CN114134123B - 妊娠相关糖蛋白的单克隆抗体及其在牛早期怀孕检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体领域，更具体地，本发明涉及妊娠相关糖蛋白的单克隆抗体及其在牛早期怀孕检测中的应用。由于本发明的单克隆抗体可以特异性地结合妊娠相关糖蛋白，因此可以用于制备操作简单、稳定性好、准确性高的快速牛早期怀孕检测产品，从而提高畜牧业的经济效益。

Description

妊娠相关糖蛋白的单克隆抗体及其在牛早期怀孕检测中的应用
技术领域
本发明涉及抗体领域，更具体地，本发明涉及妊娠相关糖蛋白的单克隆抗体及其在牛早期怀孕检测中的应用。
背景技术
牛早期怀孕检测是牧场生产过程中的一项重要组成部分，产犊间隔是衡量奶牛繁育能力的重要指标。通过早期精准的奶牛怀孕检测，可以帮助牧场尽早的发现空怀牛和怀孕牛，对未怀孕的奶牛及时重新配种，通过缩短产犊间隔来帮助牧场实现产奶量和经济效益的最大化。
B超和直肠触诊是目前常见的妊娠判断方法，但该两种方法至少在配种后35天和45天才能进行，且方法的准确性与操作人员的经验和技能密切相关，操作不当还会导致胚胎的早期死亡。
早期妊娠相关糖蛋白(PAG)是目前常用的奶牛早期妊娠诊断指标，该蛋白由奶牛胎儿胎盘的滋养层产生，并分泌到母畜外周血液中，在配种后28天左右即可通过检测母畜血液中PAG的浓度变化，尽早对奶牛妊娠状态进行判断。目前市面上通过检测PAG鉴别奶牛妊娠状态的产品均为酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒。ELISA方法检测时间长(3小时以上)、操作繁琐，需要专门试验场地、设备及专业操作人员，不适于基层、中小型牧场使用。目前，尚无基于免疫层析原理的快速检测产品。
任何免疫学检测方法的关键都是特异性抗体的制备，为了解决现有方法的缺陷，满足更广泛的检测需求，本领域亟需更多的灵敏度高、稳定性好的特异性PAG抗体，用于制备操作简单、稳定性好、准确性高的快速检测牛早期怀孕的产品。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了特异性结合妊娠相关糖蛋白的单克隆抗体以及包含所述单克隆抗体的检测试纸卡，以快速准确地检测牛早期怀孕。
因此，在第一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞于2021年10月12日保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61975。
在第二方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞于2021年10月12日保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61976。
在第三方面，本发明提供了一种特异性结合牛妊娠相关糖蛋白(PAG)的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体由本发明第一方面或第二方面的杂交瘤细胞产生。
在第四方面，本发明提供了一种特异性结合牛妊娠相关糖蛋白(PAG)的单克隆抗体组合，其中所述抗体组合包括由保藏号为GDMCC No：61975的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体以及由保藏号为GDMCC No：61976的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
在第五方面，本发明提供了一种用于检测牛妊娠相关糖蛋白(PAG)的试纸条，所述试纸条包括样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫，在所述结合垫上包被有经标记的由保藏号为GDMCC No：61975的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，并且在所述包被膜上包被有由保藏号为GDMCC No：61976的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为检测线。
在第六方面，本发明提供了一种用于检测牛妊娠相关糖蛋白(PAG)的试纸卡，所述试纸卡包括本发明第五方面的试纸条、以及由上壳体和下壳体组成的卡扣。
在第七方面，本发明提供了本发明第一方面或者第二方面的杂交瘤细胞、第三方面的单克隆抗体、或者第四方面的单克隆抗体组合在检测牛早期怀孕中的应用。
本发明的单克隆抗体可以特异性地结合妊娠相关糖蛋白，因此，本发明的单克隆抗体可以用于制备基于抗体抗原免疫反应的检测试纸条，以提供操作简单、稳定性好、准确性高的快速检测牛早期怀孕的产品。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施方案。
图1是示出胶体金检测试纸条的结构示意图；
