CN101806801A - 快速检测乳制品中β-内酰胺酶的试剂板制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速检测乳制品中β-内酰胺酶残留的试剂板，可用于检测乳制品中的β-内酰胺酶。本发明试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和质控线，可将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。该试剂板可进行半定量直观检测，整个操作过程仅需20～30min，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛选，适合工商部门、检验检疫机构、奶站及乳制品生产加工企业对原料及成品进行大规模快速检测。

Description

快速检测乳制品中β-内酰胺酶的试剂板制备方法

技术领域

本发明涉及一种快速检测乳制品中β-内酰胺酶残留的试剂板的制备方法，具体涉及一种检测β-内酰胺酶药物残留的免疫胶体金快速检测试剂板的制备方法。

背景技术

β-内酰胺酶(β-lactamase)是β-内酰胺类抗生素耐药细菌分泌的一种胞外酶，可选择性地分解牛奶中残留的β-内酰胺类抗生素，俗称“解抗剂”，常被用来人为添加到生鲜乳中降解残留的青霉素类、头孢类等抗生素，以达到“无抗奶”标准。

β-内酰胺酶作为添加剂看似起到了消除奶制品中β-内酰胺类抗生素残留的效果，但是牛奶中添加“解抗剂”会导致病菌对青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而使喝奶的人抵抗传染病的能力大大降低；(2)虽然目前尚无β-内酰胺酶直接危害人体健康的相关资料，但β-内酰胺类抗生素酶解后，可能引进其他有害物质；(3)这种做法纵容了奶牛饲养过程中抗生素的滥用。

据调查，北京市场6成以上样品奶检出“解抗剂”。2006年5月至8月间，中国药品生物制品检定所的崔生辉等人分3次从北京零售市场上随机采集了5个厂家生产的38份牛奶样品进行检测，结果有63.12％(24/38)检出了β-内酰胺酶。由此，当前乳品市场β-内酰胺酶的普遍违规添加现象可见一斑。

针对此种现象，2008年底卫生部会同工信部、农业部等9部门印发了卫监督发〔2008〕60号文《关于开展全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治的紧急通知》，2009年2月4日专项整治专家委员会发布了食品整治办〔2009〕5号文件《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第二批)》，严令禁止β-内酰胺酶在乳与乳制品中的添加。为保障消费者的利益，建立对“解抗剂”(β-内酰胺酶)的快速检测方法是十分必要的。

目前，国内外检测乳及乳制品中β-内酰胺酶的方法主要有杯碟法、碘量法、纸片法(产色头孢菌素法)和高效液相色谱法。

杯碟法是卫生部指定检验乳及乳制品中β-内酰胺酶的检验方法，检出限为4U/mL。该方法在微生物实验室推广性强，但存在重复性差的问题，由于检测所需时间长，需要微生物常规灭菌及培养等仪器设备支撑，不适宜现场检测。

相对于杯碟法，碘量法操作快速简便，整个检测约需60～80min，可作为快速筛选方法，但是碘量法在每次实验时均需要做阳性和阴性对照，对反应时间要求严格，且不同牛奶样品检测现象差别较大，容易出现假阳和假阴，需要做进一步研究。

纸片法，又称产色头孢菌素法，操作简便快速，相比杯碟法来说更能被广大实验室所接受。

高效液相色谱法测定乳品中β-内酰胺酶不仅操作方法复杂、费时，且不论是直接测定还是间接测定均只能定性判断样品中是否含β-内酰胺酶，故相比之下该法的适用性很有限。

发明内容

本发明针对乳及乳制品中非法添加现象普遍的β-内酰胺酶药物开展研究，拟开发一种用于现场快速筛选β-内酰胺酶阳性牛奶样本的检测技术，并开发成可用于现场检测乳品中β-内酰胺酶含量的试剂板。

本发明应用层析式抗体免疫竞争原理，通过抗原和金标抗体反应显色，特异性检测原奶样品中的β-内酰胺酶含量。如果样品溶液中β-内酰胺酶残留高于检测限，则β-内酰胺类药物将被完全分解掉，不与胶体金结合垫上的金标抗体活性位点结合，金标颗粒上的全部活性位点与T线上的特异性抗原结合，此时T线较C线显色深或差不多，判定为阳性；反之，当样品溶液β-内酰胺酶残留低于检测限时，金标抗体活性位点被未完全分解掉的β-内酰胺类药物占据，从而无法与T线上特异性抗原结合，此时T线较C线显色浅甚至无显色，判定为阴性。

