CN115785231A - 一种鉴别新冠突变型抗原的抗体、试剂及方法 - Google Patents

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CN115785231A CN202210022818.8A CN202210022818A CN115785231A CN 115785231 A CN115785231 A CN 115785231A CN 202210022818 A CN202210022818 A CN 202210022818A CN 115785231 A CN115785231 A CN 115785231A
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刘春艳
张翼
易嘉乐
何志强
钟振宇
李瑞净
秦汤
刘旭霞
罗沛
吴仁贞
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Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
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Abstract

本发明提供了一种鉴别新冠突变型抗原的抗体、试剂及方法。利用本发明抗体、试剂或方法能够快速、准确地鉴定或鉴别新冠突变型抗原，且检测效率高、成本低。

Description

一种鉴别新冠突变型抗原的抗体、试剂及方法
技术领域
本发明属于蛋白检测领域。更具体地，涉及一种鉴别新冠突变型抗原的抗体、试剂及方法。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒科，为不分节段的单股正链RNA病毒。它编码4种结构蛋白(S、E、M和N蛋白)，其中，N蛋白是病毒粒子的核心成分，其蛋白全长419个氨基酸，大小为43-50kDa。N蛋白有三个相对保守的结构域，其中一域可与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用，与病毒基因组复制和调节细胞信号通路有关。N蛋白是一个磷酸化蛋白，磷酸化能够调节N蛋白的构象，增强与病毒蛋白的构象，增强与病毒RNA的亲和力。在核衣壳包装过程中，N蛋白可与M蛋白相互作用，促进核衣壳包装成病毒粒子。
N抗原检测呈阳性可作为新冠早期感染的直接证据。然而，新冠病毒N蛋白上出现的各种突变意味着抗原逃逸检测抗体对的几率上升，导致试剂盒面临无法检出突变株病毒的风险。因此，开发一种能够特异性结合突变型N蛋白的单克隆抗体以及鉴别新冠突变株的试剂盒具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别或鉴定新冠突变型抗原的抗体、试剂及方法。
在一些实施方案中，本发明可以包括下述一项或多项：
一种多肽，其中，所述多肽包含SEQ ID NO:6所示的新冠突变型抗原的N蛋白第365-419位氨基酸片段或所述多肽包含SEQ ID NO:7所示的新冠突变型抗原的N蛋白第371-383位氨基酸片段。
本发明还提供了包含所述多肽的免疫原、及相关的杂交瘤细胞。
本发明的另一目的是提供了一种抗体，其中，所述抗体结合SEQ ID NO:6所示的氨基酸片段，即新冠突变型抗原的N蛋白第365-419位氨基酸片段。
本发明还提供了一种抗体，所述抗体结合SEQ ID NO:7所示的氨基酸片段，即新冠突变型N蛋白第371-383位氨基酸片段。
本发明还提供了一种抗体组合，所述抗体组合包括抗体1和抗体2，所述抗体1，所述抗体2结合抗体1结合片段以外的片段；所述抗体1结合365-419aa(SEQ ID NO:6)或371-383aa(SEQ ID NO:7)。
可选地，所述抗体2结合新冠病毒N蛋白第1-43、85-95、44-180或248-364位氨基酸片段。
进一步可选地，所述抗体组合还包括抗体3，所述抗体3结合第1-43、85-95、44-180或248-364位氨基酸片段。
可选地，当抗体2结合新冠病毒N蛋白第44-180位氨基酸片段时，抗体3也可以是结合新冠病毒N蛋白第44-180位氨基酸片段的抗体；
可选地，当抗体2位结合其它片段的抗体时，所述抗体3与抗体2的结合片段不同。
所述新冠病毒N蛋白对应区段的序列如下：
1-43aa(SEQ ID NO:2)
44-180aa(SEQ ID NO:3)
248-364aa(SEQ ID NO:5)
85-95aa(SEQ ID NO:8)
本发明还提供了一种鉴别新冠突变型抗原的检测试剂，其中，所述试剂包括上述抗体或上述抗体组合。
本发明还提供了一种鉴定或鉴别新冠突变型抗原的免疫层析试剂。
本发明还提供了一种鉴定或鉴别新冠突变型抗原的方法。
利用本发明抗体、试剂或方法能够快速、准确地鉴别新冠突变型抗原，且检测效率高、成本低，检测特异性和灵敏度高、与新冠突变型抗原反应活性好。
具体实施方式
本发明涉及一种多肽，其中，所述多肽包含SEQ ID NO:7所示的新冠突变型抗原的N蛋白第371-383位氨基酸片段。
