡수제 아래로 빨아들인다.

c) pH = 7.4인 0.01M Tris, 0.14M NaCl 1mg/ml 소혈청 알부민, 0.1% Tween 20의 용액 50㎕를 이용하여 세포/니트로셀룰로오스 필터를 세척한다.

d) 항-인간 CD14 알칼리성 포스파타제 접합체[상기 목적을 위해 Diatec AS, Oslo의 항-인간 CD14(실시예 3c와 동일)(Product 3110)을 알칼리성 포스파타제(Diatec prod. No. 3119, clone 18D11 항-인간 CD14 항체와 접합됨)와 접합하였고; 상기 접합체를 0.1% Tween를 함유하는 Kementech AP Stabil 용액(cat no. 4-40-H)에서 1:100으로 희석하였고, 이 혼합물 60μl을 상기 니트로셀룰로오스 필터에 적용하였다]를 적용하고, 3분 동안 인큐베이션 시켰다.

e) 2x60 μl의 pH = 7.4인 0.01M Tris, 0.14M NaCl, 1mg/ml 소혈청 알부민, 0.1 % Tween 20 용액을 이용하여 세포/니트로셀룰로오스 필터를 세척하였다.

f) 남아있는 세포 및 니트로셀룰로오스 필터에 Seramun Purple S-800-NBT 20μl를 적용하고 흡수제를 배출시켰다.

g) 10분 동안 발색하였다.

만약 발색되지 않는다면, 상기에서 기술된 용해 완충액에는 충분한 CD14 결합 분자가 있는 것이다. 만약 충분히 발색된다면, 상기 기술된 용해 완충액에 CD14-결합 물질을 더 첨가하여야 한다.

실시예 4b: 중합된 항-CD14 항체를 포함하는 샘플 희석 완충액

0.5mg/mL BSA 및 0.1% proclin를 포함하는 pH 7.5 10mM NaCl 용액을 제조하였다. 상기 실시예 3b에 따라 제조된 중합된 항-CD14 항체를 본 발명의 방법을 이용하여 CD4 수용체가 분석될 수 있는 전혈 부피 내의 모든 단핵 세포를 결합 및 응집하는데 충분한 양으로 상기 완충 용액에 첨가하였다. 예를 들어, 만약 20μl 전혈을 분석한다면, 400 μl 부피의 샘플 희석 완충액을 이용하고, 20μl 혈액의 모든 단핵 세포에 결합하는 항-CD14 항체의 양이 400 μl의 샘플 희석 완충액에 존재하여야 한다.

용혈 용액에 존재하거나 첨가되는 항-CD14의 양이 혼합물 내의 모든 CD14 분자를 결합시키는데 충분한지를 확인하기 위해 사용되는 방법은 하기 단계를 포함한다:

1. 알려진 많은 양의 단핵세포 및 CD14 수용체를 갖는 20μl의 전혈과 pH=7.5를 갖는 10 mM NaCl, 0.5 mg/ml 소혈청 알부민이 포함된 400ul 용액을 혼합하고 실시예 3b에 따라 제조된 중합된 항-CD14 항체를 포함하여 용해 완충액을 만든다. 포함된 중합된 항-CD14 항체의 양은 하기 설명에 따라 다양하다.

단계 2 내지 4는 실시예 4a에서 설명한 대로 수행하였다.

만약 발색되지 않는다면, 상기 설명된 용해 완충액에는 충분한 CD14 결합 분자가 있는 것이다. 만약 충분히 발색된다면, 상기 설명된 용해 완충액에 CD14-결합 물질을 더 첨가하여야 한다.

실시예 4c: 세파로스 입자가 접합된 항-CD14 항체를 포함하는 샘플 희석 완충액

0.5mg/mL BSA 및 0.1% proclin를 포함하고 7.4로 조절되는 10mM NaCl 용액을 제조하였다. 상기 실시예 3c에 따라 제조된 세파로스 입자에 고정된 항-CD14 항체를 본 발명의 방법을 이용하여 CD4 수용체에 대해 분석되는 전혈 부피 내의 모든 단핵 세포를 결합 및 응집하기 충분한 양으로 상기 완충 용액에 첨가하였다. 예를 들어, 만약 20μl 전혈을 분석한다면, 400 μl 부피의 샘플 희석 완충액을 이용하고, 20μl 혈액의 모든 단핵 세포에 결합하는 상기 실시예 3c에 따라 세파로스 입자가 접합된 항-CD14 항체의 양이 400 μl의 샘플 희석 완충액에 존재하여야 한다.

