CN113325180A - 一种检测农药残留的胶体金卡及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测农药残留的胶体金卡及其制备方法和应用。所述胶体金卡包括底板和在底板上依次搭接的样品垫、金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置有包被农药抗原的检测线和包被二抗的质控线，所述金结合垫含有胶体金标记的农药抗体、蔗糖、十二水合磷酸氢二钠、牛血清白蛋白、酪朊酸钠、海藻糖和聚乙二醇。所述胶体金卡中，金结合垫含有蔗糖、十二水合磷酸氢二钠、牛血清白蛋白、酪朊酸钠、海藻糖和聚乙二醇，能够有效保护抗原和抗体，消除茶水中茶多酚、黄酮类物质、色素和矿物质等对显色的影响，提高了胶体金卡的抗干扰性。
Description
技术领域
本发明属于农药检测技术领域，涉及一种检测农药残留的胶体金卡及其制备方法和应用，尤其涉及一种检测茶叶中农药残留的胶体金卡及其制备方法和应用。
背景技术
农药具备病虫防治、去除杂草和调节植物生长的作用，在农业中被广泛应用，但农作物残留的农药对人体亦具有危害。中国人饮茶有着几千年的悠久历史，也是茶叶的出口大国，因此，茶叶中农药残备受重视。
目前，农药残留检测的主要手段仍然依赖液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-串联质谱法、气相色谱-质谱法等大型现代分析仪器，这类仪器虽然检测灵敏度高，但仪器的价格昂贵，操作繁琐，且周期长，难以满足大批量样品或临时样品的适时快速检测，因此，人们致力于开发能够快速、准确、便捷、低成本低检测农药残留的方法。
CN101319997公开了适用于茶叶中农药残留快速检测的卡片及其检测方法，所述卡片由含有稳定剂的固定化酶片和显色片组成，操作简便，检测时间短，能够快速有效的鉴别出农药残留超标的茶叶，但准确性和抗干扰性较差。
CN105181949A公开了一种适用于茶叶中吡虫啉等3种氯代烟碱类农药多残留速测的异源竞争免疫层析金标试纸条，该试纸条包括衬板、样品垫、金标一抗结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，金标一抗结合垫上包被有胶体金标记的吡虫啉类特异性小鼠单抗，硝酸纤维素膜上包被有用于异源竞争的氯噻啉或噻虫胺人工抗原的检测线和包被有兔抗鼠IgG的质控线，可快速检测茶叶中农药残留结果，但抗干扰性较差，显色易被茶叶中的茶多酚、黄酮类物质、色素或矿物质影响。
综上所述，提供一种抗干扰性强且可快速、准确检测茶叶中农药残留的方法，对于农药检测技术领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种检测农药残留的胶体金卡及其制备方法和应用，所述胶体金卡能够直接检测各种茶水基质，不受或者少受基质干扰的影响，从而避免检测线不出线或出线弱的情况。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种检测农药残留的胶体金卡，所述胶体金卡包括底板和在底板上依次搭接的样品垫、金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置有包被农药抗原的检测线和包被二抗的质控线，所述金结合垫含有胶体金标记的农药抗体、蔗糖、十二水合磷酸氢二钠、牛血清白蛋白、酪朊酸钠、海藻糖和聚乙二醇。
本发明中，在金结合垫中添加蔗糖、十二水合磷酸氢二钠、牛血清白蛋白、酪朊酸钠、海藻糖和聚乙二醇，可以避免茶叶中的茶多酚、黄酮类物质、色素和矿物质等复杂基质对于胶体金标记的农药抗体和农药抗原的影响，其中，蔗糖、海藻糖和聚乙二醇可以使胶体金标记的农药抗体保持一定的亲水性，避免了因抗体内部的疏水蛋白完全暴露，构象发生改变，进而造成抗体特异性结合能力下降，非特异性结合概率增加，检测结果出现假阳性的可能；十二水合磷酸氢二钠能维持整个体系的盐离子浓度，提升蛋白的溶解量，并促进抗原抗体特异性反应；牛血清白蛋白和酪元酸钠作为结合垫中的非特异性蛋白，能够保护胶体金标记的农药抗体的稳定性。
综上所述，本发明利用蔗糖、十二水合磷酸氢二钠、牛血清白蛋白、酪朊酸钠、海藻糖和聚乙二醇间相互配合，可以避免茶叶中的茶多酚、黄酮类物质、色素和矿物质等复杂基质对于胶体金卡中相应抗原和抗体的影响，从而提高了胶体金卡的抗干扰性，能够直接检测各种茶水，保证检测线正常显色，且提高显色的稳定性，因此，能够根据检测线的显色结果准确判定茶水中的农药残留，排除茶水中成分影响正常显色后出现假阳性结果的现象。
