CN106093378A

CN106093378A - 检测犬细粒棘球绦虫感染胶体金免疫层析试纸及制备方法

Info

Publication number: CN106093378A
Application number: CN201610363426.2A
Authority: CN
Inventors: 宫鹏涛; 张西臣; 高珺珊; 李建华; 张壮志; 杨举; 李�赫; 李棕松; 杨正涛; 尹继刚
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2016-05-30
Filing date: 2016-05-30
Publication date: 2016-11-09

Abstract

本发明公开一种检测犬细粒棘球绦虫感染胶体金免疫层析试纸条的制备方法，是通过克隆、表达纯化EdiagA864重组蛋白，制备并纯化单克隆抗体及兔多克隆抗体，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，之后利用胶体金对单克隆抗体进行标记，制备金标垫，组装试纸条，细粒棘球绦虫EdiagA864兔多克隆抗体作为检测线、羊抗鼠抗体作为质检线。具有快捷、便于操作、不需要特殊仪器等特点，检测结果清晰，可以较快的进行判断，适合于临床现场的快速诊断和牧区等大规模流行病学调查。具有高特异性和敏感性，利用细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体和多克隆抗体夹心的方法，其中单克隆抗体保证了本方法的特异性，多克隆抗体又提高了本方法的敏感性。与传统的槟榔碱导泻法相比，保证了检测人员的安全，避免虫卵感染。

Description

检测犬细粒棘球绦虫感染胶体金免疫层析试纸及制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测犬细粒棘球绦虫感染胶体金免疫层析试纸，用于犬细粒棘球绦虫感染的粪便检测，属于免疫学技术领域。

背景技术

犬细粒棘球绦虫病是由细粒棘球绦虫引起的一种对宿主内脏造成机械性损伤的人畜共患寄生虫病。该病呈全球流行，严重威胁人畜的健康，并对畜牧业的发展造成阻碍。犬是该病重要的终末宿主，也是该病流行的重要环节。目前，细粒棘球绦虫诊断方法很多，其中OIE把剖检法和槟榔碱导泻法定为犬细粒棘球绦虫病检测的“金标准”。可是“金标准”方法有着操作复杂、检测时间长、检测条件要求高等诸多缺点，在实践应用中有诸多不方便之处，因此，不断有新的检测技术出现。

细粒棘球绦虫EdiagA864基因是利用抗细粒棘球绦虫兔高免血清对细粒棘球绦虫cDNA 文库进行筛选得到的，与多房棘球绦虫诊断抗原 gp50 具有 92%同源性，但在核苷酸同源性分析中，并未查找到与其同源的基因，分析可能是一个未知的新基因。经原核表达可得到 51kDa 左右的蛋白条带，经Western blot检测该蛋白具有良好的反应原性，可作为检测细粒棘球绦虫的诊断性抗原。目前，利用EdiagA864制备的单克隆抗体及兔多克隆抗体研制检测犬细粒棘球绦虫感染胶体金试纸条的方法，还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快检测犬细粒棘球绦虫感染的胶体金试纸条方法，它具有快速便捷、操作简单、不需要特殊仪器等特点，适合临床现场检测及牧区大规模流行病学调查。

本发明还公开了一种检测犬细粒棘球绦虫感染胶体金免疫层析试纸的制备方法，利用胶体金标记的细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体2D12，细粒棘球绦虫EdiagA864多克隆抗体包被检测线（T线），羊抗鼠抗体包被质控线(C线)，以上为基础研制出本发明的检测犬细粒棘球绦虫感染的胶体金免疫层析试纸条。

本发明涉及的一种检测犬细粒棘球绦虫感染胶体金免疫层析试纸条，主要包括玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC底板；其特征在于：

金标垫上的金标抗体为EdiagA864单克隆抗体2D12，硝酸纤维素膜上的指示线T线包被细粒棘球绦虫EdiagA864兔多克隆抗体、C线包被羊抗鼠抗体，建立了一种双抗体夹心胶体金试纸条检测方法。

本发明涉及的一种检测犬细粒棘球绦虫感染胶体金免疫层析试纸条的制备方法，是通过克隆、表达纯化EdiagA864重组蛋白，制备并纯化单克隆抗体及兔多克隆抗体，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，之后利用胶体金对单克隆抗体进行标记，制备金标垫，组装试纸条，细粒棘球绦虫EdiagA864兔多克隆抗体作为检测线、羊抗鼠抗体作为质检线，其中：

一、EdiagA864重组蛋白的克隆、表达及纯化

1、λ噬菌体插入基因的克隆

插入基因片段扩增引物序列由上海生工合成，如下：

Forward primer：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'

Reverse primer：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'