용혈 용액에 존재하거나 첨가되는 항-CD14의 양이 혼합물 내의 모든 CD14 분자를 결합시키는데 충분한지를 확인하기 위해 사용되는 방법은 하기 단계를 포함한다:

1. 알려진 많은 양의 단핵세포 및 CD14 수용체를 갖는 20μl의 전혈과 pH=7.5를 갖는 10 mM NaCl, 0.5 mg/ml 소혈청 알부민이 포함된 400ul 용액을 혼합하고 실시예 3c에 따라 제조된 아가로스 입자가 연결된 단일클론 항-CD14 항체를 포함하여 용해 완충액을 만든다. 항-CD14 항체 아가로스 입자의 양은 하기 설명에 따라 다양하다.

단계 2 내지 4는 실시예 4a에서 설명한 대로 수행하였다.

만약 발색되지 않는다면, 상기 설명된 용해 완충액에는 충분한 CD14 결합 분자가 있는 것이다. 만약 충분히 발색된다면, 상기 설명된 용해 완충액에 CD14-결합 물질을 더 첨가하여야 한다.

실시예 5: 세척 완충액

pH가 7.4로 조절되고, 0.14M 염화나트륨, 1g/l Tween 20(Sigma), 0.01M 2-아미노-2-하이드록시메틸-프로판-1,3-디올(Sigma), 1g/l 소혈청 알부민(Sigma) 및 1g/l Proclin 300이 포함된 용액을 제조하였다.

실시예 6: 효소- 접합된 단일클론 마우스 항-인간 CD4 수용체 항체의 용액

단일클론 항-인간 CD4 수용체의 EDU-2 클론에 접합된 알칼리성 인산염 효소를 Diatec AS, Oslo, Norway에서 구입하였다. 이것은 0.5mg/ml로 공급되었다. 작용 용액에서 이것은 Kementech AP Stabil 용액(cat no. 4-40-H)에서 1:100으로 희석하였고, 최종 용액에서 Tween이 0.1%v/v가 되게 첨가하였다.

실시예 7: 도 1에 따른 수직 유동 어세이 장치

수직 여과 장치를 22mm×22mm인 두께 0.20mm의 정사각형 폴리스티렌 디스크(101) 주위에 형성하였다.

폴리스티렌 디스크의 중심에 5mm 원형 개구(102)를 표준 펀칭 기기로 펀칭하였다.

상기 정사각형 폴리스티렌 디스크 아래에, 작은 브러시를 사용하여 Clearseal Casco 접착제의 얇은 층(103)을 칠했다. 10 mm의 직경을 갖는, 상기 실시예 1에 따라 제조된, 평균 기공 크기가 3, 5 또는 8㎛인 니트로셀룰로오스(104)의 원형 조각을, 상기 폴리스티렌 디스크의 중앙 개구부(102)의 가운데에 중심을 갖도록 상기 폴리스티렌 디스크의 접착제 상에 놓았다.

그 후, 상기 폴리스티렌 디스크의 전체 접착제 면을 22 x 22 mm CF7 흡수 패드(105) (100% 코튼 린터 재료, GE Health Care Life Sciences)로 덮고, 접착제를 건조시켰다.

폴리스티렌 디스크의 개구(102)에, 밑에 있는 니트로셀룰로오스 필터의 상부에 실시예 1에 따른 나일론 네트 필터의 5mm 직경의 디스크(106)를 Clearseal Casco 접착제 및 폴리스티렌 고리(108) 및 접착 테이프(107)에 3mm의 중앙 개구부를 갖는 22 x 10 mm 조각의 접착 테이프(107)를 이용하여, 폴리스트렌 디스크에 고정시켰다.

실시예 8: 효소 면역접합체를 이용한 수직 유동 CD4 어세이

도 1의 장치로 수행된 상기 어세이는 하기 단계를 포함한다:

1. 25㎕의 전혈 샘플을 상기 실시예 4c에 따라 500㎕ 희석 완충액과 혼합한다.

2. 1분 후에, 상기 혼합물 50㎕를 상기 실시예 7에 따른 여과 장치의 접착 테이프(107)의 개구부로 옮기고, 즉시 나일론 메쉬 필터 (106)로 빨아들였다.

3. 그 후, 상기 실시예 5에 따른 세척 용액 50㎕를 상기 실시예 7에 따른 여과 장치의 접착 테이프 (107)의 개구부로 옮기고, 나일론 메쉬 필터로 빨아들였다.

4. 그 후, 상기 접착 테이프를 찢어서 접착 테이프(107) 및 나일론 메쉬 필터(106)를 제거하였다.

5. 그 후, 상기 실시예 6에 따른 효소 접합된 단일클론 마우스 항-인간 CD4 수용체 항체가 포함된 용액 50㎕ 을 상기 실시예 7에 따른 여과 장치의 폴리스티렌 디스크(102)의 개구로 옮기고, 니트로셀룰로오스 필터(104)로 빨아들였다. 상기 용액을 필터에 빨아들인 후, 상기 항체-접합체를 2분 동안 세포에 결합하게 하였다.