本发明的胶体金卡能够直接检测多种茶水中农药残留，包括铁观音、岩茶、慎红、金骏眉、白牡丹、普洱、毛尖、银针和黄芽。
优选地，所述样品垫上含有三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、脂肪醇聚氧乙烯、吐温和聚乙烯吡咯烷酮。
本发明中，在样品垫中添加三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、脂肪醇聚氧乙烯、吐温和聚乙烯吡咯烷酮，其中，三羟甲基氨基甲烷溶液保证整个体系的缓冲能力，缓冲不同样本提取后检测液pH差异对胶体金卡显色的影响；牛血清白蛋白能够优先的与检测样本中的非特异性结合物质结合，从而去除这类干扰物质的影响；脂肪醇聚氧乙烯、吐温和聚乙烯吡咯烷酮能够促进胶体金标记的农药抗体的爬动，使整个检测过程能够迅速、正常的完成，保证检测线正常显色。
优选地，所述检测线上还含有氯化钠、海藻糖和聚氧乙烯十二烷基醚。
本发明中，在检测线中添加氯化钠、海藻糖和聚氧乙烯十二烷基醚，能够提高农药抗原的稳定性，保证检测线正常显色。
优选地，所述农药抗体包括毒死蜱抗体、甲萘威抗体、三唑磷抗体、三唑酮抗体、涕灭威抗体、氟虫腈抗体、多效唑抗体、吡虫啉抗体、哒螨灵抗体或百菌清抗体中的任意一种。
优选地，所述农药抗体为鼠源农药IgG抗体。
优选地，所述农药抗原包括毒死蜱抗原、甲萘威抗原、三唑磷抗原、三唑酮抗原、涕灭威抗原、氟虫腈抗原、多效唑抗原、吡虫啉抗原、哒螨灵抗原或百菌清抗原中的任意一种。
优选地，所述农药抗原和农药抗体的制备方法(以吡虫啉抗原、抗体为例)包括以下步骤：
(1’)抗原制备
1)合成吡虫啉偶联抗原衍生化：称取1g吡虫啉标准品加入100mL单口瓶中，加入15mL二甲基亚砜搅拌溶解，再加入0.45g KOH，称取630mg 3-巯基丙酸(使用5mL二甲基亚砜溶解)，滴入反应液中，于100℃反应24h，TLC法监控直至反应结束，向反应液中加入30mL水，摇匀，然后用6M HCl调节pH至5，溶液用二氯甲烷萃取(每次30mL，萃取3次)，TLC监控，合并有机相，用饱和氯化钠洗涤1次，再加入适量无水硫酸钠干燥，将有机相旋转蒸干，将旋干得到的产物用少量乙酸乙酯溶解，加入适量硅胶，然后装柱，先用二氯甲烷：正己烷＝1:1(V/V)冲洗；再用200mL二氯甲烷冲柱子，最后用二氯甲烷：甲醇＝20:1过柱子，得到吡虫啉半抗原；
2)活化：将吡虫啉半抗原用1000μL DMF搅拌溶解，加入12mg NHS、20mg EDC，室温反应过夜，得到活化物；
3)偶联：称取30mg BSA(投料比可调整)溶于2mL PH为9.0的硼酸溶液中，向其中缓慢滴加活化物0.5mL，室温搅拌0.5h，于4℃过夜反应；
称取20mg OVA(投料比可调整)溶于2mL PH＝9.0硼酸溶液中，向其中缓慢滴加活化物0.5mL，室温搅拌0.5h，4℃过夜反应；
4)纯化：用0.01MpH7.4 PBS透析，得到吡虫啉偶联抗原Ⅰ，透析后测定浓度，准备免疫；
(2’)抗体制备
1)免疫动物：将上述步骤中制成的吡虫啉偶联抗原Ⅰ与等量弗氏完全佐剂乳化完全后，免疫小鼠；
2)细胞融合和杂交瘤细胞筛选：取经吡虫啉偶联抗原Ⅰ免疫的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用HAT培养基进行培养，对培养上清进行检测，筛选获得稳定分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株14A4-B1-C12；
3)制备腹水：将分泌抗吡虫啉单克隆抗体的细胞株14A4-B1-C12培养后，注射入BALB/C小鼠腹腔，收集其腹水；
4)抗吡虫啉单克隆抗体的纯化制备：采用硫酸铵沉淀法对腹水进行透析、过滤处理，采用吡虫啉亲和层析柱对经透析、过滤处理的上清进行纯化，提纯制备出抗吡虫啉单克隆抗体。
优选地，所述二抗包括羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体。
优选地，所述底板包括PVC底板。
第二方面，本发明提供一种第一方面所述的检测农药残留的胶体金卡的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)使用含有氯化钠、海藻糖、聚氧乙烯和十二烷基醚的划膜液在硝酸纤维素膜进行划膜，制作检测线和质控线，并在检测线上包被农药抗原，在质控线上包被二抗，得到具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
