CN112611872A - 一种犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心elisa检测试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心elisa检测试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用，包括包被有抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体。本发明还公开犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒的制备方法和应用。本发明具有操作简便、安全、快速、设备简单、主观因素误差小和人员技术水平要求低等优点，可以实现大批量样品的快速检测分析。

Description

一种犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒及其制 备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
包虫病(棘球蚴病)(Hydatid Disease，HD)主要由细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus,E.granulosus，Eg)的中绦期幼虫寄生在哺乳动物脏器内引起的疾病，是一种严重的人畜共患寄生虫病。包虫病呈世界性分布，遍及五大洲，在中东、南欧、拉丁美洲、中亚、澳大利亚和非洲部分国家流行，导致全球的公共卫生和经济问题，严重危害人民身体健康和生命安全、畜牧业的健康养殖、阻碍社会经济发展。在我国，包虫病流行区主要分布在内蒙古、宁夏、甘肃、四川、青海、新疆、西藏等省、自治区的牧区和半农半牧区，覆盖国土面积44％，受威胁人口约6600万，细粒棘球绦虫引起囊型包虫病，在人群中的发病率较高，占包虫病的95％，包虫病给当地患者及其家庭带来极大的痛苦和沉重的经济负担，是西部农牧区群众因病致贫、因病返贫的主要原因之一。
细粒棘球绦虫是一种两宿主寄生虫，其中间宿主种类较多，但绵羊是最主要的中间宿主，人也属于中间宿主，但不参与循环，是受害者，而终末宿主主要是犬、狐狸等犬科动物，成虫在终末宿主犬、狼、狐狸等食肉动物体内发育成熟后，其含卵的孕卵节片随粪便排出，随后每7～14d虫卵成熟、孕节脱落一次，成虫在犬体内生长约6个月，在此期间，不断有虫卵排出；中间宿主因摄入虫卵受到感染而发病。因此，包虫病发生的根源是犬体内的棘球绦虫释放的虫卵，终末宿主(犬科动物)是包虫病传播过程中最重要的传染源，了解和掌握家/牧犬感染Eg状况是包虫病流行病学调查中一项重要的指标，也是包虫病防控措施实施后判定干预效果考核的必要指标之一。
现阶段，市场上尚无有效的商品化预防犬感染细粒棘球绦虫的疫苗，准确且快速的诊断是高效防控包虫病的基础。国际公认的犬科动物包虫病诊断的金标准方法是氢溴酸槟榔碱下泻法，但是该方法存在弊端：(1)对操作人员感染风险大；(2)对环境造成污染；(3)少量犬不下泻，无法达到检测目的；(4)操作复杂，耗时较长；(5)不易进行大量检测等。
目前，获得新兽药证书的商品化的犬细粒棘球绦虫抗原检测试剂盒尚未出现在市场上。因此，开发一种快速、安全、简便、特异性强且敏感度高的检测方法将为犬科动物包虫病的诊断及控制提供有效的保障。
发明内容
本发明的目的在于提供一种犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用。本发明所提供的试剂盒和检测方法对犬细粒棘球绦虫抗原的检测具有特异性强、敏感性高以及操作简便等优点，能够实现大批量样品的快速检测。
其具体技术方案为：一种犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括包被有抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体。
优选地，所述包被抗体为抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体是由杂交瘤细胞Anti-XJEgSfAg-1F3分泌的，所述杂交瘤细胞株Anti-XJEgSfAg-1F3保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2020196；辣根过氧化物酶标记的抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体是由杂交瘤细胞Anti-XJEgSfAg-4E8分泌的，所述杂交瘤细胞株Anti-XJEgSfAg-4E8保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2020183。
优选地，该试剂盒还包括：封闭液、稀释液、洗涤液、显色液和终止液。
一种犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤；