图2是示出荧光免疫检测试纸条的结构示意图；
图3是示出胶体金检测试纸卡和荧光检测试纸卡的壳体的结构示意图；
图4是胶体金检测试纸卡的结果判定的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施方案和附图，对本发明进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，都属于本发明保护的范围。
如上所述，本发明旨在提供能够特异性结合妊娠相关糖蛋白的单克隆抗体从而制备利用所述单克隆抗体的检测试纸卡，用于快速准确地检测牛早期怀孕。
因此，在第一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞于2021年10月12日保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61975。
在第二方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞于2021年10月12日保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61976。
本发明的杂交瘤细胞的制备方法如下：首先，用牛妊娠相关糖蛋白(PAG)免疫小鼠，然后将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行细胞融合，经有限稀释、克隆化以及间接ELISA筛选后，获得能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本发明人用SEQ ID NO:1所示的PAG作为抗原多次免疫小鼠，将小鼠的脾细胞用于细胞融合制备杂交瘤细胞，并通过间接ELISA检测方法筛选出阳性杂交瘤细胞克隆，由此制备出了能够特异性结合妊娠相关糖蛋白的单克隆抗体。
在第三方面，本发明提供了一种特异性结合牛妊娠相关糖蛋白(PAG)的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体由本发明第一方面或者第二方面的杂交瘤细胞产生。
在本说明书中，术语“妊娠相关糖蛋白(Pregnancy-associated glycoprotein，PAG)”是由反刍动物胎儿胎盘滋养层细胞合成分泌的一类蛋白质，在妊娠过程中具有重要作用。在本发明中，发明人使用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的牛妊娠相关蛋白(PAG)来对小鼠进行免疫。应理解，本发明对所述PAG的来源没有限定，其可以从天然细胞或重组细胞中提取，也可以通过人工合成。SEQ ID NO:1的序列如下：MKWLGLLGLVALSECMVIIPVTQMKAIRETLWERNLLTNFSEEHPCSLSQNATNDQNIVYHPLRNYKDLVYIGTIAIGTPPQEFRVIFDTGSSDLWVPSIHCHSPSCLTHSLFNPRTSTTFKLLNNIIDLIYASGRIKGVLGQDIIQVMWKPEAAGPGSNCCLQNRCRRSWRCLSFRKAPNGCRSAWKDSVLGETMPLLTYKLFVANAGRGLGCGFAASLPMKSRRFIMVSRRENGSVLMFGGVDHSYHTGKLNWVPVSRTHYWQITIGRISMNGKLIACKRGCQAIMDTGTTFLLGPSRHIAKIQRLIRIRPFGSLQYTVPCNITSTLPPLIFTIKGIDYPVPAQAYIHKMRGQS。
牛妊娠相关糖蛋白(PAG)是目前常用的奶牛早期妊娠诊断指标。在配种后28天左右即可通过检测母畜血液中PAG的浓度变化，尽早对奶牛妊娠状态进行诊断。根据现有研究发现，通过检测PAG对配种后35天的奶牛妊娠确诊率达到93.03％，表明PAG完全可以作为牛妊娠诊断检测的标志物。而任何免疫学检测PAG方法的关键都是特异性抗体，因此本发明提供的单克隆抗体可以用于通过多种免疫分析法来检测牛早期怀孕，所述检测方法包括但不限于免疫层析技术、酶联免疫吸附测定法、免疫印迹法、流式细胞术等。
在本发明中，发明人通过IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit抗体亚类试剂盒对这两株单克隆抗体进行了亚型鉴定，确定这两株单克隆抗体亚型均为IgG2b。因此，在一个实施方案中，所述单克隆抗体为IgG2b亚型。
在第四方面，本发明提供了一种特异性结合牛妊娠相关糖蛋白(PAG)的单克隆抗体组合，其中所述抗体组合包括由保藏号为GDMCC No：61975的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体(抗体1)以及由保藏号为GDMCC No：61976的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体(抗体2)。本领域的技术人员已知，抗体组合对于抗原的敏感性受多种因素影响，包括但不限于抗体亲和力、空间位阻和结合位点等。