使用含有蔗糖、十二水合磷酸氢二钠、牛血清白蛋白、酪朊酸钠、海藻糖和聚乙二醇的金结合垫处理液浸泡玻璃纤维，进行干燥处理，并在玻璃纤维上喷涂胶体金标记的农药抗体，得到金结合垫；
使用含有三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、脂肪醇聚氧乙烯、吐温和聚乙烯吡咯烷酮的样品垫处理液浸泡玻璃纤维，进行干燥处理，得到样品垫；
(2)将样品垫、金结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接，并粘合在底板上，得到所述检测农药残留的胶体金卡。
优选地，步骤(1)所述划膜液含有0.05～0.2M氯化钠(例如可以是0.06M、0.07M、0.08M、0.1M、0.12M、0.16M或0.18M)、1％～5％海藻糖(例如可以是1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、3％、4％、4.2％、4.6％或4.8％)和0.02％～0.05％聚氧乙烯十二烷基醚(例如可以是0.022％、0.024％、0.026％、0.03％、0.04％、0.042％、0.046％或0.048％)。
优选地，步骤(1)所述金结合垫处理液含有2％～8％蔗糖(例如可以是2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3％、4％、5％、6％、7％、7.2％、7.4％、7.6％或7.8％)、0.05～0.2M十二水合磷酸氢二钠(例如可以是0.06M、0.07M、0.08M、0.09M、0.1M、0.12M、0.14M、0.16M或0.18M)、0.5％～5％牛血清白蛋白(例如可以是0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、3.5％、4％、4.2％、4.6％或4.8％)、0.5％～5％酪朊酸钠(例如可以是0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、3.5％、4％、4.2％、4.6％或4.8％)、1％～3％海藻糖(例如可以是1.1％、1.2％、1.4％、1.6％、1％、2％、2.2％、2.4％、2.6％或2.8％)和0.5％～3％聚乙二醇(例如可以是0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、2.2％、2.4％、2.6％或2.8％)。
优选地，步骤(1)所述样品垫处理液含有0.02～0.2M三羟甲基氨基甲烷(例如可以是0.03M、0.04M、0.05M、0.06M、0.08M、0.1M、0.12M、0.14M、0.16M或0.18M)、0.5％～5％牛血清白蛋白(例如可以是0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.2％、2％、3％、4％、4.2％、4.4％、4.6％或4.8％)、0.1％～1.5％脂肪醇聚氧乙烯(例如可以是0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、1％、1.2％、1.3％或1.4％)、0.1％～1.5％吐温(例如可以是0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、1％、1.2％、1.3％或1.4％)和0.25％～1.5％聚乙烯吡咯烷酮(例如可以是0.26％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、1％、1.2％、1.3％或1.4％)。
优选地，步骤(2)所述搭接为重叠2～3mm。
优选地，所述方法还包括制备胶体金溶液的步骤。
优选地，所述胶体金溶液的制备方法为使用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金溶液。
优选地，所述胶体金溶液中胶体金的粒径为35～45nm，包括但不限于36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm或44nm。
优选地，所述方法还包括制备胶体金标记的农药抗体的步骤。