1)包被：按100ng/孔加入稀释的包被抗体(1F3单抗)，4℃包被22～24h，得包被有抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体的酶标板；
2)封闭：用洗涤液充分洗涤3次，最后一次拍干，加入封闭液，150μL/孔，4℃下封闭22～24h；甩去封闭液，洗涤液洗板拍干后烘干酶标板，铝箔袋真空包装，得封闭好的包被有抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体的酶标板；
3)酶标单抗的制备：NaIO4氧化法标记4E8单抗，得辣根过氧化物酶(HRP)标记的单抗；
4)将辣根过氧化物酶标记的4E8单抗单独封装，并与封闭装好的包被有抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体的酶标板一起放置包装盒中，即得试剂盒。
本发明所述犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒在制备犬细粒棘球绦虫抗原检测试剂过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明以抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体作为捕获抗体，其特异性的捕获样品中的细粒棘球绦虫抗原，与采用多抗作为捕获抗体，其特异性更好。本发明以抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体为检测抗体，该抗体不仅与细粒棘球绦虫抗原具有良好的反应原性，同时也具有很高的特异性，能够与细粒棘球绦虫表膜抗原反应，而与泡状带绦虫抗原、多头绦虫抗原、犬钩蛔虫抗原、多房棘球绦虫抗原等无交叉反应，因此能提高检测结果的准确性。本发明通过对检测条件进行优化和筛选，最终建立了犬细粒棘球绦虫抗原的双抗夹心ELISA检测方法，实现了针对犬细粒棘球绦虫抗原的特异性检测。通过对样品进行预处理，可以保障检测人员的安全。与现有技术相比，本发明具有操作简便、安全、快速、设备简单、主观因素误差小和人员技术水平要求低等优点，可以实现大批量样品的快速检测分析。
附图说明
图1：SDS-PAGE分析1F3单克隆抗体。M：Marker；泳道1：纯化后的1F3单抗。
图2：SDS-PAGE分析4E8单克隆抗体。M：Marker；泳道1：纯化后的4E8单抗。
图3：特异性质控样品的SDS-PAGE分析。M：Marker；泳道1：细粒棘球绦虫成虫表膜抗原蛋白；泳道2：多房棘球绦虫抗原蛋白；泳道3：多头绦虫抗原蛋白；泳道4：泡状带绦虫抗原蛋白；泳道5：犬钩蛔虫抗原蛋白。
图4：单克隆抗体1F3的Western blot验证。M：Marker；泳道1：细粒棘球绦虫成虫表膜抗原蛋白；泳道2：多房棘球绦虫抗原蛋白；泳道3：多头绦虫抗原蛋白；泳道4：泡状带绦虫抗原蛋白；泳道5：犬钩蛔虫抗原蛋白。
图5：单克隆抗体4E8的Western blot验证。M：Marker；泳道1：细粒棘球绦虫成虫表膜抗原蛋白；泳道2：多房棘球绦虫抗原蛋白；泳道3：多头绦虫抗原蛋白；泳道4：泡状带绦虫抗原蛋白；泳道5：犬钩蛔虫抗原蛋白。
图6：免疫组织切片。A：单克隆抗体1F3与细粒棘球绦虫成虫反应呈棕色(40×)；B：单克隆抗体4E8与细粒棘球绦虫成虫反应呈棕色(40×)；C：SP2/0腹水与细粒棘球绦虫成虫反应不着色(40×)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1试剂盒的制备
1.抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体的制备
选取12～16周龄健康雄性Balb/c小鼠，按500μL/只体积注射液体石蜡使Balb/c小鼠致敏，10天后可用于制备腹水。将杂交瘤细胞株Anti-XJEgSfAg-1F3和Anti-XJEgSfAg-4E8进行扩大培养后，于腹腔注射雌性BALB/c小鼠l×106～5×106个杂交瘤细胞，约10～15日后，待小鼠腹围增大后，使用无菌注射器针头采集腹水。将收集到腹水以1000r/min离心10分钟，收集中间层，用0.45μm滤器过滤后即为相应的含单克隆抗体的腹水。
2.单克隆抗体的纯化
将单克隆抗体与饱和硫酸铵以1:1的比例混合，4℃沉淀4h，8000rpm离心10min，弃去上清，沉淀用PBS溶解，0.22μm滤膜过滤除去不溶性沉淀。应用Hi Trap Mab Select SuRe预装柱对上述溶液进行亲和层析，具体步骤参考产品说明书。纯化后的蛋白使用BCA蛋白测定试剂盒测定抗体浓度。
经SDS-PAGE分析纯化后的抗体，如图1所示，纯化后的1F3单抗可见两条链，重链大小为55KDa，轻链大小为30KDa，无明显杂带；如图2所示，纯化后的4E8单抗可见两条链，重链大小为55KDa，轻链大小为25KDa，无明显杂带。
3.试剂盒的组装
封闭液：1％BSA和5％蔗糖的PBS缓冲液
稀释液：含0.01％果绿色素的PBS缓冲液
洗涤液：含0.1％吐温-20的PBS缓冲液(PBST)
显色液：TMB显色液
终止液：0.5M H2SO4
试剂盒的制备方法如下：