在第五方面，本发明提供了一种用于检测牛妊娠相关糖蛋白(PAG)的试纸条，所述试纸条包括样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫，在所述结合垫上包被有经标记的由保藏号为GDMCC No：61975的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，并且在所述包被膜上包被有由保藏号为GDMCC No：61976的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为检测线。
试纸条是通过将样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫依次粘附在PVC底板上并采用搭接的方式连接而成的(如图1或图2所示)。在本发明中，包被膜通常是指在硝酸纤维素膜上包被抗体而形成的膜，包被膜上包被有两种抗体，第一种抗体为由保藏号为GDMCC No：61976的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，作为检测线T，第二种抗体为针对作为检测线的单克隆抗体的抗体，可以是单克隆抗体或者多克隆抗体，例如羊抗鼠IgG多克隆抗体，其作为质控线C。所述试纸条还可以包括用于免疫学分析的工具或试剂，例如产生可检测信号的标记物质、增溶剂和清洁剂等。
因此，在一个实施方案中，所述试纸条可以为胶体金检测试纸条或荧光免疫检测试纸条。
胶体金免疫层析技术是一种基于抗原抗体免疫反应的快速检测方法，将抗原或抗体标记在红色胶体金颗粒上，通过肉眼观察即可进行结果判读。荧光微球免疫层析技术是一种基于抗原抗体免疫反应的快速检测方法，将抗原或抗体标记在荧光微球上，通过荧光读数仪进行结果判读。两者基本原理一致，样本前处理以及检测方法也基本相同，仅是抗原或抗体标记物和判读方法上的区别，同样具备操作简单(不需要专业实验室人员操作)、检测快速(20分钟内即可完成)、稳定性好、准确性高的特点。
在所述试纸条为胶体金检测试纸条的情况下，所述包被在所述结合垫上的单克隆抗体经胶体金标记；在所述试纸条为荧光免疫检测试纸条的情况下，所述包被在所述结合垫上的单克隆抗体经荧光标记。
优选地，所述结合垫上包被的单克隆抗体标记浓度为7μg/ml-25μg/ml，所述包被膜上包被的单克隆抗体浓度为0.5mg/ml-0.6mg/ml。
在第六方面，本发明提供了一种用于检测牛妊娠相关糖蛋白(PAG)的试纸卡，所述试纸卡包括本发明第五方面的试纸条、以及由上壳体和下壳体组成的卡扣(如图3所示)。
在第七方面，本发明提供了本发明第一方面或者第二方面的杂交瘤细胞、第三方面的单克隆抗体、或者第四方面的单克隆抗体组合在检测牛早期怀孕中的应用。
在一个实施方案中，本发明采用以双抗体夹心法为基础的免疫层析技术。具体地，将待检奶牛的血清或血浆样品加样到试纸条的样品垫上，在样品流动到结合垫时，血清或者血浆中如果存在PAG，则会与经标记(例如经胶体金或荧光标记)的PAG单克隆抗体(标记抗体)结合形成标记抗体-PAG抗原复合物。在样品继续流动至检测线T区时，此前形成的标记抗体-PAG抗原复合物会进一步与包被作为检测线T的PAG单克隆抗体(T线抗体)结合形成三者的复合物(标记抗体-PAG-T线抗体)，使T线显色。若血液中不存在PAG或含量低于该产品检测限，则T线不显色。
实施例
实施例1抗妊娠相关糖蛋白单克隆抗体的制备
1.免疫原制备及纯化：通过基因克隆，构建PAG重组原核表达载体以获得能够稳定表达PAG的工程菌。将诱导表达的菌液进行离心、超声破碎后，采用琼脂糖凝胶FF预装柱进行纯化，将纯化获得的PAG(SEQ ID NO:1)作为免疫原。
2.免疫程序：将纯化的PAG抗原与弗氏完全佐剂按1:1的比例充分混匀；选取健康的八周龄BALB/c小鼠，在其背部皮下注射100μg乳化后的PAG抗原；分别在首次免疫后第15、30天用弗氏不完全佐剂乳化等量蛋白，然后加强免疫两次，免疫部位及方法同首次免疫一致；融合前三天，通过小鼠尾静脉注射用生理盐水制备的100μg PAG抗原再次加强免疫一次。
3.细胞融合：将脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0按细胞数量1:5比例混合均匀，补加不完全RPMI-1640培养液至30ml，充分混匀，1200r/m离心10分钟，将上清液吸净，在手掌上轻击管底，使沉淀细胞松散均匀。在烧杯中加入37℃蒸馏水，将含有混合细胞的离心管置于水浴中，在90秒内加入37℃预热的50％PEG 1ml，边滴加边旋转离心管，随后静置1分钟，再在5分钟内加入37℃预热的不完全RPMI-1640培养液，先慢慢滴入，然后加快，不可将底部细胞冲起，稀释完PEG后1500r/min离心10分钟，倒掉上清。