本发明涉及一种多肽，其中，所述多肽包含SEQ ID NO:6所示的新冠突变型抗原的N蛋白第365-419位氨基酸片段。
本发明还提供一种免疫原，其中，所述免疫原包含如上所述的多肽。
本发明还提供一种杂交瘤细胞，其中，所述杂交瘤细胞由如上所述的免疫原免疫得到的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到。
在一些实施方式中，本发明还提供了一种抗体，其中，所述抗体结合SEQ ID NO:6所示的氨基酸片段；在一些实施方式中，所述抗体结合SEQ ID NO:7所示的氨基酸片段。在一些实施方式中，所述抗体不结合新冠病毒N蛋白第377位未突变的抗原
在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。
在一些实施方式中，本发明还提供了一种抗体组合，所述抗体组合包括抗体1和抗体2，所述抗体1为如上所述的抗体，所述抗体2结合抗体1结合片段以外的片段。
在一些实施方式中，所述抗体2结合新冠病毒N蛋白第1-43、85-95、44-180或248-364位氨基酸片段；在一些实施方式中，所述抗体2结合新冠病毒N蛋白第85-95位氨基酸片段。
在一些实施方式中，抗体结合新冠病毒N蛋白对应的氨基酸片段是指抗体能够结合所述氨基酸片段，但该氨基酸片段不一定是最小结合片段。
在一些实施方式中，所述抗体组合用于鉴定新冠突变型抗原，所述突变型抗原包含新冠病毒N蛋白第377位突变为非天冬氨酸的其它氨基酸。以新冠突变株以B.1.617.2为例，其N蛋白携带D63G+R203M+D377Y位点突变；其它例如B.1.617.1的N蛋白携带R203M+D377Y位点突变；例如B.1.617.3的N蛋白携带P67S+R203M+D377Y位点突变；例如B.1.617的N蛋白携带R203K+D377Y位点突变；例如Delta-plus的N蛋白携带D63G+R203M+G215C+D377Y位点突变。在一些实施方式中，鉴别的“突变型抗原”包括N蛋白携带D377Y位点突变的谱系和/或亚型，即第377位氨基酸由天冬氨酸突变为酪氨酸。
在一些实施方式中，当待测样品中含所述突变型抗原(即N蛋白携带D377Y位点突变)时，抗体1和抗体2能以双抗体夹心的方式检测所述突变型抗原；在一些实施方式中，当待测样品中不含所述突变型抗原(即N蛋白D377位点为天冬氨酸)时，抗体1不与之发生结合。
在一些实施方式中，所述抗体组合可以进一步包含抗体3，所述抗体3结合新冠病毒N蛋白第1-43、85-95、44-180或248-364位氨基酸片段；在一些实施方式中，当抗体2结合新冠病毒N蛋白第44-180位氨基酸片段时，抗体3也可以是结合新冠病毒N蛋白第44-180位氨基酸片段的抗体；在一些实施方式中，当抗体2位结合其它片段的抗体时，所述抗体3与抗体2的结合片段不同。
在一些实施方式中，当待测样品中含所述突变型抗原(即N蛋白携带D377Y位点突变)时，抗体1和抗体2、抗体2和抗体3均能以双抗体夹心的方式检测所述突变型抗原；在一些实施方式中，当待测样品中不含所述突变型抗原(即N蛋白D377位点为天冬氨酸)时，抗体1不与之发生结合、但抗体2和抗体3仍能以双抗体夹心的方式检测样品中的抗原；鉴于此，完成对突变型抗原的N蛋白是否携带D377Y位点突变的鉴别。
在一些实施方式中，本发明还提供了一种鉴别新冠突变型抗原的检测试剂，其中，所述试剂包括如上所述的抗体或如上所述的抗体组合。本发明所述试剂应做广义理解，其主要指承载免疫检测相关试剂的工具；在一些实施方式中，还可以进一步包括一些配套试剂，其可以是例如工作液，但不限于此。
在一些实施方式中，本发明还提供了一种鉴别新冠突变型抗原的免疫层析试纸，所述免疫层析试纸包括第一检测线和第二检测线，抗体2作为标记抗体，所述第一检测线上包被抗体1、所述第二检测线上包被抗体3；或所述第一检测线上包被抗体3、所述第二检测线上包被抗体1。
在一些实施方式中，一种鉴别新冠突变型抗原的免疫层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置有第一检测线和第二检测线，所述结合垫上设置有抗体2，所述第一检测线上包被抗体1、所述第二检测线上包被抗体3；或所述第一检测线上包被抗体3、所述第二检测线上包被抗体1，其中抗体1，抗体2和抗体3独立地如上述所定义，可选地实施方式中，所述硝酸纤维素膜上还设置有质控线。
在一些实施方式中，可以使用任何适当的体外测定，基于细胞的测定，体内测定，动物模型等检测本发明抗体的效果如结合活性和/交叉反应性。在一些实施方式中，所述测定可以包括例如ELISA，FACS结合测定，Biacore，竞争性结合测定等。在一些实施方式中，例如在ELISA中表征本发明的抗体与抗原(抗原肽)结合的反应性，例如通过过氧化物酶标记的ELISA法读取405nm处的反应值≧0.5确定为有较好反应性，可用于免疫测定。
在一些实施方式中，其中所述抗体任选地用可检测的标记物标记。在一些实施方式中，可检测的标记例如胶体金、放射性标记、发光物质、有色物质、酶，例如荧光标记、发色团标记、电子致密标记，例如放射性同位素、荧光团、罗丹明及其衍生物、荧光素酶、荧光素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记。
