CN109295003A - 产生牛妊娠相关糖蛋白特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂盒及检测 - Google Patents

产生牛妊娠相关糖蛋白特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂盒及检测 Download PDF

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Abstract

本发明涉及产生牛妊娠相关糖蛋白特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株、单克隆抗体、试剂盒及检测,其为两株产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,由该杂交瘤细胞株产生的两种特异性单克隆抗体H4和G7,检测牛PAG的试剂盒及其检测方法,该细胞株保藏编号分别为CCTCC NO:C2018170、CCTCC NO:C2018171。该试剂盒包含上述的两种单克隆抗体,并且,以H4作为捕获抗体,以G7作为检测抗体进行检测。在检测奶牛体内PAG浓度时,与奶牛体内的天然PAG具有较好的识别能力和结合能力,并通过建立标准的双抗体夹心ELISA体系,能够准确检测标本中的牛PAG,并以此成功建立了检测牛PAG的双抗体夹心ELISA方法,对多种形式的PAG免疫检测试剂的进一步研究具有很大的意义。

Description

产生牛妊娠相关糖蛋白特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞 株、单克隆抗体、试剂盒及检测
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域,并且更具体地,涉及到产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,特异性单克隆抗体,检测牛PAG的试剂盒及其检测方法。
背景技术
早期妊娠判断是保证和提高奶牛繁殖率和产奶量的关键环节之一。在奶牛配种或人工受精后,都需要及时进行早期妊娠判断。空怀牛发现越早,就能越早进行第二次发情管理和配种,缩短配种间隔,从而提高妊娠率,避免或减少母牛早期妊娠缺失造成的各种损失。因此牛的早期妊娠诊断一直是畜牧业发展中值得高度关注的重要问题。
传统的牛早孕判断主要包括三种方法:直肠触诊法、超声波诊断法、血液或牛奶中孕酮检测法。直肠触诊法成本低,能马上得到结果,如果操作者的经验和水平高,该法的准确率可达95%以上,通常在配种后35~65天由兽医来进行首次检查,并在较多时候被作为诊断妊娠的标准。但是该方法对操作人员或者牧场兽医有较高技术要求,一般饲养人员难以掌握,而且该操作对早期胚胎具有一定的侵害性,有结果表明该操作与胚胎死亡之间存在明确的相关性。超声波诊断法与直肠触诊法相比危害较小,操作简便,准确率高。有研究资料表明在配种后21~25天检测,妊娠的敏感性和特异性分别是44.8%和82.3%;如果在配种后26~33天检测,其敏感性和特异性可分别提高至97.7%和87.7%。但由于B超仪器价格较高,体积较大使其难以在生产实践中广泛应用。基于放射免疫原理检测奶牛血液或牛奶中孕酮也可用于早期妊娠的判断,最佳的孕酮检测时间是配种后24天, 因为这时候进行检测能在一定程度上消除长发情间隔造成的假阳性,现场检测牛奶中的孕酮敏感性约为93.1%,但是其特异性只有39.3%,意味着这种情况下可能会将大量非孕牛误判为妊娠牛,造成损失。同时该方法涉及到的放射性污染等问题也为其大量推广应用带来了较大程度的限制。目前市场上有售的胶体金试纸条检测奶牛乳汁中孕酮来判断奶牛妊娠,与实际情况具有较好的符合率,但其判断标准很难确定,而且影响因素较多,因此通过检测孕酮判断妊娠的方法在国内仍未得到广泛的推广应用。
研究表明,奶牛妊娠后,胎盘滋养层双核细胞在与母体子宫上皮细胞融合时,会分泌释放出多种特征性的蛋白,部分蛋白可以作为牛早期妊娠的生物标志物,其中研究最为深入并被广泛认可的是妊娠相关糖蛋白(pregnancy associated glycoproteins,PAG)。PAG蛋白和胃蛋白酶、组织蛋白酶D等属于天冬氨酸脱氢酶家族,目前已知的PAG蛋白有22种。多项研究表明:奶牛体内PAG浓度从妊娠开始后缓慢上升,配种1个月后妊娠奶牛与非妊娠奶牛PAG浓度出现显著差别,奶牛妊娠的2~3月PAG浓度出现上升和下降的波动,不过其平均浓度仍在不断上升;奶牛妊娠的4~7月PAG浓度出现较快上升趋势;在分娩前PAG浓度达到最大值。这些结果为通过测定PAG浓度水平来判断奶牛妊娠提供了理论依据。
事实上,有文献表明,基于PAG特异性抗体建立的放射免疫分析法,对配种后35天的奶牛妊娠确诊率为93.03%,空怀率确认为97.90%,表明PAG完全可以作为牛妊娠诊断检测的标志物。随着技术的发展,以PAG为检测目标的检测方法越来越多,如美国IDEXXLaboratories等公司生产的牛怀孕检测试剂盒,基于固相酶联免疫吸附试验,可用于检测牛血清或EDTA抗凝牛血浆中PAG的检测。