将细胞沉淀重悬于20％胎牛血清的HAT选择培养液中，混合均匀，同时将制备好的饲养细胞按相同体积加入，再次混合均匀，用多道移液器加入96孔细胞培养板中，每孔200μl，在饱和湿度、5％CO2、37℃的条件下培养。
4.杂交瘤细胞株筛选：融合后的细胞每隔2-4天更换一次培养基，融合后7-8天时，开始观察细胞，标出有存活的杂交瘤细胞的细胞孔，待杂交瘤细胞长满孔底1/5以上时，取细胞上清100μl作为一抗，用PAG作为抗原包被酶标板，用间接ELISA对细胞上清进行检验，选择检测结果阳性且效价高的杂交瘤细胞。将通过间接ELISA筛选出的阳性孔中的杂交瘤细胞按照有限稀释法进行亚克隆，经过至少3次亚克隆，获得分泌单克隆抗体的细胞株。
5.腹水制备及抗体纯化：取7周龄BALB/c雌性小鼠，用石蜡油注入小鼠腹腔，0.5m1/只，7天后腹腔接种用无血清培养基稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞(来自步骤4)，间隔7天后，每天观察小鼠腹水产生情况，用16号针头采集腹水，将腹水离心，取上清。采用饱和硫酸铵沉淀法对抗体进行纯化，纯化后得到10株单克隆抗体(编号1-10)。
6.抗体亲和力测定：将纯化后的10株单克隆抗体分别进行胶体金标记，随后喷涂于玻璃纤维上制备金结合垫。将用PAG抗原包被的硝酸纤维素膜分别与10种金结合垫组装成试纸卡，滴加PBS于试纸卡的加样孔中，等待10分钟观察。根据PAG抗原包被位置的显色深度，排除无显色或显色较浅的抗体，选择显色深度较高的抗体(编号1、2、3、5、8和10)进行下一步配对筛选。
7.抗体配对组合的筛选：将编号为1、2、3、5、8和10的共6株抗体分别包被到硝酸纤维素膜上，并同时经胶体金标记后包被在玻璃纤维上制备金结合垫，将包含6株不同单克隆抗体的6种硝酸纤维素膜和6种金结合垫交叉组合制备试纸卡，通过正交试验筛选敏感性最高的组合。通过各组合试纸卡分别检测不同浓度的PAG抗原(10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml)，选择敏感性最高的配对组合用于产品的研发。下表1的实验结果表明，抗体1标金(结合垫)-抗体2包膜(包被膜)的组合在检测PAG抗原时敏感性最高，低于0.5ng/ml，满足产品研发需求，其中，所述抗体1为由保藏号为GDMCC No：61975的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，所述抗体2为由保藏号为GDMCC No：61976的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
表1.抗体配对组合的敏感性
Figure BDA0003388390230000081
Figure BDA0003388390230000091
8.抗体亚类鉴定：用IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit抗体亚类试剂盒对两株单抗进行亚型鉴定，两株单抗亚型均为IgG2b。
实施例2牛早孕(妊娠相关糖蛋白)胶体金检测试纸卡的制备和检测本实施例采用以双抗体夹心法为基础的胶体金免疫层析技术，在配种后第28天即可快速鉴别怀孕牛和空怀牛。若奶牛怀孕，其血液中的PAG达到较高水平，在样品流动过程中PAG与胶体金标记的PAG单克隆抗体结合，继续流动至检测线T区时与检测线T包被的PAG抗体结合形成三者的复合物(胶体金标记抗体-PAG-T线包被抗体)，T线呈现红色条带，且T线显色深度大于B线；若奶牛未怀孕，血液中不存在PAG或含量低于阈值，则T线不显色或者显色深度小于B线。质控线C显色表示该产品有效，质控线C不显色，表示产品无效。具体的实验操作如下。
1.胶体金溶液的制备：取1个洁净的圆底烧瓶，加入双蒸水，置于磁力加热搅拌器上，加热搅拌直至沸腾，加入1％的氯金酸溶液至终浓度为万分之一，继续加热至沸腾；随后按照1∶1.6的比例加入1％柠檬酸三钠溶液，继续加热煮沸10分钟左右，直至溶液呈现透亮的红色。室温(15℃-25℃)冷却后用双蒸水定容至原计划制备的体积(补偿蒸发损失)，由此获得胶体金溶液。
2.胶体金结合垫的制备：将胶体金溶液置于磁力搅拌器上，用0.2M K2CO3调节pH至7.5左右，搅拌状态下加入7μg/ml的PAG单克隆抗体1，室温搅拌30分钟；加入10％牛血清白蛋白(BSA)溶液至终浓度为1％，室温搅拌30分钟；溶液置4℃、10000r/min离心机离心30分钟，弃上清，沉淀用相同体积的金复溶液重悬，混匀。每30ml重悬液均匀涂布于25cm*30cm规格的玻璃纤维素膜上，放置在干净的纱网窗上，置湿度为10％-30％的室温干燥房干燥10小时，备用。
3.包被膜的制备：分别用包被液将羊抗鼠IgG多克隆抗体和PAG单克隆抗体2稀释至终浓度0.3mg/ml和0.5mg/ml，按照1μl/cm的量分别喷于硝酸纤维素膜的对应位置上，制备C线和T线，将膜置于37℃温箱烘干20小时，备用。