本发明中该检测方法涉及的试剂板由上下两块塑料模板、背衬及粘附在背衬上依次紧密相连的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成。

其中样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻各部分间有1-2mm的重叠，其目的一方面是保证层析作用从样品垫到吸水垫部位顺利进行，另一方面是为了使样品溶液与样品垫有充分反应时间，样品垫上的缓冲体系可以中和样品溶液的酸碱度，保证样品溶液中的有效成分与胶体金结合垫上的金标抗体顺利发生反应。

胶体金结合垫上包被有青霉素单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有青霉素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。偶联青霉素的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)等。

本发明试剂板的各部分组成成分与功能如下：

塑料模板，起固定试纸条及标示功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用。

背衬为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。

样品垫由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液pH值的作用。

胶体金结合垫由聚酯膜制成，其上标记有青霉素G单克隆抗体与胶体金的结合物，是样品溶液中的有效成分与金标抗体发生反应的场所。

硝酸纤维素膜部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。

吸水垫为滤纸，作为吸水部分其作用是将移动上来的多余的溶液吸收。

本发明试剂板具有如下有益效果：

(1)特异性好，本发明试剂板与青霉素G的交叉反应率为100％，与氨苄青霉素的交叉反应率为80％，与卡那霉素、链霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素的交叉反应率均小于0.1％。对青霉素类抗生素反应均有高度专一性。

(2)灵敏度高，本发明试剂板对β-内酰胺酶的最低检出限为3U/mL。同时，可实现随温浴时间变化灵敏度灵活可调。

(3)操作简单快捷，不依赖任何实验设备，不需任何专业培训。本发明试剂板将反应所需的大部分原料整合到试剂条中，滴样后抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短了检样时间，且样品无需特殊处理，滴样后3-5分钟内即可用肉眼通过判断硝酸纤维素膜上的检测线和质控线的颜色深浅读取结果，检测过程无需特殊仪器辅助，普通人员均可操作，不需要专业培训，极易推广使用。

(4)成本低，效益好。本发明试剂板生产工艺成熟、流程简单，生产成本低廉，投资少，收效快。

附图说明

图1为β-内酰胺酶免疫胶体金快速检测试剂板结构示意图，其中1为样品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为控制线，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC板。

图2为β-内酰胺酶免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为控制区，T为检测区。

图3为β-内酰胺酶免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中C为控制区，T为检测区。

具体实施方式

本发明试剂板的制备包括青霉素-BSA偶联物的制备，抗青霉素单克隆抗体的制备，胶体金溶液的制备，胶体金标记抗青霉素单克隆抗体的制备和β-内酰胺酶免疫胶体金快速检测试剂板的组装。

1.青霉素G与载体蛋白的偶联

采用戊二醛法将青霉素G钠盐与载体蛋白偶联制备免疫抗原和包被抗原。称取50mg青霉素G钠盐溶于3mL水中，用10mL PB缓冲液(0.1mol/L PH 6.0)溶解50mg牛血清白蛋白，加入到上述溶液中，再缓慢加入2mL 10％戊二醛溶液，将混合溶液室温下搅拌2h，双蒸水透析5天，滤膜过滤后，收集。

卵清蛋白(OVA)替代BSA，同同样方法制备氯霉素-OVA偶联物。

2.抗青霉素单克隆抗体的制备

取6～8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的青霉素G-BSA偶联物与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按100μg/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫1次，用不完全佐剂腹腔注射。融合前3d强化免疫1次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行：将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1∶10的比例混合，在50％PEG作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37℃、5％CO₂培养箱中培养。

融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛选择10mg/L青霉素G-OVA偶联物(此处载体蛋白与作为免疫原的载体蛋白应为不同种类)包被酶联板，被测孔加培养上清，孵育、清洗后，加入羊抗鼠IgG-HRP(1∶1000)，OPD显色。筛选出的阳性孔再用青霉素G-OVA偶联物(同初筛)包被的酶联板进行阻断间接ELISA。将细胞培养上清与2×10^-3mol/L青霉素溶液等量混合，37℃感作1h，加入已包被的酶标板中。另外用PBS(0.01mol/L、pH7.4)替代青霉素溶液作对照，其余步骤同上。若青霉素阻断后的OD值降至对照孔的50％以下，则判为阳性孔。经2～3次检测都呈阳性的孔，立即用有限稀释法进行克隆化。