优选地，所述胶体金标记的农药抗体的制备方法为使用K2CO3溶液调节胶体金溶液pH，随后将胶体金溶液与农药抗体混合进行标记，得到胶体金标记的农药抗体。
优选地，所述K2CO3溶液的浓度为0.2～0.4M，包括但不限于0.22M、0.24M、0.25M、0.26M、0.3M、0.32M、0.35M、0.36M或0.38M。
优选地，所述胶体金溶液和农药抗体的配比为1mL:(5～8)μg，包括但不限于1mL:5μg、1mL:5.2μg、1mL:5.4μg、1mL:5.6μg、1mL:5.8μg、1mL:6μg、1mL:7μg、1mL:7.2μg、1mL:7.4μg、1mL:7.6μg或、1mL:7.8μg。
作为优选的技术方案，所述检测农药残留的胶体金卡的制备方法包括以下步骤：
(1)使用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金溶液，使胶体金的粒径为35～45nm；
(2)使用0.2～0.4M K2CO3溶液调节胶体金溶液pH，随后按配比为1mL:(5～8)μg将胶体金溶液与农药抗体混合进行标记，得到胶体金标记的农药抗体；
(3)使用含有0.05～0.2M氯化钠、1％～5％海藻糖和0.02％～0.05％聚氧乙烯十二烷基醚的划膜液在硝酸纤维素膜进行划膜，划膜体积为0.75～1.0μL/cm，制作检测线和质控线，并在检测线上包被农药抗原，在质控线上包被二抗，于35～40℃干燥10～16h，得到具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
(4)使用含有2％～8％蔗糖、0.05～0.2M十二水合磷酸氢二钠、0.5％～5％牛血清白蛋白、0.5％～5％酪朊酸钠、1％～3％海藻糖和0.5％～3％聚乙二醇的金结合垫处理液浸泡玻璃纤维3～7min，于35～40℃干燥10～16h，并在玻璃纤维上喷涂胶体金标记的农药抗体，得到金结合垫；
(5)使用含有0.02～0.2M三羟甲基氨基甲烷，0.5％～5％牛血清白蛋白、0.1％～1.5％脂肪醇聚氧乙烯、0.1％～1.5％吐温和0.25％～1.5％聚乙烯吡咯烷酮的样品垫处理液浸泡玻璃纤维3～7min，于35～40℃干燥10～16h，得到样品垫；
(6)将样品垫、金结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接2～3mm，并粘合在底板上，得到所述检测农药残留的胶体金卡。
第三方面，本发明提供第一方面所述的检测农药残留的胶体金卡在检测茶叶农药残留中的应用。
本发明的胶体金卡基于免疫竞争原理，即当样品中存在农药时，农药能够与金结合垫上的农药抗体结合，导致农药抗体无法与检测线上的农药抗原结合，无法发生显色，而当样品中不存在农药残留或农药残留低于检测限时，金结合垫上的农药抗体能够与检测线上的农药抗原结合，发生显色，而质控线上的二抗与抗原的结合不受农药的影响；因此，质控线显色，表明胶体金卡有效，未显色则无效；检测线比质控线深，或者一样深，表明样品中农药低于其检测限为阴性；检测线比质控线显色弱或者不显色，表明样品中农药残留高于卡检测限，为阳性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的胶体金卡中，金结合垫含有蔗糖、十二水合磷酸氢二钠、牛血清白蛋白、酪朊酸钠、海藻糖和聚乙二醇，能够消除茶水中茶多酚、黄酮类物质、色素和矿物质等对显色的影响，提高了胶体金卡的抗干扰性，且能提高显色稳定性；
(2)本发明的胶体金卡能够直接检测多种茶水中农药残留，包括铁观音、岩茶、慎红、金骏眉、白牡丹、普洱、毛尖、银针和黄芽，10min内即可出结果，能够根据检测线的显色结果准确判定茶水中的农药残留，排除茶水中成分影响正常显色后出现假阳性结果的现象，结果准确、可靠；
(3)本发明的胶体金检测卡灵敏度高，检测限都能满足或超过国家标准2763-2019限量要求，且具有多重保护抗原、抗体机制，能极大提高抗原抗体的结合效率，进而节省原料，降低了生产成本。
附图说明
图1为实施例1中胶体金卡结构示意图，其中1为样品垫，2为金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为吸水垫，5为底板；
图2实施例1中胶体金卡俯视示意图，其中1为样品垫，2为金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为吸水垫，6为检测线，7为质控线；
图3为实施例1制备的胶体金卡检测茶水中农药残留的结果；