6. 그 후, 상기 실시예 5에 따른 세척 용액 100㎕를 상기 실시예 7에 따른 여과 장치의 폴리스티렌 디스크(102)의 개구로 옮기고, 니트로셀룰로오스 필터(104)로 빨아들였다.

7. 그 후, 20μl의 Seramun Purple S-008-NBT 액체 효소 기질 Seramun GmbH을 상기 실시예 7에 따른 여과 장치의 폴리스티렌 디스크(102)의 개구로 옮기고, 니트로셀룰로오스 필터(104)로 빨아들이고, 5분 동안 발색시켰다.

8. 5분 후에, 발색된 색상을 Skannex AS, Norway가 제공한 소프트웨어가 있는 SkanSmart CE 판독기를 사용하여 반사광 측정으로 측정하였다.

9. 판독값을 동일한 실험에서 분석된, T-세포 관련된 CD4 수용체 분자의 공지된 함량을 갖는 교정 샘플에 의해 생성된 소프트웨어에 저장된 교정 곡선과 비교하였고, T-세포 관련 CD4 수용체 분자의 함량을 계산하였다.

대체 과정:

시간 소모가 큰 효소 신호 생성의 사용을 피하기 위해, 상기 항-인간 CD4 항체를 상기 단계 6 직후 판독될 수 있는 발색된 물질 또는 형광 물질에 연결할 수 있다. 발색된 면역입자는 항체 또는 이의 면역반응성 단편; 및 색상을 나타내는 미립자 물질을 포함한다. 상기 미립자 물질을 물리적인 흡수 또는 공유 결합, 종종 스페이서 또는 가교 분자에 의해 상기 항체 또는 단편에 연결할 수 있다. 상기 발색된 물질은 많은 상이한 물질로 제조될 수 있는 라텍스 입자 또는 중합체 입자 같은 금속 콜로이드 또는 금 콜로이드 또는 제2철 콜로이드 또는 탄소 입자 내의 또는 그 위에 있는 발색제로 구성될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 발색된 입자는 선행 기술에서 설명하고 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들은 일반적으로 Merck France, Life technologies (US) 및 Bangs Laboratories (US)와 같은 공급업체에서 구입할 수 있다. 중합체 입자는 모든 크기와 색상으로 제공되며 형광 입자로도 제공된다. 입자의 크기 및 색상 강도는 어세이 방법뿐만 아니라 본 발명의 제품에 사용된 막의 기공 크기에 필요한 감도 및 용량으로 조정되어야 한다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 특이적 세포군을 포획하고 상기 세포군과 관련된 수용체를 측정하기 위해 막을 이용한다. 세포 또는 특이적 세포군의 크기에 따라, 상기 막은 상기 세포군을 포획하고 다른 더 작은 입자는 상기 막을 통과하게 하기 위한 조절된 기공 크기를 갖는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 특이적 세포군은 T-림프구이고, 상기 T-세포를 포획하기 위한 막의 적합한 기공 크기는 평균적으로 1-10 μm, 바람직하게는 3-9 μm, 보다 바람직하게는 3-5 μm이고, 샘플 물질에 함유된 작은 미립자 물질은 저삼투성 후에 상기 막을 통과하게 한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 발색된 면역입자로부터 우수한 신호를 발생하는 크기로 발색된 면역입자를 이용하지만, 상기 특이적 세포군을 포획하는 상기 막을 통과하기에 충분히 작은 것은 그렇지 않다. 일반적으로, 본 발명은 직경이 60 내지 400 nm, 보다 바람직하게는 80 내지 300 nm, 더욱 바람직하게는 95 내지 200 nm 크기의 면역 입자를 이용한다.

실시예 9: 청색 카르복실화 라텍스에 접합된 항-CD4 항체

본 발명의 일 구현예에서, 평균 117nm의 직경을 갖는 청색 카르복실화 라텍스 입자(Millipore, Europe, Prod. No. PSI 90-91)를 이용하였다. 단일클론 항-인간 CD4 수용체 항체의 EDU-2 클론(Diatec AS, Norway) 5mg을 5ml 완충액(5 mM 붕산염, 7.5 mM 염화나트륨, pH = 9.5)에 투석하였다. 상기 카르복실화 청색 라텍스 입자 23.4mg을 원심분리에 의해 세척하고 물 2ml에 현탁시켰다. 입자 현탁액에 EDC(Sigma, US) 0.8㎎을 용해시키고 항체 용액을 라텍스 현탁액과 혼합하고, 5시간 동안 교반하였다. 상기 현탁액 내의 입자를 1mM NaCl, 0.5 mM 붕산염 나트륨, 0.025 % Tween 20, 0.5 mM 글라이신, pH = 9.5로 4회 세척하였다. 이 모액을 30mM 붕산염 완충액 (pH 9.1-9.3, 150mM 염화나트륨, 0.1% Tween 20, 0.5mg/ml PSA 및 0.1% ProClin 950)에 1:3으로 희석하였다.