1)包被：按100ng/孔加入稀释的包被抗体(1F3单抗)，4℃包被22～24h，得包被有抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体的酶标板；
2)封闭：用洗涤液充分洗涤3次，最后一次拍干，加入封闭液，150μl/孔，4℃下封闭22～24h；甩去封闭液，洗涤液洗板拍干后烘干酶标板，铝箔袋真空包装，得封闭好的包被有抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体的酶标板；
3)酶标单抗的制备：NaIO4氧化法标记4E8单抗，得辣根过氧化物酶(HRP)标记的单抗；
4)将辣根过氧化物酶标记的4E8单抗单独封装，并与封闭装好的包被有抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体的酶标板一起放置包装盒中，即得试剂盒。
实施例2样品检测
1.待检犬粪样的前处理：将待检的犬粪样
在-70℃冷冻一周后室温解冻取1g样品，加1mL样品稀释液，振荡混匀，4000r/min离心15分钟，上清用于检测，用样品稀释液10倍稀释待检样品离心后的上清液。
2.将处理好的样品加入酶标板，100μL/孔，置37℃孵育30min；
3.甩去样品液，洗涤液洗板3次，加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体4E8，200ng/孔，加入酶标板，置37℃孵育30min；
4.甩干孔内液体，洗板3次，加入TMB底物显色液，100μL/孔，37℃避光显色15min；
5.加入终止液，50μL/孔；
6.酶标仪测定OD450nm值；
7.结果判定：测量孔/犬Eg阳性对照均值≥0.2为阳性，其余孔为阴性。
特异性质控样品的SDS-PAGE分析如图3所示。
实施例3检测条件优化
1.包被浓度和酶结合物浓度的确定
包被抗体1F3单抗按照800ng/孔、400ng/孔、200ng/孔、100ng/孔及50ng/孔包被酶标板，将酶标抗体(4E8-HRP)以梯度稀释作检测抗体，按照前述流程建立双抗夹心ELISA检测方法。判定标准为：测定OD450nm值，规定测量孔/犬Eg阳性对照均值≥0.2为阳性，其余孔为阴性。当包被抗体1F3单抗浓度为100ng/孔，酶标抗体(4E8-HRP)浓度为200ng/孔时，P/N值为39.9最大，如表1所示，故选择100ng/孔作为包被浓度，200ng/孔为酶标抗体的工作浓度。
表1最佳包被浓度和酶标抗体工作浓度的确定
Figure BDA0002872165400000071
2.封闭液种类的优化
按照前述流程建立双抗夹心ELISA检测方法，分别选取含5％脱脂奶的PBS、含1％BSA和5％蔗糖的PBS、含10％FBS的PBS及含1％的鱼明胶的PBS作为封闭液。结果如表2所示，当封闭液为5％脱脂奶时，P/N值最大，故最佳封闭液为含1％BSA和5％蔗糖的PBS。
表2封闭液种类选择表
Figure BDA0002872165400000072
3.封闭条件的优化
以上述确定的包被抗体浓度、封闭液，按照前述流程建立双抗体夹心ELISA检测方法来确定封闭条件。结果如表3所示，在2～8℃封闭22～24小时条件下，P/N值最大，因此判定封闭的最佳时间为22～24小时。
表3封闭条件选择表
Figure BDA0002872165400000073
Figure BDA0002872165400000081
4.抗原抗体反应时间的优化
以上确定的包被抗体包被浓度、封闭液和封闭条件，按照前述流程建立双抗体夹心ELISA方法来优化抗原最佳反应时间。结果如表4所示，37℃作用时间为30min时P/N值最大，故选此条件。
表4抗原反应时间选择表
Figure BDA0002872165400000082
5.酶标抗体与抗原/抗体结合物反应时间的优化
以上述确定的包被抗体包被浓度、封闭液、封闭条件和抗原抗体最佳反应时间，按照前述建立双抗体夹心ELISA方法来确定酶标抗体与抗原/抗体结合物最佳反应时间。结果如表5所示，37℃作用时间为30min时P/N值最大，故选此条件进行后续实验。
表5酶标抗体与抗原/抗体结合物最佳反应时间选择表
Figure BDA0002872165400000083
6.TMB底物反应时间的优化
以上述确定的包被抗体包被浓度、封闭液、封闭条件、抗原抗体最佳反应时间和酶标抗体与抗原/抗体结合物最佳反应时间，按照前述建立双抗体夹心ELISA方法来确定底物最佳反应时间。结果如表6所示，37℃孵育15min时，P/N值最大，故选此条件。
表6 TMB底物反应时间选择表
Figure BDA0002872165400000091
7.犬细粒棘球绦虫抗原ELISA检测试剂盒阴阳性临界值的确定
用作该实验的样品来自金标准方法——氢溴酸槟榔碱下泻法获得的犬粪样。采用氢溴酸槟榔碱下泻法验证了243份细粒棘球绦虫阳性样品和112份阴性样品，统计犬细粒棘球绦虫抗原ELI SA检测试剂盒对以上样品的检测结果，利用SPSS16.0软件对其进行ROC曲线分析，从而确定了S/P值与敏感性和特异性的数量关系。结果证明，所建立的ROC曲线具有较高的准确性。进一步将本试剂盒的临界值确定为0.2，判定标准即：若S/P值≥0.2，样品应判定为阳性；若S/P值＜0.2，样品应判定为阴性。