图4为实施例2中胶体金卡检测茶水中农药残留的结果；
图5为实施例3中胶体金卡检测茶水中农药残留的结果；
图6为实施例4中胶体金卡检测茶水中农药残留的结果；
图7为对比例1中胶体金卡检测茶水中农药残留的结果；
图8为对比例2中胶体金卡检测茶水中农药残留的结果；
图9为对比例3中胶体金卡检测茶水中农药残留的结果；
图10为对比例4中胶体金卡检测茶水中农药残留的结果；
图11为对比例5中胶体金卡检测茶水中农药残留的结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种检测农药的胶体金卡，所述胶体金卡的结构示意图如图1和图2所示。
所述胶体金卡的制备方法包括以下步骤：
(1)使用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金溶液；
(2)使用0.2M K2CO3溶液调节胶体金溶液pH，随后按配比为1mL:6μg将胶体金溶液与吡虫啉抗体混合进行标记，得到胶体金标记的吡虫啉抗体；
(3)使用含有0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液、3％海藻糖和0.035％聚氧乙烯十二烷基醚(Brij58)的划膜液(余量为水)在硝酸纤维素膜进行划膜，划膜体积为0.9μL/cm，制作检测线和质控线，并在检测线上包被吡虫啉抗原，在质控线上包被羊抗鼠IgG，于38℃干燥13h，得到具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
(4)使用含有5％蔗糖、0.12M十二水合磷酸氢二钠、3％牛血清白蛋白、3％酪朊酸钠、2％海藻糖和2％聚乙二醇(PEG4000)的金结合垫处理液(余量为水)浸泡玻璃纤维5min，于38℃干燥13h，并在玻璃纤维上喷涂胶体金标记的吡虫啉抗体，得到金结合垫；
(5)使用含有0.1M三羟甲基氨基甲烷，3％牛血清白蛋白、0.8％脂肪醇聚氧乙烯、0.8％吐温(Tween 20)和0.9％聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)的样品垫(余量为水)处理液浸泡玻璃纤维5min，于38℃干燥13h，得到样品垫；
(6)将样品垫、金结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接，并粘合在底板上，得到所述检测农药残留的胶体金卡。
实施例2
本实施例提供一种检测农药的胶体金卡，所述胶体金卡的制备方法包括以下步骤：
(1)使用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金溶液；
(2)使用0.2M K2CO3溶液调节胶体金溶液pH，随后按配比为1mL:5μg将胶体金溶液与吡虫啉抗体混合进行标记，得到胶体金标记的吡虫啉抗体；
(3)使用含有0.01MpH为7.4的磷酸盐缓冲液在硝酸纤维素膜进行划膜，划膜体积为0.75μL/cm，制作检测线和质控线，并在检测线上包被吡虫啉抗原，在质控线上包被羊抗鼠IgG，于38℃干燥13h，得到具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
(4)使用含有5％蔗糖、0.12M十二水合磷酸氢二钠、3％牛血清白蛋白、3％酪朊酸钠、2％海藻糖和2％聚乙二醇(PEG4000)的金结合垫处理液(余量为水)浸泡玻璃纤维5min，于38℃干燥13h，并在玻璃纤维上喷涂胶体金标记的吡虫啉抗体，得到金结合垫；
(5)使用含有0.1M三羟甲基氨基甲烷，3％牛血清白蛋白、0.8％脂肪醇聚氧乙烯、0.8％吐温(Tween 20)和0.9％聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)的样品垫(余量为水)处理液浸泡玻璃纤维5min，于38℃干燥13h，得到样品垫；
(6)将样品垫、金结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接，并粘合在底板上，得到所述检测农药残留的胶体金卡。
实施例3
本实施例提供一种检测农药的胶体金卡，所述胶体金卡的制备方法包括以下步骤：
(1)使用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金溶液；
(2)使用0.2M K2CO3溶液调节胶体金溶液pH，随后按配比为1mL:5μg将胶体金溶液与吡虫啉抗体混合进行标记，得到胶体金标记的吡虫啉抗体；