2、开放性阅读框 PCR 扩增

根据开放性阅读框基因序列，用 Primer5.0 软件进行引物设计，限制性内切酶分别为BamH I、Hind Ⅲ：

ORF EdiagA864-F: 5’-GGATCCGGAATTGTCGTCTTCCTTCT-3’

ORF EdiagA864-R: 5’-AAGCTTACCAATAAGTCTTCTCCAATGC-3’

以 EdiagA864 PCR 扩增产物为模板进行开放性阅读框的 PCR 扩增

3、EdiagA864 克隆载体构建

将目的片段与 pMD-18T 载体连接，EdiagA864-18T 连接产物转化入感受态，对重组质粒进行鉴定以及双酶切鉴定。

4、EdiagA864 表达载体构建

ORF EdiagA864 基因与 pET-32a 质粒连接，连接产物转化入感受态，并进行双酶切验证。

二、EdiagA864 单克隆抗体的制备

1、动物免疫

免疫 6-8 周龄的雌性 Balb/c 小鼠。免疫剂量应控制在 100-200μL/只，蛋白含量控制在 25-100μg/只

2、骨髓瘤细胞与脾细胞融合

取处于对数生长期的骨髓瘤细胞与脾细胞进行融合。

3、阳性杂交瘤细胞株的筛选

用建立起的间接 ELISA 方法进行抗体的检测，筛选阳性杂交瘤细胞并进行克隆。

4、阳性杂交瘤细胞株的染色体分析

利用秋水仙素破坏细胞的纺锤丝、低渗处理、吉姆萨染色的方法处理杂交瘤细胞，显微镜下观察杂交瘤细胞染色体的形态和数目，单抗 2D12染色体数目为97条。

5、单克隆细胞亚型鉴定

利用抗体亚型鉴定试剂盒，对单克隆抗体进行亚型鉴定。结果单抗 2D12的重链亚型均为 IgG1，轻链亚型均为 Kappa。

6、单克隆抗体的大量制备

将杂交瘤细胞小鼠腹腔，收集腹水。

三、胶体金试纸条的制备

硝酸纤维素膜21mm，样品垫24mm、金标垫9mm、吸水纸32mm从下到上依次粘贴于PVC底板上，样品垫压金标垫2mm，金标垫压NC膜2mm，吸水纸压NC膜2mm；依次粘贴好后，用切纸机将组装的试纸板切成每条宽度为4mm的试纸条，T线包被细粒棘球绦虫EdiagA864兔多克隆抗体、C线包被羊抗鼠抗体即可。

本发明的积极效果在于：

制备的犬细粒棘球绦虫感染检测胶体金试纸条具有快捷、便于操作、不需要特殊仪器等特点，检测结果清晰，可以较快的进行判断，适合于临床现场的快速诊断和牧区等大规模流行病学调查。具有高特异性和敏感性，利用细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体和多克隆抗体夹心的方法，其中单克隆抗体保证了本方法的特异性，多克隆抗体又提高了本方法的敏感性。与传统的槟榔碱导泻法相比，保证了检测人员的安全，避免虫卵感染。