体外培养：将克隆化的细胞株扩大培养，细胞浓度达5×10⁵mL^-1时停止换液，细胞全部死亡后收集培养液。体内诱生腹水：给腹腔注射液体石蜡10天后的小鼠腹腔注射克隆化细胞株10⁷个细胞，7天后抽取腹水。

3.胶体金溶液的制备

胶体金颗粒的平均大小为30nm，其制备方法为在100mL去离子水中加入1mL 1％柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入1mL 1％氯金酸，继续煮沸10min，冷却后，4℃下保存备用。

4.胶体金标记抗青霉素单克隆抗体的制备

取已制备好的100mL胶体金溶液，用0.1mol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入1.5mg抗青霉素单抗，搅拌20min，再逐滴加入2mL 25mol/L聚乙二醇20000(PEG 20000)，搅拌15min。20,000rpm离心15min，弃上清液，加入10mL pH 7.4PBS缓冲液(含0.4mol/LPEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2％BSA的PBS缓冲液(pH 7.4)溶解，用0.22μm无菌过滤器过滤后，4℃保存备用。

5.β-内酰胺酶免疫胶体金快速检测试剂板的组装

参照图1，用点膜机把适当浓度的青霉素G-BSA偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，37℃烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金标记青霉素单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。

检测试剂组成为一个PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。

7.β-内酰胺酶免疫胶体金快速检测试剂板检测实施例操作方法

7.1样品制备

在试剂板中附带的配备有药片的离心管中加入1mL待检牛奶和1mL β-内酰胺酶专用缓冲溶液，放入37℃水中温浴。

温浴时间与检测灵敏度关系见表1。

表1温浴时间与产品灵敏度关系表

温浴时间	30min	20min	10min	6min
					检测灵敏度	3U	5U	10U	20U

7.2检测步骤

取本发明中的试剂板，用滴管吸取待检溶液，在加样孔中滴入3滴(约100μL，加样时注意离心管不可离开水浴锅)，加样后开始计时，结果应在3～5分钟读取，其他时间判读无效。当室温低于20℃时，试剂板在检测前须放在试管架上(注意：贴近水面，不能触水)预热活化约5min后再使用。

7.3结果判断

读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面，如图2右侧所示。

阳性(+)：T线显色比C线深或一样深，表明样品中β-内酰胺酶类药物浓度高于4ng/mL。如图3.a所示。

阴性(-)：T线显色比C线浅，表明样品中β-内酰胺酶类药物浓度低于4ng/mL或无β-内酰胺酶类药物残留。如图3.b所示。

无效：未出现C线，可能操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新试剂板重新测试。如图3.c所示。

Claims (5)

1.一种快速检测乳制品中β-内酰胺酶残留的试剂板的制备方法，其特征在于醋酸纤维膜上的胶体金结合垫上包被有抗青霉素单克隆抗体-胶体金标记物，从样品垫到吸水垫方向依次是检测线和质控线，包被有青霉素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG。

2.如权利要求书1所说的标记物，其特征在于将胶体金与抗青霉素单克隆抗体按一定比例混匀，使胶体金与抗青霉素单克隆抗体形成稳定的纳米级胶体金颗粒，通过浓缩形成抗青霉素单克隆抗体-胶体金标记物。

3.如权利要求书1所说的检测线，其特征在于偶联青霉素的载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白。

4.如权利要求1所说的制备方法，其特征在于样品中的β-内酰胺酶含量超过试剂板检出限时，试剂板上的检测线显色较控制线深或一样深，判定为阳性；反之，当样品中β-内酰胺酶含量在试剂板检出限以下或无残留时，试剂板上的检测线显色比控制线浅，判定为阴性。

5.如权利要求1所说的制备方法，其特征在于工艺流程包括制备青霉素-牛血清白蛋白偶联物、制备抗青霉素单克隆抗体、制备胶体金溶液、制备胶体金标记抗青霉素单克隆抗体和组装β-内酰胺酶免疫胶体金快速检测试剂板。

Images