(3)使用含有0.01MpH7.4的磷酸盐缓冲液、3％海藻糖和0.035％聚氧乙烯十二烷基醚(Brij58)的划膜液(余量为水)在硝酸纤维素膜进行划膜，划膜体积为0.9μL/cm，制作检测线和质控线，并在检测线上包被吡虫啉抗原，在质控线上包被羊抗鼠IgG，于38℃干燥13h，得到具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
(4)使用含有5％蔗糖、0.12M十二水合磷酸氢二钠、3％牛血清白蛋白、3％酪朊酸钠、2％海藻糖和2％聚乙二醇(PEG4000)的金结合垫处理液(余量为水)浸泡玻璃纤维5min，于38℃干燥13h，并在玻璃纤维上喷涂胶体金标记的吡虫啉抗体，得到金结合垫；
(5)使用含有0.1M pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，1％牛血清白蛋白、0.5％吐温(Tween 20)(余量为水)处理液浸泡玻璃纤维5min，于38℃干燥13h，得到样品垫；
(6)将样品垫、金结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接，并粘合在底板上，得到所述检测农药残留的胶体金卡(6)将样品垫、金结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接，并粘合在底板上，得到所述检测农药残留的胶体金卡。
实施例4
本实施例提供一种检测农药的胶体金卡，所述胶体金卡的制备方法包括以下步骤：
(1)使用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金溶液；
(2)使用0.2M K2CO3溶液调节胶体金溶液pH，随后按配比为1mL:5μg将胶体金溶液与吡虫啉抗体混合进行标记，得到胶体金标记的吡虫啉抗体；
(3)使用含有0.01MpH7.4为的磷酸盐缓冲液在硝酸纤维素膜进行划膜，划膜体积为0.75μL/cm，制作检测线和质控线，并在检测线上包被吡虫啉抗原，在质控线上包被羊抗鼠IgG，于38℃干燥13h，得到具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
(4)使用含有5％蔗糖、0.12M十二水合磷酸氢二钠、3％牛血清白蛋白、3％酪朊酸钠、2％海藻糖和2％聚乙二醇(PEG4000)的金结合垫处理液(余量为水)浸泡玻璃纤维5min，于38℃干燥13h，并在玻璃纤维上喷涂胶体金标记的吡虫啉抗体，得到金结合垫；
(5)使用含有0.1M pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，1％牛血清白蛋白、0.5％吐温(Tween 20)(余量为水)处理液浸泡玻璃纤维5min，于38℃干燥13h，得到样品垫；
(6)将样品垫、金结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接，并粘合在底板上，得到所述检测农药残留的胶体金卡。
对比例1
一种常规工艺制备的胶体金卡，所述常规工艺包括以下步骤：
(1)使用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金溶液；
(2)使用0.2M K2CO3溶液调节胶体金溶液pH，随后按配比为1mL:5μg将胶体金溶液与吡虫啉抗体混合进行标记，得到胶体金标记的吡虫啉抗体；
(3)使用含有0.01MpH为7.4的磷酸盐缓冲液在硝酸纤维素膜进行划膜，划膜体积为0.75μL/cm，制作检测线和质控线，并在检测线上包被吡虫啉抗原，在质控线上包被羊抗鼠IgG，于38℃干燥13h，得到具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
(4)使用含有6％蔗糖水溶液浸泡玻璃纤维5min，于38℃干燥13h，并在玻璃纤维上喷涂胶体金标记的吡虫啉抗体，得到金结合垫；
(5)使用含有0.1M pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，1％牛血清白蛋白、0.5％吐温(Tween 20)(余量为水)处理液浸泡玻璃纤维5min，于38℃干燥13h，得到样品垫；
(6)将样品垫、金结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接，并粘合在底板上，得到所述检测农药残留的胶体金卡。
