CN101357943A - 糖蛋白组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含具有Fc区的糖蛋白的组合物，该组合物中约80－100％的糖蛋白包含缺乏岩藻糖的成熟的核心碳水化合物结构，该结构附着于糖蛋白的Fc区。优选的糖蛋白是抗体和免疫粘附素。

Description

糖蛋白组合物

此案是基于申请日为2002年10月22日、中国申请号为02826018.X、发明名称为“糖蛋白组合物”的发明申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及包含具有改变的糖基化模式的糖蛋白的组合物。更具体地本发明涉及包含具有Fc区的糖蛋白的组合物，其中约80-100％的糖蛋白包含成熟的核心碳水化合物结构，该结构缺乏岩藻糖，附着于糖蛋白的Fc区。

背景技术

抗体

抗体是显示与特定抗原结合的特异性的蛋白。天然抗体通常是约150，000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，不同免疫球蛋白的同种型(isotype)的重链间二硫键数目不同。每条重链和每条轻链也都具有规则排列的链间二硫桥。每条重链在一个末端具有可变区(V_H)和多个恒定区。每条轻链在一个末端具有可变区(V_L)，在其另一末端具有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一恒定区并列，轻链的可变区与重链的可变区并列。据信特定氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成界面。

术语“可变的”指不同抗体的可变区特定部分的序列差异极大，并导致每种特定抗体对其特定抗原的结合特异性。然而，该可变性在抗体的可变区中并非均匀分布。它主要集中在轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDRs)的三个片段中。可变区较保守的部分称为框架区(FRs)。天然重链和轻链的可变区各包含四个FRs，大多数采用由三个CDRs连接的β-折叠构型，这三个CDRs形成连接β-折叠结构的环，在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs由FRs紧密相连，并且与来自另一条链的CDRs一起形成抗体的抗原结合位置(见Kabat等，Sequences of proteins ofImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。

恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但显示多种效应器(effectorfunctions)功能。根据其重链恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白可分为不同种类。主要有五种免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中几种可被进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4；IgA1和IgA2。相应于免疫球蛋白不同种类的重链恒定区分别称为α，δ，ε，γ，和μ。不同的人免疫球蛋白种类中，已知只有人IgG1，IgG2，IgG3和IgM活化补体；并且人IgG1和IgG3介导ADCC比IgG2和IgG4更有效。

图1A显示了天然IgG1的图示，该图示表明了天然抗体分子的各个部分。抗体经木瓜蛋白酶消化可产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残余的“Fc”片段，每个“Fab”片段都具有单独的抗原结合位点，“Fc”片段的名称反应了其易于结晶的能力。已测定人IgG Fc区的晶体结构(Deisenhofer，Biochemistry 20：2361-2370(1981))。在人IgG分子中，通过木瓜蛋白酶在N末端到Cys226的切割产生Fc区。Fc区对抗体的效应器功能很重要。

本发明还涉及其它抗体样分子。例如，已有文献报道“免疫粘附素”，它组合了异源蛋白(例如受体，配体或酶)的结合结构域和Fc区的效应器功能。此种分子的实例是美国专利5,610,297所述的肿瘤坏死因子受体-IgG(TNFR-IgG)免疫粘附素。已描述双特异免疫粘附素和抗体-免疫粘附素嵌合体。Stabila，P.，Nature Biotech，16：1357(1998)描述了另一种包含Fc区、胞浆膜锚着的融合蛋白。在该对比文件中，该融合蛋白结合位于胞浆膜的II型跨膜结构域，该跨膜结构域融合于Fc区的N末端。

抗体和免疫粘附素正被用作人类疾病的治疗剂。(Glennie等Immunol.Today 21：403-410(2000)；King等，Curr.Opin.Drug Discovery Develop2：110-117(1999)；Vaswani等，Ann.Allergy Asthma Immunol.81：105-119(1998)；和Abraham等，Sec.Intern.Autumnal Them.Meeting on Sepsis，Deauville，France(1995))。这些抗体和免疫粘附素中的一些可不利用抗体效应器机制起作用，例如与受体或配体结合并因此阻断配体受体相互作用的那些。其它可能需要募集(recruit)免疫系统来杀死靶细胞(Clynes等Nature Med.6：443-446(2000)；Clynes等PNAS(USA)95：652-656(1998)；和Anderson等Biochem.Soc.Trans.25：705-708(1997))。