이 제조물의 신호 강도는 배치마다 어느 정도 다를 수 있고, pH가 7.4로 조절된 15mM TRIS, 10mM 붕산염, 15mM NaCl 및 0.1 % Tween 및 1mg/ml 소혈청 알부민이 포함된 용액에서 모액의 적절한 희석을 확인함으로써 적절한 작용 용액을 발견하였다.

실시예 10: 청색 라텍스 면역입자를 사용한 수직 유동 CD4 어세이

도 1의 장치로 수행된 상기 어세이는 하기 단계를 포함한다:

1. 25㎕의 전혈 샘플을 상기 실시예 4c에 따라 500㎕ 희석 완충액과 혼합한다.

2. 1분 후에, 상기 혼합물 150㎕를 상기 실시예 7에 따른 여과 장치의 접착 테이프(107)의 개구부로 옮기고, 즉시 나일론 메쉬 필터 (106)로 빨아들였다.

3. 그 후, 상기 실시예 5에 따른 세척 용액 50㎕를 상기 실시예 7에 따른 여과 장치의 접착 테이프 (107)의 개구부로 옮기고, 나일론 메쉬 필터에 빨아들였다.

4. 그 후, 상기 접착 테이프를 찢어서 접착 테이프(107) 및 나일론 메쉬 필터(106)를 제거하였다.

5. 그 후, 상기 실시예 9에 따른 청색 카르복실화 라텍스에 접합된 항-CD4 항체가 포함된 현탁액 50㎕을 상기 실시예 7에 따른 여과 장치의 폴리스티렌 디스크(102)의 개구로 옮기고, 니트로셀룰로오스 필터(104)로 빨아들였다.

6. 그 후, 세척 단계를 시작하기 전에 상기 비드가 접합된 항체가 충분히 세포와 결합하게 미리 정해둔 시간을 기다린다.

7. 그 후, 상기 실시예 5에 따른 세척 용액 50㎕를 상기 실시예 7에 따른 여과 장치의 폴리스티렌 디스크(102)의 개구로 옮기고, 니트로셀룰로오스 필터(104)로 빨아들였다.

8. 그 후 즉시, 니트로셀룰로오스 필터 상의 색상을 Skannex AS, Norway가 제공한 소프트웨어가 있는 SkanSmart CE 판독기를 사용하여 반사광 측정으로 측정하였다.

9. 판독값을 동일한 실험에서 분석된, T-세포 관련된 CD4 수용체 분자의 공지된 함량을 갖는 교정 샘플에 의해 생성된 소프트웨어에 저장된 교정 곡선과 비교하였고, T-세포 관련 CD4 수용체 분자의 함량을 계산하였다.

실시예 8 및 10은 중합체 입자가 접합된 항-CD14 항체를 포함하는 실시예 4c에 따른 샘플 희석 완충액을 사용한다. 상기 샘플 희석 완충액을 실시예 4a에 따른 비-접합된 항-CD14 항체, 또는 실시예 4b에 따른 중합된 항체, 또는 많은 항체 분자를 지니는 다양한 잘-알려진 방법으로 제조된 물질을 함유하는 완충액으로 교체할 수 있다. 비-제한적으로, 상기 항체를 단백질 담체 분자 또는 가용성 중합체 분자에 접합시키는 것은 또 다른 바람직한 선택이다.

실시예 11: 적색 카르복실화 라텍스에 접합된 항-CD8 항체

평균 190nm의 직경을 갖는 적색 카르복실화 라텍스 입자(Merck Estapore, Prod. No. 784 K1-010)를 이용하였다. 5mg의 단일클론 항-인간 CD8 수용체 항체의 UCHT-4 클론(Diatec AS, Norway)을 5ml 완충액(5 mM 붕산염, 7.5 mM 염화나트륨, pH = 9.5)에 투석하였다. 상기 카르복실화 청색 라텍스 입자 35mg을 원심분리에 의해 세척하고 물 2ml에 현탁시켰다. 입자 현탁액에 EDC(Sigma, US) 0.8㎎을 용해시키고 항체 용액을 라텍스 현탁액과 혼합하고, 5시간 동안 교반하였다. 상기 현탁액 내의 입자를 1 mM NaCl, 0.5 mM 붕산염 나트륨, 0.025 % Tween 20, 0.5 mM 글라이신, pH = 9.5로 4회 세척하였다. 이 모액을 30mM 붕산염 완충액 (pH 9.1-9.3, 150mM 염화나트륨, 0.1% Tween 20, 0.5mg/ml BSA 및 0.1% ProClin 950)에 1:3으로 희석하였다.

이 제조물의 신호 강도는 배치마다 어느 정도 다를 수 있고, pH가 7.4로 조절된 15mM TRIS, 10mM 붕산염, 15mM NaCl 및 0.1 % Tween 및 1mg/ml 소혈청 알부민이 포함된 용액에서 모액의 적절한 희석을 확인함으로써 적절한 작용 용액을 발견하였다.