附图说明

图1 试纸条检测结果示意图；

图2 胶体金透射电镜图；

图3 透射电镜观察金标探针；

图4 特异性试验结果图；

图5 敏感性试验结果图。

具体实施方式

下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。

实施例1

犬细粒棘球绦虫感染检测胶体金试纸条的制备

（1）胶体金的烧制

利用柠檬酸三钠还原法，向99mL ddH₂O中加入1mL 1%氯金酸，沸腾后加入1mL 1%柠檬酸三钠，制备40nm胶体金颗粒。

（2）金标抗体最佳pH确定

利用K₂CO₃梯度标记法，通过观察颜色变化，确定金标最佳PH。

（3）金标抗体的制备

利用摸索好的最佳K₂CO₃加入量通过胶体金对单抗进行标记，标记后的金标抗体溶解于复溶液中4℃保存待用或直接滴加于金标垫上。

（4） NC膜上T线多抗包被浓度的确定

将T线多抗稀释成2、1、0.5、0.25、0.125mg/mL，每个试纸条包被1µL，按照常规条件进行操作，观察结果T线的显色情况，确定T线多抗的最佳包被浓度。

（5） NC膜上C线抗体包被浓度的确定

将C线抗体稀释成2、1、0.5、0.25、0.125mg/mL，每个试纸条包被1µL，按照常规条件进行操作，观察结果C线的显色情况，确定C线抗体的最佳包被浓度。

、结果

（1）胶体金的烧制

胶体金溶液颜色均匀透明，透射电镜观察颗粒大小基本一致，约40nm左右，分散均匀，没有聚集，可用于下一步试验（见图2）。

（2）金标抗体最佳pH确定

确定胶体金标记抗体的最适0.2mol/L K₂CO₃加入量为4µL。

（3）金标抗体的制备

通过透射电镜观察，金颗粒周围有一圈蛋白晕，分散性较好，无聚集现象，表明标记成功（见图3）。

（4）NC膜上T线多抗最佳包被浓度的确定

多抗浓度稀释到1mg/mL时T线显色仍较为明显，故选择1mg/mL为T线最佳包被浓度。

（5） NC膜上C线抗体最佳包被浓度的确定

结果显示当抗体浓度稀释到0.5mg/mL包被时C线显色最明显，故选择0.5mg/mL为C线最佳包被浓度。

实施例2

胶体金免疫层析试纸条性能测试

为了测试试纸条的试验性能，需要进行一系列的试验，其中包括特异性试验、敏感性试验、重复性试验、保存期试验。

（1）特异性试验

分别取犬细粒棘球绦虫参照阳性粪便、犬蛔虫阳性粪便、犬贾第虫阳性粪便，健康犬粪便做阴性对照，按照常规方法进行操作，判断各种粪便之间有无交叉反应，从而评价试纸条的特异性（见图4）。

（2）敏感性试验

将犬细粒棘球绦虫阳性粪便进行倍比稀释（1:1、1:2、1:4、1:8、1:16），按常规操作观察试纸条显色情况。当用肉眼无法观察到T线，并且C线依旧清晰可见时，此时的稀释度即为该方法的最低检出浓度（见图5）。

（3）重复性试验

取犬细粒棘球绦虫阳性粪便及阴性粪便，使用3个不同批次的试纸条按上述方法进行试验，每个样品做三次重复，根据膜片显色情况，确定该方法的重复性情况。

（4）稳定性试验

将试纸条分别于4℃密封保存、37℃密封保存、室温密封保存。分别在1个月、2个月、3个月、4个月几个时间点分别对参照阳性样品进行检测，观察三种环境各试纸条的显色情况，从而判断试纸条检测的稳定情况。

（5）试纸条检测阳性粪便符合率试验

应用已经建立的胶体金试纸条检测方法，对10份新疆地区犬细粒棘球绦虫参照阳性样品进行检测，根据检出的阳性样品数，评价该方法阳性符合率。

（6）试纸条的初步应用

应用所组装的试纸条对96份犬粪便样品（其中包括36份新疆地区犬细粒棘球绦虫感染参照样品，60份长春地区临床样品）进行检测，36份参照样品检出率为97.2%（35/36），60份临床样品结果均为阴性。

、结果

（1）特异性试验

结果只有犬细粒棘球绦虫参照阳性样品(b) T线显色，犬贾第虫(a)、犬蛔虫阳性粪便(c)和健康犬粪便(d) T线均无显色，表明无交叉反应，特异性良好。（见图3）

（2）敏感性试验

结果1:4倍稀释时T线仍有显色，所以该试纸条敏感性为1:4。（见图4）

（3）重复性试验

结果阴阳性样品的三次重复效果较好，结果比较一致，表明试纸条的重复性良好。

（4）保存期试验

结果表明4°、37°、室温存放1个月、2个月、3个月依旧能够显示正确结果， T/C线显色情况均也无太大区别，但4°和37°存放4个月时出现金标垫释放不够完全，且释放速度变慢，但仍能指示正确结果，说明该试纸条至少可以存放四个月以上。

（5）试纸条检测阳性粪便符合率试验

应用已经建立的胶体金试纸条检测方法，对10份新疆地区犬细粒棘球绦虫参照阳性粪便进行检测，结果表明， 10份样本均检测为阳性，说明该试纸条的阳性符合率为100%。

（6）试纸条的初步应用

应用所组装的试纸条对临床96份犬粪便样品（其中包括36份新疆地区犬细粒棘球绦虫感染参照样品，60份长春地区临床样品）进行检测，36份参照样品检出35份，检出率为97.2%，60份临床样品结果均为阴性。

<110> 吉林大学

<120>

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 8

<212> DNA

<213>细粒棘球绦虫EdiagA864基因(Echinococcus granulosus EdiagA864 gene)