在一些实施方式中，其中所述抗体任选地结合至固相和/或结合配偶体。在一些实施方式中，固相可以是例如磁性颗粒，胶乳粒子，微量滴定板，硝酸纤维素膜，玻璃纤维素膜，尼龙膜或微流控芯片；结合配偶体可以是例如生物素/抗生物素蛋白，生物素/链霉抗生物素蛋白。
在一些实施方式中，一种鉴别新冠突变型抗原的免疫层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置有第一检测线和第二检测线，所述样品垫上包被有生物素化的抗体1，所述结合垫上设置有抗体2，所述第一检测线上包被有抗体3，所述第二检测线上包被有亲和素，其中抗体1，抗体2和抗体3独立地如上述所定义，可选地实施方式中，所述硝酸纤维素膜上还设置有质控线。
在一些实施方式中，本发明还提供了一种鉴别新冠突变型抗原的方法，其中，所述方法包括使用如上所述的检测试剂或如上所述的免疫层析试剂/试纸，与待测样品接触。
在一些实施方式中，当检测线1和检测线2同时显色，则判定为样品中包含新冠病毒N蛋白第377位突变的抗原；当检测线2显色，检测线1不显色时，则判定为样品中包含新冠病毒N蛋白第377位未突变的抗原。
在一些实施方式中，待测样品选自离体的唾液、血液、血浆、血清、咽拭子，鼻拭子、尿液等。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1新冠N蛋白单克隆抗体的制备
1、免疫动物
取8～12周龄与骨髓瘤细胞同种系的BALB/c小鼠，以含蛋白质100μg/只的2019-nCoV N蛋白突变抗原(SEQ ID NO:1，以下命名为Dx-nCoVN)与等量福氏完全佐剂充分混匀，注入小鼠腹腔内，每隔2周100μg/只的Dx-nCoVN与等量福氏不完全佐剂充分混匀，多次注入小鼠腹腔内加强免疫。经检测小鼠血清(间接ELISA法)，滴度在1∶2000以上者可用于融合，融合前3天经小鼠腹腔内再次加强免疫，剂量为50μg/只。
2、饲养细胞的制备
以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI1640筛选培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，150μL/孔，37℃，5％CO2培养过夜。
3、免疫脾细胞的制备
小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。
4、细胞融合
(1)取40mL HAT培养液，15mL DMEM无血清培养液和1mL 50％PEG(M12000)分别置于37℃水浴中预温；
(2)分别取小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(菲鹏生物股份有限公司保存)(2～5×107)、上述免疫脾细胞(108)悬液加入50mL离心管中混匀，并加DMEM无血清培养液至40mL。离心10分钟，倒尽上清液，混匀；
(3)将离心管置于37℃预温的水中，取0.7mL预温的50％PEG溶液，静置90秒钟。立即滴加37℃15mL预温的无血清培养液；
(4)补加DMEM无血清培养液至40mL，离心10分钟，倒尽上清液。加40mL含15％～20％胎牛血清的HAT培养液。用吸管混匀，滴加到已含有饲养细胞的4块96孔细胞培养板的小孔中，每孔2滴，置37℃、7％CO2的培养箱中培养。
5、杂交瘤细胞的选择培养
免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞，经PEG处理后，形成多种细胞成分的混合体，其中包括未融合的骨髓瘤细胞和免疫脾细胞；骨髓瘤细胞的共核体和免疫脾细胞的共核体，以及骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的异核体。仅后者才能形成杂交瘤细胞。为此，在这多种细胞混合体中必须除去未融合的细胞和同种融合的共核体，并选择出真正的杂交细胞。因此，在细胞融合后第1，3，5，7天用前述的HAT培养液换液培养。
6、特异性抗体的检测及杂交瘤细胞克隆化
吸取每个培养孔的上清液，用间接ELISA法检测出培养液中含特异性识别Dx-nCoVN的抗体的培养孔。采用间接ELISA法鉴定细胞培养上清的交叉反应性，用Dx-nCoVN包被96孔板，封闭，加入杂交瘤细胞培养液上清孵育，加二抗，测405nm反应值，挑选反应值(0.5以上)比较高的细胞株制备抗体进行下一轮筛选实验。筛选得到以下有较好反应性的抗体。
实施例2 5H6、9D1抗体的检测特异性
将2019-nCoV野生型N蛋白重组抗原以及携带以下位点的突变型N蛋白全长抗原分别包被微孔，以PBS+20％NBS为稀释液，稀释单抗为一抗浓度到1ug/ml，以羊抗鼠IgG-HRP为二抗，鉴定抗体的反应情况，反应情况如下：
表1
Figure BDA0003463131380000071
以上结果表明5H6以及9D1两株抗体对野生型抗原反应性较弱，但是对N蛋白携带D377Y位点突变的突变型抗原反应性较强，说明此两株抗体特异性识别携带该位点突变的突变型抗原。
实施例3抗体结合片段的鉴定