실시예 12: 청색 및 적색 라텍스 면역입자를 사용한 수직 유동 CD4 및 CD8 어세이

도 1의 장치로 수행된 상기 어세이는 하기 단계를 포함한다:

4. 20㎕의 전혈 샘플을 상기 실시예 4c에 따라 400㎕ 희석 완충액과 혼합한다.

5. 1분 후에, 상기 혼합물 150㎕를 상기 실시예 7에 따른 여과 장치의 접착 테이프(107)의 개구부로 옮기고, 즉시 나일론 메쉬 필터(106)로 빨아들였다.

6. 그 후, 상기 실시예 5에 따른 세척 용액 50㎕를 상기 실시예 7에 따른 여과 장치의 접착 테이프 (107)의 개구부로 옮기고, 나일론 메쉬 필터로 빨아들였다.

7. 그 후, 상기 접착 테이프를 찢어서 접착 테이프(107) 및 나일론 메쉬 필터(106)를 제거하였다.

8. 그 후, 상기 실시예 9에 따른 청색 카르복실화 라텍스에 접합된 항-CD4 항체 50% 및 실시예 11에 따른 적색 카르복실화 라텍스에 접합된 항-CD8 50%의 현탁액 50㎕을 상기 실시예 7에 따른 여과 장치의 폴리스티렌 디스크(102)의 개구로 옮기고, 니트로셀룰로오스 필터(106)로 빨아들였다.

9. 3분 후에, 실시예 5에 따른 세척 용액 50㎕를 상기 실시예 7에 따른 여과 장치의 폴리스티렌 디스크(102)의 개구에 옮기고, 니트로셀룰로오스 필터(106)로 빨아들였다.

10. 그 후 즉시, 표준 애플 아이폰 및 이의 내장된 플래시를 이용한 반사광 측정으로 니트로셀룰로오스 필터 상의 색상을 측정하였다. 동시에 상기 장치 상에 위치한 2개의 적색 점(약함 및 강함) 및 2개의 청색 점 (약함 및 강함)을 묘사하였다. 5개의 스팟 모두에 대해, 획득한 BGR 파일(상기 참조)을 사용하여(파일을 회색조로 변환하여) 점의 위치 및 한계를 결정하였다. GIMP(상기 참조) 프로그램에 의해, 모든 픽셀은 HSV 색상값으로 변환되었다. 2개의 청색 점에 대한 최대 및 최소 응답은 청색 색 공간에서 정의하고, 2개의 적색 점에 대한 최대 및 최소 응답은 적색 색 공간에서 정의한다.

11. 상기 테스트 스팟(적색 및 청색 입자 둘 다)으로부터의 상기 HSV 값은 적색 및 청색 HSV 색 공간에서 보정되고, 모든 픽셀에 대한 HSV 값은 계산되고 표준화된다.

12. 상기 획득한 표준화 값을 잘 알려진 CD4 및 CD8 양성 림프구의 교정 샘플(Becton Dickinson Excalibur 유동 세포분석법 시스템으로 또한 분석됨)로부터 획득한 값과 비교하고, 이는 아이폰 시스템 내의 컴퓨터의 교정 파일에 저장되었고, 상기 결과는 디스플레이 및 전차 출력으로 보고되었다. 상기 결과는 부피 단위 당 CD4-림프구 수 및 부피 단위 당 CD8-림프구의 수 및 상기 두 수 사이의 비율로 보고된다.

본원에 인용된 선행 기술 문헌의 개시는 참고 문헌으로 포함된다.