4.样品垫的制备：配制样品垫处理液，每30ml样品垫处理液均匀涂布于25cm*30cm规格的玻璃纤维素膜上，放置在湿度为10％-30％的室温干燥房烘干15小时-18小时，备用。
5.大板组装：将处理好的金结合垫裁成0.6cm*30cm规格；将处理好的样品垫裁成3.0cm*30cm规格；硝酸纤维素膜规格为2.5cm*30cm；吸水垫规格为2.6cm*30cm；PVC底板规格为7.8cm*30cm；将各组分按顺序组装于PVC底板上，具体组装方式参见图1。
6.试纸卡组装：将组装好的大板用切条机裁成3.85mm宽度，装入塑料卡壳内，组装好的卡壳连同干燥剂一包装入铝箔袋，封口。
7.胶体金试纸卡组成：该试纸卡由试纸条和卡扣组成，卡扣由上壳体和下壳体组成(参见图3)；试纸条组成包括PVC底板、硝酸纤维素膜、吸水垫、胶体金结合垫、样品垫，胶体金结合垫上包被有PAG单克隆抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被有由羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线及PAG单克隆抗体构成的检测线。
8.检测方法：
(1)待检样品处理：采集配种后28天的牛全血分离血清或血浆，可选择4℃静置过夜自然析出或置于离心机2000rpm/min-3000rpm/min，离心5分钟-15分钟，取上清备用。
(2)试剂的准备：打开包装袋，取出检测卡，平放于桌面待用。
(3)样品检测：将待检样品恢复至室温，混合均匀后用样品滴管逐滴滴加3滴(90μL左右)待检血清或血浆(EDTA、肝素钠)于检测卡的加样孔中，等待20分钟观察结果，超过30分钟后结果仅供参考。
(4)结果判定(参见图4)
1)怀孕：质控线C显色，且检测线T显色深度大于比色线B。
2)空怀：质控线C显色，且检测线T不显色或检测线T显色深度小于比色线B。
3)可疑：质控线C显色，且检测线T显色深度与比色线B相当，建议7天后重新采血复测。
4)无效：质控线C处不出现红色条带，判为无效，说明检测失误或检测卡失效，建议重新检测。
9.本发明的胶体金试纸卡与现有ELISA产品的比较实验结果
从牧场采集配种后28天的牛血液样品(1720份)，同时采用本发明的胶体金试纸卡和竞品ELISA试剂盒对分离后的血清和血浆样品进行检测并计算本发明的胶体金试纸卡与商业化ELISA试剂盒的符合率。
表2示出两种检测方法(在本申请中具体为胶体金试纸条或荧光试纸条与商业化ELISA)之间符合率的计算方法示意图。
表2.本发明试纸卡与商业化ELISA试剂盒符合率计算示意图
Figure BDA0003388390230000111
注：
“a”表示本发明试纸卡和商业化ELISA试剂盒的检测结果均为阳性的样品数量；
“b”为本发明试纸卡的检测结果为阴性、商业化ELISA试剂盒的检测结果为阳性的样品数量；
“c”为本发明试纸卡的检测结果为阳性、商业化ELISA试剂盒的检测结果为阴性的样品数量；
“d”为本发明试纸卡和商业化ELISA试剂盒的检测结果均为阴性的样品数量。
其中阳性符合率、阴性符合率以及总符合率的具体计算公式如下：
Figure BDA0003388390230000121
Figure BDA0003388390230000122
Figure BDA0003388390230000123
表3示出了本发明胶体金试纸条与商业化ELISA试剂盒之间的符合率。从表3中可以看出，本发明的胶体金试纸卡与商业化ELISA试剂盒相比，敏感性(即阳性符合率)达到了98.99％，特异性达到了98.07％(即阴性符合率)，总符合率达到了98.66％。
表3.胶体金试纸卡与商业化ELISA试剂盒符合率的计算结果
Figure BDA0003388390230000124
实施例3.牛早孕(妊娠相关糖蛋白)荧光检测试纸卡的制备和检测
本发明采用双抗体夹心法为基础的荧光免疫层析技术，在玻纤上包被荧光标记物，并在硝酸纤维素膜的检测线(T线)和质控线(C线)处分别包被相应抗体和多克隆抗体二抗。若奶牛怀孕，则样品中的PAG在流动过程中与荧光标记物结合形成复合物，并与检测线T包被的抗体结合产生荧光信号。当检测卡插入仪器检测时，仪器收集检测线(T线)和质控线(C线)上的荧光信号后，通过ID卡输入到仪器中的曲线方程换算，检测界面显示为阳性结果。
1.荧光微球溶液的制备：在500mL三口烧瓶中加入25.5mL(0.22mol)苯乙烯、3mL(0.03mol)甲基丙烯酸和220mL去离子水，在300r/min转速搅拌下升温至回流并恒温，稳定5分钟后，加入0.173g(0.64mmol)过硫酸钾引发聚合，反应2小时之后，多次离心、洗涤，即得白色羧基聚苯乙烯微球。称取单分散羧基聚苯乙烯种子微球0.1g于10mL 0.25％SDS水溶液中，超声5分钟，使微球分散均匀。将5mg Eu配合物溶于1mL CH2Cl2后，加入到种子微球的分散体系中，乳化机乳化，室温剧烈振摇3小时，30℃旋蒸，除去CH2Cl2，产物经离心分离后，用去离子水、乙醇进行多次离心洗涤(3000r/min，3分钟)，直至上清液呈无色，即得到相应颜色的荧光微球(荧光编码微球)。