抗体的效应器功能

抗体Fc区介导的效应器功能可分成两类：(1)抗体与抗原结合后启动的效应器功能(这些功能涉及补体级联作用或具有Fc受体(FcR)的细胞的参与)；和(2)不依赖抗原结合起作用的效应器功能(这些功能赋予在循环中的持续性和通过胞转(transcytosis)越过细胞屏障转移的能力)。Ward和Ghetie，Therapeutic Immunology 2：77-94(1995)。

尽管抗体与必需抗原的结合具有中和效应，可防止外来抗原与其内源性靶点(例如受体或配体)的结合，但结合本身不能去除外来抗原。为有效去除和/或破坏外来抗原，抗体应具有对其抗原的高亲合力和有效的效应器功能。

抗体和抗体-抗原复合物与免疫系统细胞的相互作用产生多种应答，包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)(综述见，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)；Ward和Ghetie，Therapeutic Immunol.2：77-94(1995)；以及Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991))。

Fc受体(FcRs)介导若干抗体效应器功能，该受体结合抗体的Fc区。按照对免疫球蛋白同种型的特异性定义FcRs；IgG抗体的Fc受体称为FcγR，IgE抗体的Fc受体称为FcγR，IgA抗体的Fc受体称为FcγR，以此类推。已鉴定FcγR的三种亚类：FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。由于每种FcγR亚类由二个或三个基因编码，并且可选地，RNA剪拼产生多种转录物，因此存在大量不同的FcγR同种型。编码FcγRI亚类(FcγRIA，FcγRIB和FcγRIC)的三种基因聚集在染色体1长臂上的1q21.1区；编码FcγRII亚类(FcγRIIA，FcγRIIB和FcγRIIC)的基因和编码FcγRIII(FcγRIIIA和FcγRIIIB)的两种基因都聚集在1q22区。这些不同的FcR亚型在不同的细胞类型上表达(综述见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991))。例如在人体内，FcγRIIIB只见于中性粒细胞，而FcγRIIIA见于巨噬细胞，单核细胞，自然杀伤细胞(NK)和T细胞亚群。

结构上，FcγR是免疫球蛋白超家族的所有成员，具有结合IgG的α链，其胞外部分由二个FcγRI和FcγRIII或三个(FcγRI)Ig样结构域组成。此外，FcγRI和FcγRIII具有附加的蛋白链(γ，ξ)，它们与在信号转导中起作用的α链相连。受体也由其对IgG的亲合力而被鉴别。FcγRI对IgG显示高亲合力，K_a＝10⁸-10⁹M^-1(Ravetch等Ann.Rev.Immunol.19：275-290(2001))，而且可结合单体IgG。相反FcγRII和FcγRIII对单体IgG显示相对较弱的亲合力，K_a≤10⁷M^-1(Ravetch等Ann.Rev.Immunol.19：275-290(2001))，并因此只与多聚体免疫复合物相互作用。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有类似的氨基酸序列，它们的主要差别在其胞浆区。活化受体FcγRIIA的胞浆区包含免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB的胞浆区包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(见

，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)中的综述)。NK细胞只携带FcγRIIIA，而且抗体与FcγRIIIA的结合导致NK细胞产生ADCC活性。

在人群中发现了若干人FcγR的等位基因变体。已证明这些等位基因变体形式在与人和鼠IgG的结合中显示差异，一些联合研究也将临床结果与特定等位基因形式联系起来(见Lehrnbecher等Blood94(12)：4220-4232(1999))。已有对FcγRIIA的两种形式R131和H131以及它们与临床结果的关系的若干研究。(Hatta等Genes and Immunity1：53-60(1999)；Yap等Lupus 8：305-310(1999)；和Lorenz等European J.Immunogenetics 22：397-401(1995))。而仅现在正在研究FcγRIIIA的两种等位基因形式F158和V158(Lehrnbecher等，见上文；和Wu等J.Clin.Invest.100(5)：1059-1070(1997))。FcγRIIIA(Val158)的同种异型与人IgG的反应优于FcγRIIIA(Phe158)的同种异型(Shields等J.Biol.Chem.276：6591-6604(2001)；Koene等Blood 90：1109-1114(1997)；和Wu等J.Clin.Invest.100：1059-1070(1997))。