实施例4检测效果评价
1.犬细粒棘球绦虫抗原ELISA检测试剂盒的敏感性
用氢溴酸槟榔碱下泻法收集190份细粒棘球绦虫阳性样品，按照3批前述建立的犬细粒棘球绦虫抗原ELISA检测试剂盒进行检测。样品的判定标准为：
若S/P值≥0.2，样品应判定为阳性；若S/P值＜0.2，样品应判定为阴性。经过统计，该试剂盒对190份阳性样品的平均敏感性为94.56％。
2.犬细粒棘球绦虫抗原ELISA检测试剂盒的特异性
氢溴酸槟榔碱下泻法收集180份细粒棘球绦虫阴性样品，按照3批前述建立的犬细粒棘球绦虫抗原ELISA检测试剂盒进行检测。样品的判定标准为：
若S/P值≥0.2，样品应判定为阳性；若S/P值＜0.2，样品应判定为阴性。经过统计，该试剂盒对180份阴性样品的平均特异性为98.15％。
制备5种特异性质控：
细粒棘球绦虫表膜抗原、泡状带绦虫抗原、多头绦虫抗原、多房棘球绦虫抗原、犬钩蛔虫抗原，按照3批前述建立的犬细粒棘球绦虫抗原ELISA检测试剂盒进行交叉实验检测。样品的判定标准为：若S/P值≥0.2，样品应判定为阳性；若S/P值＜0.2，样品应判定为阴性。经过检测，细粒棘球绦虫表膜抗原为阳性，
泡状带绦虫抗原、多头绦虫抗原、多房棘球绦虫抗原和犬钩蛔虫抗原均为阴性，即3批该试剂盒对5种特异性质控的特异性为100％。
3.犬细粒棘球绦虫抗原ELISA检测试剂盒批间和批内可重复性
采用3批犬细粒棘球绦虫抗原ELISA检测试剂盒实验室试制品，每批随机抽取5盒20份阳性样品和10份阴性样品重复检测，统计以上检测数据，计算每批次的批内变异系数和各批次的批间变异系数，以此确定试剂盒的可重复性。结果显示本试剂盒的批内变异系数为1.041％～9.545％，批间变异系数为1.126％～9.707％，两者均在正常变化范围之内，表明本试剂盒的可重复性良好。
4.犬细粒棘球绦虫抗原ELISA检测试剂盒比对实验
为验证“犬细粒棘球绦虫抗原ELISA检测试剂盒”于不同地区、不同操作人员之间的检验稳定性，分别在国家动物包虫病参考实验室、新疆建设兵团动物疫病预防与控制中心、四川省动物疫病预防控制中心和宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心4所试验单位，对30份已知背景的样品进行检测，以确定本试剂盒对不同环境条件的适应性。根据不同地域的4家试验单位检测结果，本试剂盒对样品盘中敏感性质控与阴性质控的检出率均达100％，检测结果与样品背景保持相同；并且，3批次试剂盒对同一份样品的检测结果均一致。说明本试剂盒对不同环境条件的适应性良好。
5.犬细粒棘球绦虫抗原ELISA检测试剂盒的符合率
国际上公认的检测犬细粒棘球绦虫的金标准方法是氢溴酸槟榔碱下泻法。为验证本试剂盒的整体检测效果，以氢溴酸槟榔碱下泻法为标准，考察3批犬细粒棘球绦虫抗原ELISA检测试剂盒对184份样品的检测情况。经过检测，3批本试剂盒与氢溴酸槟榔碱下泻法检测的平均符合率为95.83％。
6.临床样本检测
临床试验检测样品主要来源于新疆生产建设兵团动物疫病预防控制中心、四川省动物疫病预防控制中心和宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心，3家合作单位共提供2067份犬粪样，其中新疆生产建设兵团动物疫病预防控制中心提供犬粪样710份、四川省动物疫病预防控制中心提供犬粪样692份和宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心提供犬粪样665份。通过检测新疆生产建设兵团动物疫病预防控制中心提供犬粪样710份中阳性样品31份，阴性样品679份，样品阳性率为4.37％；四川省动物疫病预防控制中心提供犬粪样692份中阳性样品29份，阴性样品663份，样品阳性率为4.19％；宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心提供犬粪样665份中阳性样品28份，阴性样品637份，样品阳性率为4.21％。
实施例5杂交瘤细胞Anti-XJEgSfAg-1F3和Anti-XJEgSfAg-4E8的筛选
本发明种涉及的抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体(1F3单抗和4E8单抗)以及分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株(Anti-XJEgSfAg-1F3和Anti-XJEgSfAg-4E8)，已于本专利申请的同日申请了另一项中国发明专利，专利名称为“一种抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及其应用”。