<110> GENTIAN DIAGNOSTICS AS <120> Method for Assessing Cell Surface Receptors of Blood Cells <130> IPA171443-DE <150> NO 20150960 <151> 2015-07-23 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asn His Lys Val His Met Glu Leu Asp Asp Glu Asp Phe Arg Cys 1 5 10 15 Val Cys Asn Phe Ser Glu Pro Gln Pro Asp Trp Ser Glu Ala Phe Gln 20 25 30 Cys Val Ser Ala Val Glu Val Glu Ile His Ala Gly Gly Leu Asn Leu 35 40 45 Glu Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg Gln Tyr 50 55 60 Ala Asp Thr Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr Val Gly Ala 65 70 75 80 Ala Gln Val Pro Ala Gln Leu Leu Val Gly Ala Leu Arg Val Leu Ala 85 90 95 Tyr Ser Arg Leu Lys Glu Leu Thr Leu Glu Asp Leu Lys Ile Thr Gly 100 105 110 Thr Met Pro Pro Leu Pro Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Leu Ser Ser 115 120 125 Leu Arg Leu Arg Asn Val Ser Trp Ala Thr Gly Arg Ser Trp Leu Ala 130 135 140 Glu Leu Gln Gln Trp Leu Lys Pro Gly Leu Lys Val Leu Ser Ile Ala 145 150 155 160 Gln Ala His Ser Pro Ala Phe Ser Cys Glu Gln Val Arg Ala Phe Pro 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Leu Asp Leu Ser Asp Asn Pro Gly Leu Gly Glu Arg 180 185 190 Gly Leu Met Ala Ala Leu Cys Pro His Lys Phe Pro Ala Ile Gln Asn 195 200 205 Leu Ala Leu Arg Asn Thr Gly Met Glu Thr Pro Thr Gly Val Cys Ala 210 215 220 Ala Leu Ala Ala Ala Gly Val Gln Pro His Ser Leu Asp Leu Ser His 225 230 235 240 Asn Ser Leu Arg Ala Thr Val Asn Pro Ser Ala Pro Arg Cys Met Trp 245 250 255 Ser Ser Ala Leu Asn Ser Leu Asn Leu Ser Phe Ala Gly Leu Glu Gln 260 265 270 Val Pro Lys Gly Leu Pro Ala Lys Leu Arg Val Leu Asp Leu Ser Cys 275 280 285 Asn Arg Leu Asn Arg Ala Pro Gln Pro Asp Glu Leu Pro Glu Val Asp 290 295 300 Asn Leu Thr Leu Asp Gly Asn Pro Phe Leu Val Pro Gly 305 310 315

Claims (44)

1. 액체 전혈 샘플 또는 이로부터 유래된 샘플에서 관심 있는 혈액 세포(Bcol)의 하나 이상의 서브클래스를 분석하기 위한 어세이 방법으로서, 각각은 상기 관심있는 혈액 세포의 서브클래스에 대한 제1 세포 표면 마커(M1)를 지니고,
   상기 샘플은 비-특이적 마커로서 적어도 하나의 상기 제1 세포 표면 마커(M1) 및/또는 임의의 상기 제1 세포 표면 마커(M1)의 적어도 하나의 자유 비-세포 표면 결합 형태를 지니는 방해 혈액 세포(DBC)를 추가로 포함할 수 있는, 어세이 방법으로서,
   (1) 임의의 방해 혈액 세포(DBC)를 상기 샘플에서 제거하는 단계;
   (2) 단계 (1) 에서 얻은 상기 샘플로부터 제1 세포 표면 마커 각각의 임의의 자유, 비-세포 표면 결합 형태를 제거하는 단계; 및
   (3) 단계 (2)에서 얻은 샘플에서 상기 제1 세포 표면 마커(M1)을 지니는 상기 Bcol의 서브-클래스를 각각 분석하는 단계
   를 포함하는, 어세이 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 수직 유동 어세이 방법인 것인, 어세이 방법.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (1)에서 상기 DBC는 여과에 의해 제거되는 것인, 방법.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 DBC는 응집되고, 상기 응집체는 단계 (1)에서 이용한 필터에 의해 유지되는 것인, 방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 DBC는 상기 BCoI에 결합하지 않는 면역 글로불린 분자에 의해 응집된 것인, 방법.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 DBC는 상기 BCoI의 표면 상에 존재하지 않는 제2 세포 표면 마커(M2)에 결합하는 면역 글로불린 분자에 의해 응집된 것인, 방법.
   
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 DBC 결합 면역 글로불린은 자유 항체, 중합 항체 또는 고형 입자, 특히 중합체 입자의 표면에 결합된 항체로부터 선택된 것인, 방법.
   
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (2)에서의 상기 제1 세포 표면 마커(M1)의 비-세포 표면 결합 형태는 상기 제1 세포 표면 마커(M1)의 상기 비-세포 표면 결합 형태에 대해서는 투과성이 있지만, BCol은 유지되는 필터를 이용한 여과에 의해 제거된 것인, 방법.
   
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (3)의 분석은 상기 제1 세포 표면 마커(M1)와 반응하는 면역 글로불린 분자에 의해 수행되는 것인, 방법.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 면역 글로불린 분자는 표지된 것인, 방법.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 표지는 효소; 형광 또는 유색 분자 마커; 또는 형광 또는 유색 입자로부터 선택된 것인, 방법.
    
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BCoI는 림프구의 서브-클래스로부터 선택된 것으로서, 특히 T-림프구이고, 상기 DBCs는 단핵 백혈구인 것인, 방법.
    
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 표면 마커(M1)는 T-림프구 마커(M1a)로서, 특히 CD4 세포 표면 수용체 분자인 것인, 방법.
    
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석된 관심있는 혈액 세포(BCoI)의 하나 이상의 서브-클래스는 CD4⁺ 세포를 포함하는 것인, 방법.
    
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1세포 표면 마커(M1a)는 CD4이고, 상기 세포의 제1 서브-클래스는 T-도움 세포인 것인, 방법.
    