Fc受体的另一种类型是新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn在结构上与主要组织相容性复合物(MHC)相似，并且由与β-微球蛋白非共价结合的α链组成。据称FcRn调节血液中IgG的动态平衡并可能控制组织间的胞转作用。(Ghetie等Annu.Rev.Immunol.18：739-766(2000))。

已确定人和鼠抗体上的FcγR结合位点位于由残基233-239组成的所谓“较低铰链区”(EU索引编号见Kabat等，Sequences of proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。Woof等Molec.Immunol.23：319-330(1986)；Duncan等Nature 332：563(1988)；Canfield和Morrison，J.Exp.Med.173：1483-1491(1991)；Chappel等，Proc.Natl.Acad.Sci USA88：9036-9040(1991)。在残基233-239中，据称P238和S239可能参与结合。

可能参与同FcγR结合的其它已述区域是：G316-K338(人IgG)结合人FcγRI(仅通过序列比对；没有评估取代突变体)(Woof等Molec.Immunol.23：319-330(1986))；K274-R301(人IgG1)结合人FcγRIII(根据肽)(Sarmay等Molec.Immunol.21：43-51(1984))；Y407-R416(人IgG)结合人FcγRIII(根据肽)(Gergely等Biochem.Soc.Trans.12：739-743(1984))；以及N297和E318(小鼠IgG2b)结合小鼠FcγRII(Lund等，Molec.Immunol.29：53-59(1992))。也见Armour等Eur.J.Immunol.29：2613-2624(1999)。

WO00/42072(Presta)描述了具有对FcRs增强或降低的结合的多肽变体。该专利公开的内容包含于本文中作为参考。也见Shields等J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001).

C1q和两种丝氨酸蛋白酶，C1r和C1s，形成复合物C1，它是补体依赖的细胞毒作用(CDC)途径的第一组分。C1q是六价分子，其分子量约为460,000，并且具有被比作一束郁金香花的结构，在该结构中，六个互相粘链的“茎”与六个球形头区相连。Burton和Woof，Advances in Immunol.51：1-84(1992)。为活化补体级联反应，需要C1q与IgG1，IgG2或IgG3中至少两个分子结合(大多数人认为IgG4不活化补体)，但只需要与一个IgM分子结合，从而附着于抗原靶点。Ward和Ghetie，Therapeutic Immunology2：77-94(1995)p80。

基于化学修饰和晶体学研究，Burton等Nature，288：338-344(1980)认为IgG上补体亚成分C1q的结合位点涉及CH2区最后两个(C末端)β链。Burton后来认为(Molec.Immunol.，22(3)：161-206(1985))包含氨基酸残基318到337的区可能参与补体固定。

Duncan和Winter Nature 332：738-40(1988)，利用定点诱变，报道Glu318，Lys320和Lys322形成对C1q的结合位点。Duncan和Winter的数据是通过检测小鼠IgG2b同种型与豚鼠C1q的结合产生的。通过包含这些残基的短合成肽抑制补体介导的溶解的能力证实了Glu318，Lys320和Lys322残基在C1q的结合中的角色。类似的结果在1997年7月15日公开的美国专利5,648,260和1997年4月29日公开的美国专利5,624,821中被公开。

通过分析人IgG亚类行使补体介导的细胞溶解的能力表明残基Pro331参与C1q结合。IgG4中Ser331突变成Pro331可赋予其活化补体的能力。(Tao等，J.Exp.Med.，178：661-667(1993)；Brekke等，Eur.J.Immunol.，24：2542-47(1994)).