任何免疫学检测方法的核心原料都是特异性抗原或抗体。目前试剂盒中所用的抗体多是以体外重组表达的PAG(如昆虫表达系统表达的PAG)作为免疫原免疫动物制备的。但是已有研究表面,奶牛体内的PAG存在高度异质性,而且存在较大程度的翻译后修饰,包括糖基化、磷酸化和乙酰化等等。体外重组表达的单一PAG很难代表奶牛体内PAG的免疫原性,其特异性抗体与奶牛体内天然PAG结合能力存在不确定性。
基于此,确保抗体与天然PAG的识别和结合能力,制备更多的PAG特异性抗体供业界应用,成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明针对上述问题,目的在于提供一种产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,特异性单克隆抗体,检测牛PAG的试剂盒及其检测方法,其能确保抗体与天然PAG的结合和识别能力。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
一方面,本发明的实施例公开了一种产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其特征在于,于2018年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:C2018170 。(H4)
另一方面,本发明实施例公开了一种单克隆抗体,其特征在于,由上述的杂交瘤细胞株产生。(H4)
第三方面,本发明实施例还公开了一种产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其特征在于,于2018年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO:C2018171。(G7)
第四方面,本发明实施例公开了一种单克隆抗体,其特征在于,由上述的杂交瘤细胞株产生。(G7)
第五方面,本发明实施例还公开了上述两种杂交瘤细胞株的制备方法,均由纯化的天然牛PAG蛋白免疫Balb/c小鼠后小鼠脾脏B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合后培养产生。
第六方面,本发明实施例还公开了一种试剂盒,其包含上述两种单克隆抗体。
进一步地,该试剂盒用于检测牛PAG。
第七方面,本发明实施例还公开了采用上述试剂盒检测奶牛体内PAG浓度的方法,采用保藏编号为CCTCC NO:C2018170的单克隆抗体作为捕获抗体,采用保藏编号为CCTCCNO:C2018171的单克隆抗体作为检测抗体。
进一步地,所述检测抗体采用HRP标记。
进一步地,所述HRP标记包括:将所述检测抗体与HRP按质量比1:1混合后,加入碳酸钠缓冲液,调节至预定的pH值后进行反应。。
本发明的有益效果是:
采用本发明公开的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体,在检测奶牛体内PAG浓度时,与奶牛体内的天然PAG具有较好的识别能力和结合能力,并通过建立标准的双抗体夹心ELISA体系,能够准确检测标本中的牛PAG,并以此成功建立了检测牛PAG的双抗体夹心ELISA方法,对多种形式的PAG免疫检测试剂的进一步研究具有很大的意义。
附图说明
图1为基于新制备的牛PAG单克隆抗体建立的ELISA检测方法检测奶牛血清稀释样本中PAG的剂量反应曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,下面结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实施例以纯化自产后牛胎盘子叶的天然牛PAG蛋白免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术进行细胞融合,利用间接ELISA法和细胞克隆化操作筛选出能稳定分泌牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,小鼠腹水诱生法制备的腹水经HiTrap IgGPurification HP亲和层析柱纯化,对所得的单克隆抗体进行效价测定。经筛选得到2株稳定分泌牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株H4(保藏编号为CCTCC NO:C2018170)和G7(保藏编号为CCTCC NO:C2018171),ELISA和免疫印迹鉴定结果表明2株单克隆抗体均具有较高的特异性。