对比例2
与实施例1相比，区别仅在于步骤(4)所述金结合垫处理液含有0.12M十二水合磷酸氢二钠、3％牛血清白蛋白、3％酪朊酸钠、2％海藻糖和2％聚乙二醇(PEG4000)，余量为水。其它与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比，区别仅在于步骤(4)所述金结合垫处理液含有5％蔗糖、0.12M十二水合磷酸氢二钠、3％牛血清白蛋白、2％海藻糖和2％聚乙二醇(PEG4000)，余量为水。其它与实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比，区别仅在于步骤(4)所述金结合垫处理液含有5％蔗糖、0.12M十二水合磷酸氢二钠、3％牛血清白蛋白、3％酪朊酸钠和2％聚乙二醇(PEG4000)，余量为水。其它与实施例1相同。
对比例5
与实施例1相比，区别仅在于步骤(4)所述金结合垫处理液含有5％蔗糖、0.12M十二水合磷酸氢二钠、3％牛血清白蛋白、3％酪朊酸钠和2％海藻糖，余量为水。其它与实施例1相同。
试验例1
使用实施例1-4制备的胶体金卡和对比例1-5中胶体金卡分别对铁观音、岩茶、慎红、金骏眉、白牡丹、普洱、毛尖、银针和黄芽的茶水进行测试，结果如图3-图11所示。
由图3-图6可知，实施例1-4制备的胶体金卡检测线和质控线均正常显色，表明实施例1-4制备胶体金卡抗干扰能力强，能够有效检测茶水中的农药残留；而由图7-图11可知，对比例1为常规工艺制备的胶体金卡，对比例2-5中未按本发明控制金结合垫中成分，检测相同的茶水时，检测线较暗或几乎观察不到显色，表明所述胶体金卡抗干扰能力较差，难以准确检测茶水中农药残留，表明本发明控制金结合垫的有效成分，能够提高胶体金卡的抗干扰性，有效检测茶水中的农药残留，能够根据检测线的显色结果准确判定茶水中的农药残留，排除茶水中成分影响正常显色后出现假阳性结果的现象。
此外，与实施例1制备的胶体金卡的显色结果相比，实施例2-4制备的胶体金卡的显色较浅，且实施例4制备的胶体金卡的显色最浅，表明本发明同时对样片垫、金结合垫和检测线进行处理，使其含有相应有效成分，能够进一步提高胶体金卡的抗干扰性。
综上所述，本发明对样品垫、金结合垫和检测线进行处理，使其含有相应有效成分，从而消除了不同茶叶基质对于胶体金卡显色的影响，提高了胶体金卡的抗干扰性，能够准确检测茶叶中的农药残留。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种检测农药残留的胶体金卡，其特征在于，所述胶体金卡包括底板和在底板上依次搭接的样品垫、金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；
所述硝酸纤维素膜上设置有包被农药抗原的检测线和包被二抗的质控线；
所述金结合垫含有胶体金标记的农药抗体、蔗糖、十二水合磷酸氢二钠、牛血清白蛋白、酪朊酸钠、海藻糖和聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的胶体金卡，其特征在于，所述样品垫上含有三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、脂肪醇聚氧乙烯、吐温和聚乙烯吡咯烷酮；
优选地，所述检测线上还含有氯化钠、海藻糖和聚氧乙烯十二烷基醚。
3.根据权利要求1或2所述的胶体金卡，其特征在于，所述农药抗体包括毒死蜱抗体、甲萘威抗体、三唑磷抗体、三唑酮抗体、涕灭威抗体、氟虫腈抗体、多效唑抗体、吡虫啉抗体、哒螨灵抗体或百菌清抗体中的任意一种；
优选地，所述农药抗体为鼠源农药IgG抗体；
优选地，所述农药抗原包括毒死蜱抗原、甲萘威抗原、三唑磷抗原、三唑酮抗原、涕灭威抗原、氟虫腈抗原、多效唑抗原、吡虫啉抗原、哒螨灵抗原或百菌清抗原中的任意一种；
优选地，所述二抗包括羊抗鼠IgG抗体或兔抗鼠IgG抗体。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的检测农药残留的胶体金卡的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)使用含有氯化钠、海藻糖、聚氧乙烯和十二烷基醚的划膜液在硝酸纤维素膜进行划膜，制作检测线和质控线，并在检测线上包被农药抗原，在质控线上包被二抗，得到具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