通过比较Winter组和Tao等以及Brekke等的文章的数据，Ward和Ghetie在其综述中推断至少有两个不同的区参与C1q的结合：一个在CH2区的β链上，包含Glu318，Lys320和Lys322残基，另一个区的位置在与同一β链紧邻的转向(tum)处，包含位置331上的关键氨基酸残基。

其它报道称位于较低铰链区的人IgG1残基Lys235，和Gly237，在补体固定和活化中起重要作用。Xu等，J.Immunol.150：152A(Abstract)(1993)。1994年12月22日公开的WO94/29351报道人IgG1的C1q和FcR的结合必需的氨基酸残基位于CH2区的N末端区，即残基231到238处。

据称IgG结合C1q和活化补体级联反应的能力也有赖于位于两个CH2区之间的碳水化合物部分(通常锚着于Asn297)的存在、缺失或修饰。Ward和Ghetie，Therapeutic Immunology 2：77-94(1995)，第81页。

美国专利6,194,551B1和WO99/51642中描述了具有改变的Fc区的氨基酸序列和增加或降低的C1q结合能力的多肽变体。那些专利公开的内容包含于本文中作为参考。也见等J.Immunol.164：4178-4184(2000)。

其它增强免疫系统募集的方法包括双特异抗体，其中抗体的一条臂结合IgG受体(Segal等J.Immunol.Meth.248：1-6(2001)；以及细胞因子-IgG融合蛋白(Penichet等J.Immunol.Meth.248：91-101(2001))。

抗体的糖基化

许多多肽，包括抗体，经过涉及碳水化合物部分的多种翻译后修饰，例如以寡糖糖基化。此种糖基化的多肽称为“糖蛋白”。

若干因素影响糖基化。物种，组织和细胞类型对糖基化发生的方式很重要。此外，通过改变胞外环境的培养环境例如血清浓度，可能对糖基化有直接的影响。(Lifely等Glycobiology 5(8)：813-822(1995))。多种方法可改变特定宿主有机物的糖基化模式，包括引入或过度表达参与寡糖产生的特定酶(美国专利5,047,335；美国专利5,510,261)。这些方案不限于细胞内方法(美国专利5,278,299)。

所有抗体在重链恒定区的保守位置包含碳水化合物。每种抗体同种型都具有多种独特的N连接的碳水化合物结构。除了附着于重链的碳水化合物，约30％的人IgGs具有糖基化的Fab区。IgG在CH2区的Asn297具有单一的N连接双触角碳水化合物。本文图2显示附着于Asn297的充分加工后的碳水化合物结构。就连接于Asn297的碳水化合物而言，来自血清或在体外由杂交瘤制备或由改造后的细胞产生的IgG是异源性的。Jefferis等Immunol.Rev.163：59-76(1998)；和Wright等Trends Biotech 15：26-32(1997)。对于人IgG，核心寡糖通常由GlcNAc₂Man₃GlcNAc组成，其外部残基的数目不同。本文的图2显示将寡糖加工成成熟碳水化合物的方法。当初期合成的种类Glu₃Man₉GlcNac₂自核糖体脱出时，将它转移至抗体CH2区的Asn297。糖蛋白经过内质网时三个末端葡萄糖被修剪，此后糖蛋白移向高尔基体内侧网络(cis Golgi)，在该处甘露糖残基经α甘露糖苷酶的作用被去除。加工可停止于该结合点，产生高甘露糖基化的糖蛋白。否则，加工可继续进行产生Man₅GlcNac₂。高尔基体中间囊泡(medical Golgi)上的N-乙酰葡糖胺酰转移酶(N-acetylglycosaminyl transferase)I是复合寡糖合成中的限速步骤。在高尔基体中间和外侧网络中，寡糖经进一步加工修剪去掉甘露糖残基，并顺序加入糖残基。新合成的糖蛋白随后离开高尔基体，并被转运至细胞膜或被分泌。