另外,本发明实施例还建立了针对牛PAG的ELISA检测方法:以牛PAG特异性抗体H4为捕获抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记的G7为检测抗体,建立标准的双抗体夹心ELISA体系,能够准确检测标本中的牛PAG,并以此成功建立了检测牛PAG的双抗体夹心ELISA方法。
材料和来源
实验动物:Balb/C小鼠购自吉林医药学院实验动物中心(吉林省吉林市)。
细胞培养基和胎牛血清购自Gibco公司。
产后奶牛胎盘子叶取自重庆金霞养殖场。
HRP-山羊抗小鼠IgG购自北京中山公司。
抗体纯化柱和填料购自美国GE公司。
其余试剂均为国产分析纯试剂。
实施例1. 天然牛PAG蛋白的纯化
1.将产后奶牛胎盘子叶(取自重庆金霞养殖场)剪碎放入子叶匀浆缓冲液(10mM磷酸钠,150mM氯化钠,5mM EDTA,0.2mM PMSF,0.02%叠氮钠,pH 7.0)中,充分匀浆。
2.8000rpm,30min,离心去除沉淀,将上清转入50 kDa透析袋中,用40倍体积的透析缓冲液A(20mM Tris-HCl,1M氯化钠,1mM EDTA,0.2mM PMSF,0.02%叠氮钠,0.1mM β-巯基乙醇,pH 8.3)透析,中间换液两次。
3.用40倍体积的透析缓冲液B(20mM Tris-HCl,0.15M氯化钠,1mM EDTA,0.2mMPMSF,0.02%叠氮钠, pH 7.0)透析(目的在于降低盐离子强度,降低pH值),中间换液两次。
4.用40倍体积的透析缓冲液C(20mM柠檬酸钠,0.15M氯化钠,1mM EDTA,0.2mMPMSF,pH 5.0)透析,中间换液两次,准备上柱子纯化。
5.用0.45μm滤器过滤去除杂质。
6.用平衡缓冲液(20mM柠檬酸钠,0.15M氯化钠,pH 5.0)平衡胃蛋白酶抑制剂A填料(购自Sigma公司,目录号P2032),反复上样品提取物2~3次,用平衡缓冲液平衡10体积。
7.用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl,0.5M氯化钠,pH 7.5)洗脱PAG蛋白,收集蛋白用透析缓冲液B透析,然后浓缩至合适浓度。
8.用高盐/去垢剂洗液(20mM柠檬酸钠,1M氯化钠,1%Triton-100,pH 5.0)洗涤柱子重生填料。
9.用平衡缓冲液平衡柱子即可重复上样纯化。
10.将收集的牛PAG产物通过常规SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色进行纯度鉴定。
11.将收集的牛PAG产物通过BCA法(试剂购自碧云天生物技术有限公司)测定蛋白浓度。
12.将收集的牛PAG产物包被酶标板,应用牛PAG特异性抗体(购自IDEXXLaboratories)进行间接ELISA,鉴定其抗原性。
实施例2. 牛PAG特异性单克隆抗体的制备
1.牛PAG单克隆抗体的制备
将纯化的牛PAG与等量的弗氏完全佐剂乳化,抗原乳化采用双注射器互推法。乳化完成后,以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对4只8周龄左右的Balb/c小鼠进行基础免疫(100μg/ml,每只小鼠200 μL)。2周后,将牛PAG与等量的弗氏不完全佐剂乳化,以四肢皮下多点注射加腹腔注射途径对小鼠进行追加免疫(100 μg/ml,每只小鼠200 μL);2周后,再采用同样方式追加免疫一次,7天后处死小鼠取出小鼠脾脏,将脾细胞进行细胞融合。
融合过程为将脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以8:1混合,以聚乙二醇(PEG4000,购自Sigma公司)为融合剂。融合细胞悬于含小牛血清的HAT培养液(购自Gibco公司)中,并置于6% CO2中在37℃培养。
用间接ELISA法进行筛选。筛选时,以纯化的天然牛PAG为筛选原包被酶标版,封闭后加入各杂交瘤细胞培养上清,孵育后洗涤,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG(购自北京中山生物技术有限公司),孵育后洗涤,加入底物TAB(购自北京中山生物技术有限公司)显色。对检出的阳性克隆孔细胞采用有限稀释法进行细胞克隆化,并置于6% CO2中于37℃培养,直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止,即可进行杂交瘤细胞的扩大培养。
采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行抗体生产。取成年雌性Balb/c小鼠,腹腔注射液体石蜡0.5 mL。1周后,用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀,并将细胞数调至4×105个/mL,每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5 mL杂交瘤细胞。10~14天后收集腹水。