2.荧光结合垫的制备：将荧光微球加入至1.5mL离心管中，用0.05M MES洗脱三次，再用100mg/ml的EDC和NHS进行活化，室温反应30分钟；再用0.05M MES洗脱三次，最后一次洗脱后弃上清，沉淀用1mL的0.05M MES重悬；加入25μg/mL的PAG单克隆抗体1，室温反应120分钟；用0.05M MES洗脱三次，最后一次洗脱后弃上清，沉淀用1mL的封闭液重悬，室温反应60分钟；溶液置4℃，15000r/min离心机离心20分钟，弃上清，沉淀用1mL的的荧光复溶液重悬，而后用荧光复溶液稀释至30mL。每30mL重悬液均匀涂布于25cm*30cm规格的玻璃纤维素膜上，放置在干净的纱网窗上，置于湿度为10％-30％的室温干燥房干燥10小时，备用。
3.包被膜的制备：分别用包被液将羊抗鼠IgG多克隆抗体和PAG单克隆抗体2稀释至终浓度0.6mg/ml和0.6mg/ml，按照1μl/cm的量分别喷于硝酸纤维素膜的对应位置上，制备C线和T线，将膜置于37℃温箱烘干20小时，备用。
4.样品垫的制备：配制样品垫处理液，将30ml样品垫处理液均匀涂布于25cm*30cm规格的玻璃纤维素膜上，放置在湿度为10％-30％的室温干燥房烘干15小时-18小时，备用。
5.大板组装：将处理好的荧光结合垫裁成0.6cm*30cm规格；将处理好的样品垫裁成3.0cm*30cm规格；硝酸纤维素膜规格为2.5cm*30cm；吸水垫规格为2.6cm*30cm；PVC底板规格为7.8cm*30cm；将各组分按顺序组装于PVC底板上，具体组装方式参见图2。
6.试纸卡组装：将组装好的大板用切条机裁成3.85mm宽度，装入塑料卡壳内，组装好的卡壳连同干燥剂一包装入铝箔袋，封口。
7.试纸卡组成：该试纸卡由试纸卡和卡扣组成，卡扣由上壳体和下壳体组成；试纸卡组成包括PVC底板、硝酸纤维素膜、吸水垫、荧光结合垫、样品垫，荧光结合垫上包被有PAG单克隆抗体-荧光标记物，硝酸纤维素膜上包被有由羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线及PAG单克隆抗体构成的检测线。
8.检测方法：
(1)待检样品处理：采集配种后28天的牛全血分离血清，4℃静置过夜自然析出或置于离心机4000rpm-5000rpm，离心30秒-60秒(血清或血浆均可)。
(2)试剂的准备：打开包装袋，取出检测卡，平放于桌面待用。
(3)可根据实际检测需求，选择以下不同的测试模式。
1)快速测试(适用于同时检测多个样本)：将待检样品恢复至室温，混合均匀后用移液枪吸取100μL待检血清或血浆(EDTA、肝素钠)于检测卡的加样孔中，开始反应，15分钟后将检测卡插入仪器内(加样孔方向朝内)，选择快速测试模式，点击开始测试，完成测试后，仪器界面显示检测结果，反应时间超过20分钟的检测结果仅供参考。
2)标准测试(适用检测单个样本)：将待检样品恢复至室温，混合均匀后用移液枪吸取100μL待检血清或血浆(EDTA、肝素钠)于检测卡的加样孔中，将检测卡插入仪器内(加样孔方向朝内)，选择标准测试模式，点击开始测试，仪器自动计时15分钟，15分钟后仪器界面显示检测结果。
(4)结果判读
1)阴性：空怀
2)弱阳：建议复检
3)阳性：怀孕
4)无效：检测卡插入方向错误或未进行点样操作
弱阳性分析：在奶牛怀孕初期，胚胎死亡是较为常见的现象，在胚胎死亡的早期，妊娠相关糖蛋白仍会在奶牛体内循环，因此建议弱阳性样本的奶牛，7-10天后重新取血进行复检，若复检后仍为弱阳性结果，则判定为空怀牛。
9.工艺参数:
PAG单克隆抗体最佳标记量为25μg/ml；包被液选择PB(0.02mol/L，pH值7.4)+2％海藻糖溶液；制备质控线的羊抗鼠IgG多克隆抗体的最佳包被浓度为0.6mg/ml，制备检测线的PAG单克隆抗体最佳包被浓度为0.6mg/ml；膜烘干时间选择于37℃烘干20小时；最佳加样量为100μl；最佳反应时间为15分钟。用该条件制备的检测荧光检测卡，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好的特点。
10.本发明的荧光试纸卡与现有ELISA产品的比较实验结果
从牧场采集配种后28天的牛血液样品(2450份)，同时采用本发明的荧光试纸卡和竞品ELISA试剂盒对分离后的血清和血浆样品进行检测并计算本发明的荧光试纸卡与商业化ELISA试剂盒的符合率。
荧光试纸卡与商业化ELISA试剂盒符合率的计算方法参见实施例2第9部分。结果示于表4。
表4.荧光试纸卡与商业化ELISA试剂盒符合率的计算结果
Figure BDA0003388390230000151
Figure BDA0003388390230000161
通过以上实验结果可以看出，本发明的荧光试纸卡与商业化ELISA试剂盒相比，敏感性(即阳性符合率)达到了98.39％，特异性达到了98.23％(即阴性符合率)，总符合率达到了98.33％。