采用不同片段的Dx-nCoVN抗原分别包被微孔，以PBS+20％NBS为稀释液，稀释单抗为一抗浓度到1ug/ml，以羊抗鼠IgG-HRP为二抗，依据单抗对不同抗原的反应情况来确定单抗片段，具体数据如下：
表2
抗体编号 5H6 9D1
1-43aa(SEQ ID NO:2) 0.0057 0.0073
44-180aa(SEQ ID NO:3) 0.0094 0.0102
181-247aa(SEQ ID NO:4) 0.0124 0.0133
248-364aa(SEQ ID NO:5) 0.0108 0.0098
365-419aa(SEQ ID NO:6) 2.3594 2.3061
371-383aa(SEQ ID NO:7) 2.2543 2.2765
以上结果表明，5H6、9D1两株抗体识别结合突变抗原的365-419aa或371-383aa。
实施例4抗体配对以鉴定突变型抗原
以2019-nCoV野生型N蛋白重组抗原作为免疫原筛选得到结合不同片段的N抗体，参见实施例3鉴定抗体结合片段，得到如下抗体：例如3B8及6D9结合1-43aa，7R1及5S7结合85-95aa，6I3及5C3结合44-180aa，1B5及2F4结合248-364aa；以上抗体均可购自菲鹏生物。
1、新冠N抗体标记：取5ml浓度为4/万的胶体金，加入30-40ul 0.2M K2CO3，搅拌5min，加入新冠N标记抗体(所加抗体体积＝50μg/抗体浓度)，搅拌5min，再加入50ul 10％BSA封闭终止标记；离心10000rpm，7min，去上清，沉淀用金子复溶液复溶，最后用金子复溶液定容到0.5ml(即1/10胶体金溶液体积)。
2、配制金子工作液：用金子复溶液将新冠N标记抗体浓缩金以20％的稀释比例配制成金子工作液，铺于玻璃纤维上。
3、制备干燥好的金子：将铺好的金子放入冻干机冻干(1-2h)或者放37℃干燥房干燥过夜。
4、新冠N抗体包被：将硝酸纤维素膜与PVC底板组装好备用；将结合野生型N蛋白重组抗原的抗体例如3B8、7R1、6I3，或者1B5稀释至1.0-1.5mg/ml，用喷金画膜仪在NC膜上均匀地划T1线；再将筛选得到的特异性结合突变型抗原的5H6，或者9D1抗体稀释至1.0-1.5mg/ml，用喷金画膜仪在NC膜上均匀地划T2线；放37℃恒温箱60min。
5、制备金标条：用切条机将金标条按需要的宽度切条，组装后加样进行检测。
6、检测
(1)质控品：携带以下位点的突变型N蛋白全长抗原，使用PBS稀释到不同浓度进行抗体配对试验；
(2)检测方法：根据色卡比对，肉眼判读显色读值。
7、结果：
表3-1以7R1为标记抗体检测携带D63G+R203M+D377Y的抗原
Figure BDA0003463131380000091
表3-2以7R1为标记抗体检测携带P67S+R203M+D377Y的抗原
Figure BDA0003463131380000092
表3-3以5S7为标记抗体检测携带R203K,G204R，D377Y(即Dx-nCoVN抗原)
Figure BDA0003463131380000093
Figure BDA0003463131380000101
表3-4以3B8为标记抗体检测携带R203K,G204R，D377Y(即Dx-nCoVN抗原)
Figure BDA0003463131380000102
表3-5以6I3为标记抗体检测携带R203K,G204R，D377Y(即Dx-nCoVN抗原)
Figure BDA0003463131380000103
表3-6以2F4为标记抗体检测携带R203K,G204R，D377Y(即Dx-nCoVN抗原)
Figure BDA0003463131380000104
Figure BDA0003463131380000111
表3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6中，字母C后的数字代表显色，数字越大，显色越弱(活性越低)。
当待测样品中含N蛋白携带D377Y位点突变的突变型抗原时，T1线、T2线均显色；以下试验当待测样品中不含该类型突变抗原时的情况。
表4-1以7R1为标记抗体检测携带D63G的抗原
Figure BDA0003463131380000112
表4-2以7R1为标记抗体检测携带R203K+G204R+G212V的抗原
Figure BDA0003463131380000113
表4-3以7R1为标记抗体检测野生型抗原(N hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019)
Figure BDA0003463131380000114
表4-1、4-2、4-3中，字母B代表不显色(未检出)，字母C后的数字代表显色，数字越大，显色越弱(活性越低)。
利用SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7作为免疫原中的抗原性部分，免疫获得的抗体，均能结合SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7，这些抗体同样能用于鉴定携带D377Y突变的抗原。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表如下：