筛选杂交瘤细胞株Anti-XJEgSfAg-1F3和Anti-XJEgSfAg-4E8所使用的免疫原为细粒棘球绦虫成虫表膜抗原(EgSfAg)，制备方法：将液氮里保存的细粒棘球绦虫成虫取出，镜检观察，形态学鉴定细粒棘球绦虫，该虫虫体2～7mm长不等，分4节，成熟节片较长，有4个吸盘，头沟明显(28～34个)，生殖孔偏后，鉴定为细粒棘球绦虫成虫。用含1％Triton X-100的PBS冲洗，反复颠倒15～20次，3000r/min，离心15分钟，收集上清，即细粒棘球绦虫表膜抗原，用BCA定量试剂盒测定蛋白浓度，经0.22μm滤器过滤除菌，置-70℃以下保存。
首先，利用制备的EgSfAg免疫小鼠，取小鼠脾细胞进行细胞融合，利用间接ELISA法筛选融合后的杂交瘤细胞，随后进行3次亚克隆进一步筛选，获得能稳定分泌高亲和力细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞，将筛选出的4株细胞分别命名为杂交瘤细胞株Anti-XJEgSfAg-1F3、Anti-XJEgSfAg-2D10、Anti-XJEgSfAg-4E8和Anti-XJEgSfAg-9B12。然后制备、纯化和鉴定单克隆抗体，并采用间接ELISA测定杂交瘤细胞的培养上清效价，结果发现Anti-XJEgSfAg-1F3和Anti-XJEgSfAg-4E8的效价较高且非常稳定，表明Anti-XJEgSfAg-1F3和Anti-XJEgSfAg-4E8优于其余两株。
接着，通过Western blot鉴定单克隆抗体的特异性。结果表明，杂交瘤细胞株Anti-XJEgSfAg-1F3和Anti-XJEgSfAg-4E8分泌的单克隆抗体仅与细粒棘球绦虫成虫表膜抗原发生特异性反应，与泡状带绦虫抗原、多头绦虫抗原、多房棘球绦虫抗原和犬钩蛔虫抗原不反应，说明单克隆抗体1F3和4E8能鉴别细粒棘球绦虫抗原。
单克隆抗体1F3的Western blot验证如图4所示。单克隆抗体4E8的Western blot验证如图5所示。免疫组织切片如图6所示。
本发明中的杂交瘤细胞株Anti-XJEgSfAg-1F3和Anti-XJEgSfAg-4E8，于2020年10月26日送交湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2020196和CCTCC NO:C2020183。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换均属于本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括包被有抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体。
2.根据权利要求1犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被抗体为抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体是由杂交瘤细胞Anti-XJEgSfAg-1F3分泌的，所述杂交瘤细胞株Anti-XJEgSfAg-1F3保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2020196；辣根过氧化物酶标记的抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体是由杂交瘤细胞Anti-XJEgSfAg-4E8分泌的，所述杂交瘤细胞株Anti-XJEgSfAg-4E8保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2020183。
3.根据权利要求1犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括：封闭液、稀释液、洗涤液、显色液和终止液。
4.一种权利要求1所述犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤；
1)包被：按100ng/孔加入稀释的包被抗体1F3单抗，4℃包被22～24h，得包被有抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体的酶标板；
2)封闭：用洗涤液充分洗涤3次，最后一次拍干，加入封闭液，150μl/孔，4℃下封闭22～24h；甩去封闭液，洗涤液洗板拍干后烘干酶标板，铝箔袋真空包装，得封闭好的包被有抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体的酶标板；
3)酶标单抗的制备：NaIO4氧化法标记4E8单抗，得辣根过氧化物酶HRP标记的单抗；
4)将辣根过氧化物酶标记的4E8单抗单独封装，并与封闭装好的包被有抗细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的单克隆抗体的酶标板一起放置包装盒中，即得试剂盒。
5.一种权利要求1所述犬细粒棘球绦虫抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒在制备犬细粒棘球绦虫抗原检测试剂过程中的应用。
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