可见，本发明的试纸条，不管是胶体金试纸条还是荧光试纸条，均具有与灵敏度很高的ELISA方法相当的检测结果，准确度很高。本发明的试纸条不需要专门的试验场地、设备和专业操作人员，因此非常适于基层以及中小型牧场使用。并且，作为一种快速检测手段，本发明的胶体金试纸条可以在相对短的时间里实现检测，这对于在牧场使用具有非常的意义。
                         序列表
<110>  深圳市易瑞生物技术股份有限公司
<120>  妊娠相关糖蛋白的单克隆抗体及其在牛早期怀孕检测中的应用
<160>  1
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  356
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
Met Lys Trp Leu Gly Leu Leu Gly Leu Val Ala Leu Ser Glu Cys Met
1               5                   10                  15
Val Ile Ile Pro Val Thr Gln Met Lys Ala Ile Arg Glu Thr Leu Trp
            20                  25                  30
Glu Arg Asn Leu Leu Thr Asn Phe Ser Glu Glu His Pro Cys Ser Leu
        35                  40                  45
Ser Gln Asn Ala Thr Asn Asp Gln Asn Ile Val Tyr His Pro Leu Arg
    50                  55                  60
Asn Tyr Lys Asp Leu Val Tyr Ile Gly Thr Ile Ala Ile Gly Thr Pro
65                  70                  75                  80
Pro Gln Glu Phe Arg Val Ile Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Leu Trp
                85                  90                  95
Val Pro Ser Ile His Cys His Ser Pro Ser Cys Leu Thr His Ser Leu
            100                 105                 110
Phe Asn Pro Arg Thr Ser Thr Thr Phe Lys Leu Leu Asn Asn Ile Ile
        115                 120                 125
Asp Leu Ile Tyr Ala Ser Gly Arg Ile Lys Gly Val Leu Gly Gln Asp
    130                 135                 140
Ile Ile Gln Val Met Trp Lys Pro Glu Ala Ala Gly Pro Gly Ser Asn
145                 150                 155                 160
Cys Cys Leu Gln Asn Arg Cys Arg Arg Ser Trp Arg Cys Leu Ser Phe
                165                 170                 175
Arg Lys Ala Pro Asn Gly Cys Arg Ser Ala Trp Lys Asp Ser Val Leu
            180                 185                 190
Gly Glu Thr Met Pro Leu Leu Thr Tyr Lys Leu Phe Val Ala Asn Ala
        195                 200                 205
Gly Arg Gly Leu Gly Cys Gly Phe Ala Ala Ser Leu Pro Met Lys Ser
    210                 215                 220
Arg Arg Phe Ile Met Val Ser Arg Arg Glu Asn Gly Ser Val Leu Met
225                 230                 235                 240