通过半乳糖和/或半乳糖-唾液酸在两个末端GlcNac的附着或通过第三个GlcNAc臂(对分(bisecting)GlcNAc)的附着产生单个IgG间的变异。已对连接于IgG的Asn297的碳水化合物进行了研究。碳水化合物的缺失影响与C1q和FcγR的结合(并因此影响补体活化和ADCC)。Leatherbarrow等Molec.Immunol.22：407-415(1985)；Duncan等Nature 332：738-740(1988)；Walker等Biochem.J.259：347-353(1989)；Dorai等Hybridoma 10：211-217(1990)；和Horan Hand等Cancer Immunol.Immunother.35：165-174(1992)。尽管与FcRn的结合看似未受碳水化合物缺乏的影响，(Hobbs等Molec.Immunol.29：949-956(1992)；和Kim等Eur.J.Immunol.24：542-548(1994))，但对清除的影响是不确定的。(Dorai等Hybridoma 10：211-217(1990)；Horan Hand等Cancer Immunol.Immunother.35：165-174(1992)；Hobbs等Molec.Immunol.29：949-956(1992)；Kim等Eur.J.Immunol.24：542-548(1994)；Wawrzynczak等Biochem.Soc.Trans.17：1061-1062(1989)；和Tao等J.Immuno.143：2595-2601(1989))。当存在碳水化合物时，糖残基的性质也可影响IgG效应器功能。据报道末端半乳糖残基的存在或缺失可影响功能(Wright等J.Immunol.160：3393-3402(1998))并似乎与类风湿性关节炎相关(Parekh等Nature 316：452-457(1985))。自患有多发性骨髓瘤的病人血清中分离的人IgG在岩藻糖，半乳糖和对分N-乙酰葡糖胺的存在/缺失方面显示极端情况。(Parekh等Nature 316：452-457(1985))。Raju等描述了不同物种的IgG糖基化的变异(Raju等Glycobiology 10(5)：477-486(2000))。

Boyd等发现通过糖肽酶F的消化从源于CHO的CAMPATH-1H去除末端唾液酸不影响任何待测IgG活性，而发现从去除唾液酸后的CAMPATH-1H中去除多数半乳糖残基降低(但不完全破坏)补体溶解活性。其它活性未受去半乳糖基化的影响。Boyd等Molec.Immunol.32(17/18)：1311-1318(1995)。Kumpel等，Hum.抗bod.Hybridomas，5(3-4)：143-151(1994)报道人IgG单克隆抗体的半乳糖基化影响Fc受体介导的功能活性。

Rothman等检验了自杂交瘤纯化的单克隆IgG的ADCC功能，所述杂交瘤经在碳水化合物加工途径中的不同阶段起作用的糖苷酶抑制物的处理。Rothman等Molecular Immunol.26(12)：1113-1123(1989)。经栗树精胺(castanospermine)(抑制自初生寡糖去除葡萄糖残基(Kaushal等Meth.Enzymol.230：316-329(1994)))处理后，仅表达FcγRIII的NK细胞显示增强的ADCC，而其它类型的效应细胞例如单核细胞则不显示增强的ADCC。凝集素结合分析显示栗树精胺处理后的IgG缺乏岩藻糖；然而经栗树精胺处理产生的IgG可能具有其它的碳水化合物结构，例如高甘露糖基化以及末端葡萄糖残基(Kaushal等Meth.Enzymol.230：316-329(1994)；Hashim等Immunology63：383-388(1988)；Hashim等Molec.Immunol.24：1087-1096(1987))，它们在由未处理的细胞分泌或来自人血清的IgG上未被常规地发现。

WO 97/30087描述了糖基化抗体的制备，其中抗体Fc区的N糖基化位置被双触角(biantennary)的寡糖取代。

Umana等将β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(GcTIII)基因引入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，该酶催化向附着于抗体的Asn297的碳水化合物核心上添加对分GlcNAc。认为通过改造的CHO细胞产生的糖基化形式具有最优化的ADCC。见WO 99/54342和Umana等，Nature Biotechnology，17：176-180(1999)。

WO98/58964(Raju等)描述了抗体组合物，其中基本上所有N连接的寡糖是G2寡糖。G2指具有两个末端Gals而不具有NeuAcs的双触角结构。WO99/22764(Raju等)指其CH2区基本上不包含具有N连接的G1，G0或G-1寡糖的糖蛋白的抗体组合物。G1指具有一个Gal而不具有NeuAcs的双触角结构，G0指其中不存在末端NeuAcs或Gals的双触角结构，而G-1指核心单位减去一个GlcNAc。