(2) 牛PAG单克隆抗体的纯化
收集腹水后对其进行亲和纯化,具体方案简述如下。配制抗体纯化所需缓冲液(所用试剂均为分析纯):结合缓冲液 (A液)20 mmol/L磷酸钠,0.8 mol/L (NH4)2SO4,pH 7.5;洗脱缓冲液 (B液) 20 mmol/L 磷酸钠,pH 7.5;再生缓冲液(C液) 20 mmol/L磷酸钠,pH 7.5,并按体积比30%加入异丙醇。在含有单克隆抗体的腹水中加入硫酸铵,使其终浓度与A液中硫酸铵浓度一致,0.45 μm滤膜过滤等待上样;选用HiTrap IgG Purification HP柱(购自GE Healthcare)接入AKTA prime蛋白纯化仪,先后A、B液和C液对柱子进行充分洗涤;用A液进行充分平衡后, 将准备的样品从A管上样,上样后用A液平衡柱子,去除杂蛋白,再用B液洗脱纯化柱,收集洗脱峰;调节洗脱蛋白的pH至7.0-8.0,将抗体分装冷冻于-20℃保存;用Regeneration Buffer使填料进行再生,然后用Binding Buffer进行平衡。
(3) ELISA鉴定抗牛PAG单克隆抗体
将纯化的重组牛PAG抗原和相关对照抗原用包被稀释液稀释至5μg/mL,ELISA条板每孔加入100μL,4℃包被过夜。次日取出酶标板弃抗原,洗板。将待鉴定单克隆抗体作1:1000,1:2000,1:4000,1:8000,1:16000......,按100μL/孔加入对应条孔中,另作空白及阴阳对照孔。37℃孵育1h,洗板,加入HRP标记山羊抗小鼠IgG(酶标二抗,1:3000),按100μL/孔加入对应条孔中,37℃孵育40 min。弃液,洗板,拍干,加入底物液100 μL/孔,避光显色10 min,加入终止液50 μL/孔。在450 nm 处测定吸光度值。
(4) 抗牛PAG单克隆抗体的免疫印迹鉴定
①将蛋白质分子量Marker 3 μL、牛PAG抗原20 μL、相关对照抗原20 μL行SDS-PAGE。
②电泳结束后,取下凝胶,置于转印缓冲液中平衡10 min。
③将0.22 μm PVDF膜先用无水甲醇处理20 s,再用ddH2O洗涤5 min。然后再浸入转印缓冲液超过5 min。同时将滤纸浸入转印缓冲液中。
④转膜:从下至上依次排列:滤纸—PVDF膜—胶—滤纸,排出气泡,放入转膜仪,18V恒压电转移1.5 h。
⑤转膜完成后,在膜上可见清晰蛋白marker,ddH2O清洗两遍,TBST洗5 min。将转移膜置于封闭液中,室温封闭2 h。
⑥弃去封闭液,用1×TBST漂洗膜3次,每次15 min。
⑦加入以1:1000稀释的纯化抗体,4℃孵育过夜。1×TBST漂洗膜3次,每次15 min。
⑧加入已稀释到1:10000的HRP-羊抗小鼠IgG抗体,37℃孵育3 h。
⑨1×TBST洗涤3次,每次15 min。
⑩用化学发光显色,显影定影后,观察分析结果并摄像。在牛PAG对应分子量处可见抗牛PAG单克隆抗体结合清晰条带。
实施例3. 双抗体夹心ELISA法检测牛PAG
(1)HRP标记抗体(所用试剂均为分析纯)
本法是以NaIO先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与抗体蛋白的氨基相结合。此法稳定易行,所获酶标记抗体的产率较高,具体步骤如下:
①HRP酶的准备:称取10 mg HRP酶,加2 mL纯水配置为5 mg/ml的HRP液体,按照每mgHRP酶加入34 µL计算,加340 µL NaIO4,4℃避光放置,1 h后,按照每mg HRP酶加入250 µL的量加入乙二醇250 µL,避光放置4℃,30 min后转入透析袋中,用1 mM醋酸缓冲液(pH 4.0~4.4)透析过夜,期间至少换液2次,要求避光。
②抗体的准备:0.01 M的PBS缓冲液进行4℃透析过夜,并测定蛋白浓度。
③标记:抗体与HRP酶按1:1(质量比)混合,加入1 mol/L Na2CO3缓冲液(1:80),调解反应的pH为9.5,25℃反应2~3 h。
④终止:新鲜配制0.1 mol/L NaH4B(4 mg/mL),按照每mg HRP酶加入47 μL。4℃放置2 h后,转入透析袋。用0.01 mol/L PBS缓冲液(pH 7.0~7.2)透析过夜,期间至少换液两次,避光。
⑤分装保存:标记好的抗体用棕色EP管分装,并测定抗体效价。-20℃避光保存。
(2) 抗体配对及临床样本的检测
①标本收集:
从重庆金霞养殖场收集奶牛标本,取回过程中用冰袋储存,保持标本新鲜,做好标记分装于1.5 ml Ep管中,-80℃保存,记录相关信息。
②检测线性分析:
选取单克隆抗体H4作为捕获抗体,酶标单克隆抗体G7作为检测抗体,6份高值阳性奶牛血清混合物为测定对象,检测方法如下:a. 包被酶标板:用包被液将抗体稀释为5 μg/mL,每孔加100 μL, 4℃包被过夜。b. 将包被过夜的酶标板洗3遍,甩干。c. 封闭:每孔加封闭液350 μL,37℃孵育1 h,洗涤3遍,甩干。d. 用抗体稀释液将奶牛血清混合物进行倍比稀释,将稀释标本每孔加100 μL,第一孔为空白对照,做标准曲线。e. 洗板3遍,甩干。f. 将相对应的酶标二抗以1:5000稀释,每孔加入100 μL,37℃孵育30 min。g. 洗板5遍,甩干。h.每孔加入100 μL底物显色液,室温避光显色5 min。i. 每孔加入50 μL终止液,450nm处读取吸光度值,以稀释倍数为横坐标,相应吸光度为纵坐标,绘制剂量反应曲线,如图1所示。
③牛血清样本检测
以45份奶牛血清为检测对象,按照上述过程进行样本检测,反应终止后测定450 nm处的吸光度,测定孔吸光度与阴性对照孔吸光度比值(S-N)超过0.3判断为阳性,S-N值小于或等于0.3的判断为阴性。同时应用IDEXX公司的PAG ELISA检测试剂盒检测,按照说明书操作,判断各血清标本的阴性或阳性。统计分析比较两种方法的分析结果,见表1所示的基于新制备的牛PAG单克隆抗体建立的ELISA检测方法检测奶牛血清标本与市售的PAG检测试剂盒(购自IDEXX)检测奶牛血清标本结果比较。
表1
综上所述,本发明实施例制备出了能产生牛PAG特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株,即从牛产后胎盘子叶纯化获得天然的牛PAG蛋白;用纯化的牛PAG蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,通过改良杂交瘤技术进行细胞融合,利用间接ELISA法进行筛选,克隆化筛选出能稳定分泌牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株;然后采用小鼠腹水诱生法生产单克隆抗体,并进行抗体效价和特异性鉴定。
另外本发明实施例还建立了牛PAG的ELISA检测体系:利用已制备的牛PAG特异性单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体,在捕获抗体上标记辣根过氧化物酶(HRP),以牛PAG作为目标抗原,进行抗体配对试验,经过优化ELISA反应条件,获得能检测牛PAG的抗体配对;以此为基础建立了检测牛PAG的双抗体夹心ELISA方法。
本发明通过杂交瘤技术,制备了杂交瘤细胞株H4和G7,分泌牛PAG特异性单克隆抗体。两株抗体能进行配对和检测牛PAG蛋白,初步建立了检测牛PAG的双抗体夹心ELISA方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并非用来限定本发明的实施范围;如果不脱离本发明的精神和范围,对本发明进行修改或者等同替换,均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。

Claims (10)

1.一种产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其特征在于,于2018年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:C2018170 。
2.一种单克隆抗体,其特征在于,由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生。
3.一种产生牛PAG特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其特征在于,于2018年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为 CCTCC NO:C2018171。
4.一种单克隆抗体,其特征在于,由权利要求3所述的杂交瘤细胞株产生。
5.权利要求1或3所述的杂交瘤细胞株的制备方法,其特征在于,由纯化的天然牛PAG蛋白免疫Balb/c小鼠后小鼠脾脏B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0融合后培养产生。
6.一种试剂盒,其特征在于,包含权利要求2所述的单克隆抗体和权利要求4所述的单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,用于检测牛PAG。
8.一种采用权利要求6所述的试剂盒检测奶牛体内PAG浓度的方法,其特征在于,采用权利要求2所述的单克隆抗体作为捕获抗体,采用权利要求4所述的单克隆抗体作为检测抗体。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述检测抗体采用HRP标记。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述HRP标记包括:将所述检测抗体与HRP按质量比1:1混合后,加入碳酸钠缓冲液,调节至预定的PH值后进行反应。
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