<400> 1

1 GGAATTGTCGTCTTCCTTCTCGTCGTTGCC TACTGCTCAGGAGCGGAACCAGTGCCATGG

61 GGTTCTCGGATTGTTGGAACACCAGCAGGA AAATCACCAACTATGTATTTACGTCTTCCC

121 AAGGAGGCCTTGATAGTGGTGTTGAGAAAT GGCAGCCAATCTCTAATCGAAATTAAAAAT

181 GGCACGTGTTATCGTAATAATCAAGACTGG GGCTCTCCCTGCCAAATGGATGAAGGAAGT

241 GCCAACATCACTCTGAATGACGTATCCCAA CAGGAGGCATTACTAATATGGGATGGATCT

301 TCATTCACTTCTACAGTATTCTTCGTGCCA AATTGTACTTTTCAGACACCACAGCAAGGT

361 ACAGTCAATTTACAGACGTCGTTTCCACTT TCTCGATTTGGGAAAGGGCGATCGTATATC

421 GAAGTCGCATTTGCTGCTCAAGGTGCAAAC AACCAAACTGGGGCTTCAATTGAAGTGAAC

481 GGCCGAGTTGCGTGTAGATGGACAGGGACT ACTCTCGTTGCACATGACTCACCTTTCTGC

541 CGTAACATGACGAATGACACAGGATCAGAT CTGAGAACATTTGTCCTGAACATTACTCGA

601 AATGACGCTACTAATTATACCACAATTGAA TGGTCCGCCTTGACTACAGTATTAGTAGTT

661 AATATTGACTGGACGCAAGAGGGTGAATCG CCAGAAATAGCGGAATGCAGCAGATATCGG

721 GGTGAAACGACCACAACCTCTGCCGAACCT GGAGTGACGTCCACTTCCACGACCACGACC

781 TCTTCCGGACATGAGGCGACTTCCACTTTC ACGACTGTGATTGCACTGCTGTCGATGCTC

841 ATGCATTGGAGAAGACTTATTGGT

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222> (1)..(20)

<223>

<400>2

GGAATTGTCGTCTTCCTTCT 20

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222> (1)..(22)

<223>

<400>3

ACCAATAAGTCTTCTCCAATGC 22

Claims

1.一种检测犬细粒棘球绦虫感染胶体金免疫层析试纸条，主要包括玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸、PVC底板；其特征在于：

金标垫上的金标抗体为EdiagA864单克隆抗体2D12;硝酸纤维素膜上的指示线T线包被细粒棘球绦虫EdiagA864兔多克隆抗体、C线包被羊抗鼠抗体。

2.如权利要求1所述的一种检测犬细粒棘球绦虫感染胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：

通过克隆、表达纯化EdiagA864重组蛋白，制备并纯化单克隆抗体及兔多克隆抗体，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，之后利用胶体金对单克隆抗体进行标记，制备金标垫，并利用抗细粒棘球绦虫EdiagA864兔多克隆抗体作为检测线、羊抗鼠抗体作为质检线，其中：

EdiagA864重组蛋白的克隆、表达及纯化：

1）λ噬菌体插入基因的克隆

插入基因片段扩增引物序列由上海生工合成，如下：

Forward primer：5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'；

Reverse primer：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3' ；

2）开放性阅读框 PCR 扩增

ORF EdiagA864-F: 5’-GGATCCGGAATTGTCGTCTTCCTTCT-3’；

ORF EdiagA864-R: 5’-AAGCTTACCAATAAGTCTTCTCCAATGC-3’；

以 EdiagA864 PCR 扩增产物为模板进行开放性阅读框的 PCR 扩增

3）EdiagA864 克隆载体构建

将目的片段与 pMD-18T 载体连接，EdiagA864-18T 连接产物转化入感受态，对重组质粒进行鉴定以及双酶切鉴定；

4）EdiagA864 表达载体构建

ORF EdiagA864 基因与 pET-32a 质粒连接，连接产物转化入感受态，并进行双酶切验证；

所述的抗细粒棘球绦虫EdiagA864 单克隆抗体的制备：

1）动物免疫

免疫 6-8 周龄的雌性 Balb/c 小鼠；

免疫剂量应控制在 100-200μL/只，蛋白含量控制在 25-100μg/只；

2）骨髓瘤细胞与脾细胞融合

取处于对数生长期的骨髓瘤细胞与脾细胞进行融合；

3）阳性杂交瘤细胞株的筛选

用建立起的间接 ELISA 方法进行抗体的检测，筛选阳性杂交瘤细胞并进行克隆；

3）阳性杂交瘤细胞株的染色体分析

利用秋水仙素破坏细胞的纺锤丝、低渗处理、吉姆萨染色的方法处理杂交瘤细胞，显微镜下观察杂交瘤细胞染色体的形态和数目，单抗 2D12染色体数目为97条；

4）单克隆细胞亚型鉴定

利用抗体亚型鉴定试剂盒，对单克隆抗体进行亚型鉴定；结果单抗 2D12的重链亚型均为 IgG1，轻链亚型均为 Kappa；

5）单克隆抗体的大量制备

将杂交瘤细胞小鼠腹腔，收集腹水；

胶体金试纸条的制备：

硝酸纤维素膜21mm，样品垫24mm、金标垫9mm、吸水纸32mm从下到上依次粘贴于PVC底板上，样品垫压金标垫2mm，金标垫压NC膜2mm，吸水纸压NC膜2mm；依次粘贴好后，切成每条宽度为4mm的试纸条，T线包被细粒棘球绦虫EdiagA864兔多克隆抗体、C线包被羊抗鼠抗体即可。