WO00/61739报道了YB2/0(大鼠骨髓瘤)细胞表达的抗-hIL-5R抗体的47％具有α1-6岩藻糖连接的糖链，而NSO(小鼠骨髓瘤)细胞表达的该抗体的73％具有该糖链。不同宿主细胞表达的α-hIL-5R抗体的岩藻糖相对比例是YB2/0＜CHO/d＜NSO。

Routier等研究了CHO-DUKX细胞表达的人源化IgG1抗体(D1.3)的糖基化模式。CHO表达的该抗体的N-多糖结构是具有核心岩藻糖但缺乏对分GlcNAc和唾液酸的双触角N-多糖。因其末端半乳糖基化不同，上述结构是异质的，并因此被称作G₂，G₁和G₀。Routier等Glycoconjugate J.14：201-207(1997)。

已有报道O-连接的岩藻糖见于一些多肽中而且附着的岩藻糖对多肽的适当活性很重要。见WO98/33924，其描述了以O-岩藻糖部分进行糖基化的方法。Stankova等J.Immunol.135(6)：3719-3728(1985)发现岩藻糖显著增强混合白细胞培养(MCL)物诱导的或预孵育的效应细胞的溶细胞能力。Cameron等Immunol.Lett.11：39-44(1985)发现α-L-岩藻糖在巨噬细胞-肿瘤细胞相互作用中起重要作用。

本领域持续需要产生诸如抗体等具有改良生物活性的糖蛋白。

发明综述

本发明涉及具有Fc区的糖蛋白的糖蛋白组合物，组合物中约80-100％(优选约90-99％)的糖蛋白包含缺乏岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构，该结构附着于糖蛋白的Fc区。令人吃惊地，在本文中此种组合物与FcγRIIIA(F158)的结合显示增强100倍，但与人IgG的相互作用方面不及FcγRIIIA(V158)有效。因此，预计本文的组合物优于前述的组合物，尤其是对于治疗表达FcγRIIIA(F158)的人类病人。通常情况下，健康的非洲裔美国人和白人中，FcγRIIIA(F158)比FcγRIIIA(V158)更常见。见Lehrnbecher等Blood 94：4220(1999)。

本发明进一步证实由于本文的糖基化变体与糖蛋白Fc区的氨基酸序列修饰的结合导致FcγRIII结合和/或ADCC功能的协同增加。为产生具有增强的ADCC活性的Fc区氨基酸序列变体，技术人员通常改造具有增强的对FcγRIII的结合亲合力的Fc区变体，其被认为是介导ADCC的重要FcR。例如，技术人员可将氨基酸修饰(例如取代)引入亲本Fc区的氨基酸位点256，290，298，312，326，330，333，334，360，378或430中的任何一个或多个位置以产生此种变体。具有增强的对FcγRIII的结合亲合力的变体可进一步具有降低的对FcγRII的结合亲合力，尤其是对抑制性FcγRIIB受体的亲合力。在优选的实施方案中，Fc区在位置298，333和334具有氨基酸取代，例如S298A/E333A/K334A。具有改变的氨基酸序列的Fc区进一步包含更进一步增强ADCC的糖基化改变。例如，变体Fc区可附着于缺乏岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构。

因此，本发明提供包含具有Fc区的糖蛋白的组合物，组合物中的糖蛋白的约51-100％包含缺乏岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构，并附着于糖蛋白的Fc区，而且其中的Fc区包含与天然序列Fc区不同的氨基酸序列。更优选地，组合物中的糖蛋白约80-100％包含缺乏岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构，并更优选，组合物中的糖蛋白约90-99％缺乏附着于成熟核心碳水化合物结构的岩藻糖。

例如，所述糖蛋白可包括抗体和免疫粘附素。糖蛋白通常包含Fc区，优选人Fc区；例如人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的Fc区。糖蛋白显示对FcγRIII(例如FcγRIIIA(F158)和/或FcγRIIIA(V158))的增强的结合，并且相对于具有附着于其成熟核心碳水化合物结构的岩藻糖的糖蛋白ADCC增强。