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 또한 제1 세포 표면 마커(M1a)와 상이한 세포 표면 마커(M1b)를 지니는 BCoI의 제2 서브-클래스의 분석을 포함하는 것인, 어세이 방법.
    
17. 제16항에 있어서, 상기 세포 표면 마커(M1b)는 M1a와 상이한 T-림프구 마커로서, 특히 표면 마커 CD8이고, 상기 BCoI의 제2 서브-클래스는 CD8⁺ 세포를 포함하는 것인, 방법.
    
18. 제17항에 있어서, 상기 표면 마커(M1b)는 CD8이고, 상기 세포의 제2 서브-클래스는 세포독성 T-세포인 것인, 어세이 방법.
    
19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 세포 표면 마커 (M1b)를 지니는 상기 BCoI의 제2 서브-클래스의 분석은 제1세포 표면 마커(M1a)를 지니는 상기 BCoI의 제1 서브클래스의 분석과 함께 수행되는 것으로서, 특히 동일한 샘플에서 수행되는 것인, 방법.
    
20. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마커(M1b)를 지니는 상기 BCoI의 제2 서브-클래스의 분석은 별도로 수행되는 것인, 방법.
    
21. 제20항에 있어서, 상기 방법은
    (4) 선택적으로 상기 샘플로부터 분석을 방해할 수 있는 임의의 방해 거대분자 불순물을 제거하는 단계;
    (5) 상기 샘플(선택적으로 단계 (4)에서 얻은)로부터 상기 제2 세포 표면 마커(M1b)의 임의의 자유, 비-세포 결합 형태를 제거하는 단계; 및
    (6) 단계 (5)에서 얻은 샘플에서 상기 세포 표면 마커(M1b)를 지니는 상기 BCol의 서브-클래스를 분석하는 단계
    를 포함하는, 방법.
    
22. 제21항에 있어서, 단계 (5)에서 상기 제1세포 표면 마커(M1b)의 상기 비-세포 표면 결합 형태는 상기 세포 표면 마커(M1b)의 상기 비-세포 표면 결합 형태에 대해서는 투과성이 있지만, (M1b)를 지니는 BCol의 서브-클래스는 유지되는 필터를 이용한 여과에 의해 제거된 것인, 방법.
    
23. 제22항에 있어서, 상기 단계 (6)의 분석은 상기 세포 표면 마커(M1b)와 반응하는 면역 글로불린 분자에 의해 수행되는, 방법.
    
24. 제23항에 있어서, 상기 면역 글로불린 분자는 표지된 것인, 방법.
    
25. 제24항에 있어서, 상기 표지는 효소; 형광 또는 유색 분자 마커; 또는 형광 또는 유색 입자로부터 선택된 것인, 방법.
    
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DBC는 CD14⁺ 단핵 백혈구인 것인, 방법.
    
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (1)에서의 DBCs의 응집은 면역 글로불린을 포함하는 제1 액체를 첨가하는 것에 의해 수행되는 것으로서, 상기 액체는 샘플에 함유된 적혈구를 용해시킬 수 있는 것인, 방법.
    
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    (1a) 상기 샘플 또는 상기 샘플의 분액을, 상기 CD4 수용체를 지니지만 상기 세포의 특이적 서브-그룹과는 상이한 다른 세포의 표면상의 다른 구조물에 결합하는 항체를 포함하는 제1 액체와 혼합하여, 상기 세포의 특이적 서브-그룹에서 세포의 크기보다 유의하게 큰 크기를 갖는 입자; 또는 입자 또는 세포의 응집체 또는 클러스터를 형성하는 단계;
    (1b) 크기 배제 필터에 기초를 두고 있는 제1 필터에 의해 상기 형성된 입자; 또는 입자 또는 세포의 응집체 또는 클러스터를 여과하는 단계; 및
    (2) 상기 샘플 내의 상기 세포의 특이적 서브-그룹은 유지하지만 용액 내의 CD4 수용체 분자는 통과하게 하는 제2 필터를 통해 나머지 혼합물을 통과시키고, 선택적으로 뒤이어 세척하는 단계;
    (3a) 뒤이어 상기 제2 필터를 상기 CD4 수용체에 특이적으로 반응하는 표지된 항체를 포함하는 액체에 노출시키고, 선택적으로 뒤이어 세척하는 단계로서, 상기 표지는 효소 또는 발색 또는 형광 입자에 의해 구성된 표지인 단계;
    (3b) 선택적으로 뒤이어 상기 효소에 기질을 첨가하여 발색 또는 형광 물질을 발생시키는 단계; 및
    (3c) 상기 제2 필터에 발색 또는 형광 강도를 측정하고 상기 강도를 상기 세포의 특이적 서브-그룹의 표면에 CD4 수용체의 클래스의 농도와 상호비교하는 단계
    를 포함하는 방법.
    