使用含有蔗糖、十二水合磷酸氢二钠、牛血清白蛋白、酪朊酸钠、海藻糖和聚乙二醇的金结合垫处理液浸泡玻璃纤维，进行干燥处理，并在玻璃纤维上喷涂胶体金标记的农药抗体，得到金结合垫；
使用含有三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、脂肪醇聚氧乙烯、吐温和聚乙烯吡咯烷酮的样品垫处理液浸泡玻璃纤维，进行干燥处理，得到样品垫；
(2)将样品垫、金结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接，并粘合在底板上，得到所述检测农药残留的胶体金卡。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述划膜液含有0.05～0.2M氯化钠、1％～5％海藻糖和0.02％～0.05％聚氧乙烯十二烷基醚；
优选地，步骤(1)所述金结合垫处理液含有2％～8％蔗糖、0.05～0.2M十二水合磷酸氢二钠、0.5％～5％牛血清白蛋白、0.5％～5％酪朊酸钠、1％～3％海藻糖和0.5％～3％聚乙二醇；
优选地，步骤(1)所述样品垫处理液含有0.02～0.2M三羟甲基氨基甲烷、0.5％～5％牛血清白蛋白、0.1％～1.5％脂肪醇聚氧乙烯、0.1％～1.5％吐温和0.25％～1.5％聚乙烯吡咯烷酮。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述搭接为重叠2～3mm。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括制备胶体金溶液的步骤；
优选地，所述胶体金溶液的制备方法为使用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金溶液；
优选地，所述胶体金溶液中胶体金的粒径为35～45nm。
8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括制备胶体金标记的农药抗体的步骤；
优选地，所述胶体金标记的农药抗体的制备方法为使用K2CO3溶液调节胶体金溶液pH，随后将胶体金溶液与农药抗体混合进行标记，得到胶体金标记的农药抗体；
优选地，所述K2CO3溶液的浓度为0.2～0.4M；
优选地，所述胶体金溶液和农药抗体的配比为1mL:(5～8)μg。
9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)使用柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金溶液，使胶体金的粒径为35～45nm；
(2)使用0.2～0.4M K2CO3溶液调节胶体金溶液pH，随后按配比为1mL:(5～8)μg将胶体金溶液与农药抗体混合进行标记，得到胶体金标记的农药抗体；
(3)使用含有0.05～0.2M氯化钠、1％～5％海藻糖和0.02％～0.05％聚氧乙烯十二烷基醚的划膜液在硝酸纤维素膜进行划膜，划膜体积为0.75～1.0μL/cm，制作检测线和质控线，并在检测线上包被农药抗原，在质控线上包被二抗，于35～40℃干燥10～16h，得到具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；
(4)使用含有2％～8％蔗糖、0.05～0.2M十二水合磷酸氢二钠、0.5％～5％牛血清白蛋白、0.5％～5％酪朊酸钠、1％～3％海藻糖和0.5％～3％聚乙二醇的金结合垫处理液浸泡玻璃纤维3～7min，于35～40℃干燥10～16h，并在玻璃纤维上喷涂胶体金标记的农药抗体，得到金结合垫；
(5)使用含有0.02～0.2M三羟甲基氨基甲烷、0.5％～5％牛血清白蛋白、0.1％～1.5％脂肪醇聚氧乙烯、0.1％～1.5％吐温和0.25％～1.5％聚乙烯吡咯烷酮的样品垫处理液浸泡玻璃纤维3～7min，于35～40℃干燥10～16h，得到样品垫；
(6)将样品垫、金结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接2～3mm，并粘合在底板上，得到所述检测农药残留的胶体金卡。
10.如权利要求1-3任一项所述的检测农药残留的胶体金卡在检测茶叶农药残留中的应用。
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