本发明还提供药物制剂，它包含糖蛋白和可选的药用载体或稀释剂。可以用于治疗的制剂是无菌的并可以是冻干的。

本文涉及所述糖蛋白的诊断和治疗用途。在诊断应用中，本发明提供确定感兴趣抗原的存在的方法，包括将包含该抗原的可疑样品暴露于糖蛋白，并测定糖蛋白对样品的结合。

在治疗应用中，本发明提供治疗患有可从此种治疗中获益的疾病或有患该疾病倾向的哺乳动物的方法，包括对哺乳动物使用治疗有效量的本文的组合物，尤其在该组合物是药物制剂时。

本发明进一步提供了包含编码糖蛋白的核酸的宿主细胞，该糖蛋白包含Fc区，其中宿主细胞产生的糖蛋白的约80-100％包含成熟核心碳水化合物结构，该结构缺乏附着于糖蛋白Fc区的岩藻糖。此外，本发明提供了生产糖蛋白的方法，包括培养宿主细胞以表达所述核酸，并且可选地，自宿主细胞培养物中回收糖蛋白(例如从宿主细胞培养基中)。

本发明进一步提供了可用于治疗疾病的制品或试剂盒中的糖蛋白。

更具体地，本申请涉及下列内容：

1.包含具有Fc区的糖蛋白的组合物，该组合物中约80-100％的糖蛋白包含成熟的核心碳水化合物结构，该结构缺乏岩藻糖，附着于糖蛋白的Fc区。

2.项1的组合物，其中的糖蛋白包括抗体。

3.项1的组合物，其中Fc区包括人IgG Fc区。

4.项3的组合物，其中人IgG Fc区包括人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的Fc区。

5.项1的组合物，其中的糖蛋白结合FcγRIII。

6.项5的组合物，与具有附着于糖蛋白Fc区的包含岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构的糖蛋白相比，该组合物中的糖蛋白以更好的亲合力结合FcγRIII，或者更有效地介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。

7.项2的组合物，其中抗体是嵌合的，人源化的或人的抗体。

8.项2的组合物，其中抗体结合选自如下的抗原：B细胞表面标志物，ErbB受体，肿瘤相关抗原或血管生成因子。

9.项2的组合物，其中抗体结合CD20，HER2，血管内皮生长因子(VEGF)，CD40，或前列腺干细胞抗原(PSCA)。

10.项9的组合物，其中抗体包括人源化抗-HER2抗体，嵌合抗-CD20抗体和人源化抗-VEGF抗体。

11.项1的组合物，该组合物中约90-99％的糖蛋白包含成熟核心碳水化合物结构，该结构缺乏岩藻糖，附着于糖蛋白的Fc区。

12.项1的组合物，其中糖蛋白由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生。

13.项12的组合物，其中CHO细胞是Lec13细胞。

14.项1的组合物，其中糖蛋白基本不含附着于成熟核心碳水化合物结构的对分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。

15.项1的组合物，其中糖蛋白含有附着于成熟核心碳水化合物结构的对分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。

16.项1的组合物，其中糖蛋白含有附着于成熟核心碳水化合物结构的一个或多个半乳糖残基。

17.项1的组合物，其中糖蛋白基本不含附着于成熟核心碳水化合物结构的一个或多个半乳糖残基。

18.项1的组合物，其中糖蛋白含有附着于成熟核心碳水化合物结构的一个或多个唾液酸残基。

19.项1的组合物，其中糖蛋白基本不含附着于成熟核心碳水化合物结构的一个或多个唾液酸残基。

20.项1的组合物，它是一种药物制剂。

21.项20的药物制剂，进一步包含可药用的载体。

22.项1的组合物，它是无菌的。

23.项1的组合物，它是冻干的。

24.项1的组合物，其中糖蛋白是免疫粘附素。

25.包含具有Fc区的糖蛋白的组合物，该组合物中约51-100％的糖蛋白包含成熟核心碳水化合物结构，该结构缺乏岩藻糖，并附着于糖蛋白的Fc区，其中Fc区包含与天然序列Fc区不同的氨基酸序列。

26.项25的组合物，对其中的Fc区残基采用EU编号，该Fc区包含氨基酸位置256，290，298，312，326，330，333，334，360，378或430中的任何一个或多个位置上的氨基酸取代。