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, (선택적) 바람직하게 분석 전에(단계 (1), (1a) 및 (4) 전에) 상기 혈액 샘플에 적혈구의 저삼투성, 용해를 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
    
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD4⁺ 세포군의 세포 수가 분석된 것인, 방법.
    
31. 제30항에 있어서, 상기 CD4⁺ 세포군 및 CD4⁺ 세포와는 다른 적어도 하나의 추가적인 세포군으로서, 특히 CD8⁺ 세포군에 대한 세포 수가 분석된 것으로서, 특히 CD4/CD8 비율이 분석된 것인, 방법.
    
32. 전혈 샘플 또는 혈액으로부터 유래한 샘플에서 CD4⁺ 세포의 표면상에 위치하는 CD4 수용체의 양을 분석하고 선택적으로 CD8⁺ 세포의 표면상에 위치하는 CD8 수용체의 양을 분석하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 단계 및 세포-결합 CD4⁺ 수용체의 양과 함께 CD4⁺ 세포군의 분석을 위해 얻은 신호를 상호비교하는 단계, 선택적으로 세포-결합 CD8⁺ 수용체의 양과 함께 CD8⁺ 세포군의 평가를 위해 얻은 신호를 상호비교하는 단계를 포함하는, 분석 방법.
    
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법에 이용되는 상기 면역 글로불린 분자는 단일 클론 또는 다중 클론 비-인간 항체와 같은 항체로서, 특히 비-설치류 항체와 같은 항체인 것인, 방법.
    
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (M1a) 및/또는 (M1b) (특히, CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ 세포)에 결합하기 위해 이용된 면역 글로불린은 30 내지 500 nm 범위의 평균 입자 직경을 갖는 발색된 라텍스 입자에 공유 결합하는 것인, 방법.
    
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 수직 유동 어세이 장치로서,
    상기 장치는 적어도 하나의 원형(10 액체) 샘플 공급 개구(102)가 제공된 상부 커버 시트(101) 및 상기 상부 커버 시트(101)에 고정된 하부 흡수층(105);
    상기 적어도 하나의 원형 개구(102)에 제거 가능하게 삽입된 제1 원형 필터(106);
    상기 상부 커버 시트(101) 및 상기 하부 흡수층(105) 사이에 고정되고, 상기 적어도 하나의 공급 개구(102)와 그 내부에 삽입된 상기 원형 필터(106)를 상기 흡수층(105)으로부터 분리시킨 제2 필터(104)
    를 포함하는, 수직 유동 어세이 장치.
    
36. 제35항에 있어서, 상기 제1 원형 필터(106)는 응집된 혈액 세포를 유지하는 개구 또는 기공을 갖고, 비-응집된 혈액 세포, 특히 CD4⁺ 세포, 선택적으로 CD8⁺ 세포에 투과성이 있는 것인, 장치.
    
37. 제36항에 있어서, 상기 제1 원형 필터(106)는 18 내지 50㎛, 바람직하게 22 내지 40㎛, 보다 바람직하게 25 내지 33㎛의 범위의 그리드 크기를 갖는 네트 필터를 갖는 것인, 장치.
    
38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 필터(104)는 응집된 혈액 세포를 유지하는 개구 또는 기공을 갖고, 상기 액체 샘플의 가용성 구성 성분에 대해 투과성이 있는 것인, 장치.
    
39. 제38항에 있어서, 상기 제2 필터(104)는 1 내지 10㎛, 바람직하게는 3 내지 9㎛, 보다 바람직하게는 5 내지 8㎛ 범위의 기공 크기를 갖는 것인, 장치.
    
40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 원형 필터(106)는 캐리어 링(108)을 통해 접착 테이프(107)에 고정되고, 상기 링(108)은 샘플 공급 개구(102)의 직경보다 약간 작은 외부 직경을 갖고 설정된 샘플 용량을 정량적으로 흡수하기에 충분한 자유 원형 공간을 정하도록 선택되는 내부 직경을 갖는, 장치.
    
41. 제40항에 있어서, 상기 테이프(107)는 상기 상부 커버 시트(101)의 상부 측에 제거 가능하게 접착된 것인, 장치.
    .
42. 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 원형 개구(102) 안으로 제거 가능하게 삽입된, 상기 제1 원형 필터(106)는 상기 상부 커버 시트(101)로부터 상기 테이프(107)를 제거함으로써 상기 장치로부터 제거되는 것인, 장치.
    
43. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 흡수층은 수직 유동 어세이 과정동안 상기 샘플 공급 개구(102)에 첨가된 샘플 및 시약의 임의의 액체 구성 성분 및 세척 용액을 흡수하기에 충분히 높은 흡수 용량을 갖는, 장치.
    
44. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에서 정의된 어세이를 수행하기 위한 제35항 내지 제43항 중 어느 한 항에서 정의된 장치의 용도.
    

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