Phe Gly Gly Val Asp His Ser Tyr His Thr Gly Lys Leu Asn Trp Val
                245                 250                 255
Pro Val Ser Arg Thr His Tyr Trp Gln Ile Thr Ile Gly Arg Ile Ser
            260                 265                 270
Met Asn Gly Lys Leu Ile Ala Cys Lys Arg Gly Cys Gln Ala Ile Met
        275                 280                 285
Asp Thr Gly Thr Thr Phe Leu Leu Gly Pro Ser Arg His Ile Ala Lys
    290                 295                 300
Ile Gln Arg Leu Ile Arg Ile Arg Pro Phe Gly Ser Leu Gln Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Val Pro Cys Asn Ile Thr Ser Thr Leu Pro Pro Leu Ile Phe Thr Ile
                325                 330                 335
Lys Gly Ile Asp Tyr Pro Val Pro Ala Gln Ala Tyr Ile His Lys Met
            340                 345                 350
Arg Gly Gln Ser
        355

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞于2021年10月12日保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61975。
2.一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞于2021年10月12日保藏在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61976。
3.一种特异性结合牛妊娠相关糖蛋白(PAG)的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体由权利要求1或者权利要求2所述的杂交瘤细胞产生。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体为IgG2b亚型。
5.一种特异性结合牛妊娠相关糖蛋白(PAG)的单克隆抗体组合，其中所述抗体组合包括由保藏号为GDMCC No：61975的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体以及由保藏号为GDMCC No：61976的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
6.一种用于检测牛妊娠相关糖蛋白(PAG)的试纸条，所述试纸条包括样品垫、结合垫、包被膜和吸水垫，在所述结合垫上包被有经标记的由保藏号为GDMCC No：61975的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，并且在所述包被膜上包被有由保藏号为GDMCC No：61976的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为检测线。
7.根据权利要求6所述的试纸条，其中，所述试纸条为胶体金检测试纸条或荧光免疫检测试纸条，在所述试纸条为胶体金检测试纸条的情况下，所述包被在所述结合垫上的单克隆抗体经胶体金标记；在所述试纸条为荧光免疫检测试纸条的情况下，所述包被在所述结合垫上的单克隆抗体经荧光标记。
8.根据权利要求6-7中任一项所述的试纸条，其中，所述结合垫上包被的单克隆抗体标记浓度为7μg/ml-25μg/ml，所述包被膜上包被的单克隆抗体浓度为0.5mg/ml-0.6mg/ml。
9.一种用于检测牛妊娠相关糖蛋白(PAG)的试纸卡，所述试纸卡包括权利要求6-8中任一项所述的试纸条、以及由上壳体和下壳体组成的卡扣。
10.根据权利要求1或者2所述的杂交瘤细胞、根据权利要求3或者4所述的单克隆抗体、或者根据权利要求5所述的单克隆抗体组合在检测牛早期怀孕中的应用。
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