SEQ ID NO:1
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSKRTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKAYETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA
SEQ ID NO:2
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQ
SEQ ID NO:3
GLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGS
SEQ ID NO:4
QASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSKRTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVT
SEQ ID NO:5
KKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFP
SEQ ID NO:6
PTEPKKDKKKKAYETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA
SEQ ID NO:7
DKKKKAYETQALP
SEQ ID NO:8
GYYRRATRRIR
SEQUENCE LISTING
<110> 广东菲鹏生物有限公司
菲鹏生物股份有限公司
<120> 一种鉴别新冠突变型抗原的抗体、试剂及方法
<130> 110
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 419
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Lys Arg Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Tyr Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 2
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln
35 40
<210> 3
<211> 137
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His
1 5 10 15
Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn
20 25 30
Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr
35 40 45
Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg
50 55 60
Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr
65 70 75 80
Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu
85 90 95
Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala
100 105 110
Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe
115 120 125
Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser
130 135
<210> 4
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn
1 5 10 15
Ser Thr Pro Gly Ser Ser Lys Arg Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly
20 25 30
Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn
35 40 45
Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln
50 55 60
Thr Val Thr
65
<210> 5
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr
1 5 10 15
Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro
20 25 30
Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly
35 40 45
Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala
50 55 60
Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser
65 70 75 80
Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp
85 90 95
Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala
100 105 110
Tyr Lys Thr Phe Pro
115
<210> 6
<211> 55
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Tyr Glu Thr Gln
1 5 10 15
Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro
20 25 30
Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser
35 40 45
Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala
50 55
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人工序列
<400> 7
Asp Lys Lys Lys Lys Ala Tyr Glu Thr Gln Ala Leu Pro
1 5 10

Claims (11)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽包含SEQ ID NO:7所示的新冠突变型抗原的N蛋白第371-383位氨基酸片段。
2.一种多肽，其特征在于，所述多肽包含SEQ ID NO:6所示的新冠突变型抗原的N蛋白第365-419位氨基酸片段。
3.一种免疫原，其特征在于，所述免疫原包含权利要求1或2所述的多肽。
4.一种杂交瘤细胞，其特征在于，所述杂交瘤细胞由权利要求3所述抗原原免疫得到的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体结合权利要求1或2所述的多肽；
可选地，所述抗体不结合新冠病毒N蛋白第377位未突变的抗原。
6.一种抗体组合，其特征在于，所述抗体组合包括抗体1和抗体2，所述抗体1为权利要求5所述的抗体，所述抗体2结合抗体1结合片段以外的片段；
优选地，所述抗体2结合新冠病毒N蛋白第1-43、85-95、44-180或248-364位氨基酸片段；
优选地，所述抗体2结合新冠病毒N蛋白第85-95位氨基酸片段，
可选地，所述抗体组合用于鉴定新冠突变型抗原，所述突变型抗原包含新冠病毒N蛋白第377位突变为非天冬氨酸的其它氨基酸。
7.权利要求6所述的抗体组合，其特征在于，所述抗体组合可以进一步包含抗体3，所述抗体3结合新冠病毒N蛋白第1-43、85-95、44-180或248-364位氨基酸片段；
可选地，当抗体2结合新冠病毒N蛋白第44-180位氨基酸片段时，抗体3也可以是结合新冠病毒N蛋白第44-180位氨基酸片段的抗体；
可选地，当抗体2结合其它片段的抗体时，所述抗体3与抗体2的结合片段不同。
8.一种鉴定新冠突变型抗原的检测试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求5所述的抗体或权利要求6或7所述的抗体组合。
9.一种鉴别新冠突变型抗原的免疫层析试纸，其特征在于，所述免疫层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置有第一检测线和第二检测线，所述结合垫上设置有抗体2，所述第一检测线上包被抗体1、所述第二检测线上包被抗体3；或所述第一检测线上包被抗体3、所述第二检测线上包被抗体1，其中抗体1，抗体2和抗体3独立地如权利要求6或7所定义，可选地，所述硝酸纤维素膜上还设置有质控线。
10.一种鉴别新冠突变型抗原的免疫层析试纸，其特征在于，所述免疫层析试纸包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置有第一检测线和第二检测线，所述样品垫上包被有生物素化的抗体1，所述结合垫上设置有抗体2，所述第一检测线上包被有抗体3，所述第二检测线上包被有亲和素，其中抗体1，抗体2和抗体3独立地如权利要求6或7所定义，可选地，所述硝酸纤维素膜上还设置有质控线。
11.一种鉴别新冠突变型抗原的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求8所述的检测试剂或权利要求9或10所述的免疫层析试纸，与待测样品接触；
可选地，当第一检测线和第二检测线同时显色，则判定为样品中包含新冠病毒N蛋白第377位突变的抗原；当第二检测线显色，第一检测线不显色时，则判定为样品中包含新冠病毒N蛋白第377位未突变的抗原。
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