27.项26的组合物，其中Fc区包含对位置298，333和334中的任何二个或三个残基的氨基酸取代。

28.项27的组合物，其中Fc区包含对位置298，333和334的氨基酸取代。

29.项28的组合物，其中位置298，333和334上的取代残基是丙氨酸。

30.一种制品，其包括：

容器；

所述容器上的标签；和

包含在所述容器内的项1的组合物。

31.项30的制品，其中容器上的标签说明该组合物可用于治疗癌症，自身免疫性疾病，炎性疾病，感染，或其它需要去除细胞或组织的病症。

32.治疗哺乳动物的方法，包括以有效治疗能从该治疗获益的哺乳动物的疾病的量，将项1的组合物用药于哺乳动物。

33.项32的方法，其中的哺乳动物是人。

34.项33的方法，其中所述的人表达FcγRIII(F158)。

35.项32的方法，其中所述的疾病或病症选自：癌症，自身免疫性疾病，炎性疾病，感染，或其它需要去除细胞或组织的病症。

36.包含编码糖蛋白的核酸的宿主细胞，该糖蛋白包含Fc区，其中由该宿主细胞产生的糖蛋白约80-100％包含成熟核心碳水化合物结构，该结构缺乏岩藻糖，并附着于糖蛋白的Fc区。

37.项36的宿主细胞，其为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

38.产生糖蛋白的方法，包括培养项36的宿主细胞以便表达所述核酸。

39.项38的方法，进一步包括自宿主细胞培养物回收所述糖蛋白。

40.项39的方法，进一步包括将所述糖蛋白与异源分子偶联。

41.项40的方法，其中的异源分子是细胞毒剂或酶。

附图简述

图1A是天然IgG和其经酶消化所产生的各种抗体片段的图示。以CH1和CL区和两个CH2区之间的双线代表二硫键。V是可变区；C是恒定区；L代表轻链而H代表重链。图1B显示附着于血清IgG的Asn297的经充分加工或“成熟”的核心碳水化合物结构(2100)，具有单个半乳糖残基(2110)的成熟核心碳水化合物结构以及具有两个半乳糖残基和一个对分GlcNAc(3120)的核心碳水化合物结构。本图显示的四位编号系统反映了GlcNAc，岩藻糖，半乳糖和唾液酸残基各自的编号。

图2显示将寡糖添加到IgG CH2区的Asn297，随后在高尔基体内侧、中间和外侧对其进行加工以产生充分加工的复合双触角碳水化合物结构。栗树精胺抑制自初生寡糖去除葡萄糖和甘露糖残基。

图3显示具有正常岩藻糖代谢的CHO细胞表达的抗体上发现的重链(Fc)寡糖。

在整个附图说明和实施例中，使用以下名称：

“Hu4D5”是人源化抗-HER2 4D5抗体的简称，中国仓鼠卵巢简称为“CHO”，15cm板中培养的CHO-DP12细胞命名为“CHO-P”，旋转培养瓶(spinner flask)中培养的CHO-DP12细胞命名为“CHO-S”，人胚胎肾293细胞简称为“HEK293”，“Lec 13”代表由Albert Einstein College of Medicine ofYeshiva University Bronx，NewYork的Pamela Stanley提供的具有岩藻糖代谢缺陷的CHO细胞系。在其Fc区具有S298A/E333A/K334A取代的Hu4D5称为“Hu4D5-AAA”，“E27”是美国专利6,172,213描述的亲合力成熟的/人源化的抗-IgE抗体，在其Fc区具有S298A/E333A/K334A取代的E27称为“E27-AAA”，外周血单个核细胞抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用简称为“PBMC ADCC”。

图4显示Hu4D5单体与人FcγRI的结合。Hu4D5抗体在CHO-S，HEK293细胞，CHO-P，或Lec13 CHO细胞(不同的两批)中表达。

图5显示Hu4D5二聚体与人FcγRIIB的结合。Hu4D5抗体在CHO-S或Lec13细胞(不同的三批)中表达。

图6显示Hu4D5二聚体与人FcγRIIA(R131)的结合。Hu4D5抗体在CHO-S或Lec13细胞(不同的三批)中表达。

图7显示Hu4D5二聚体与人FcγRIIA(R131)的结合。Hu4D5抗体在CHO-S或Lec13细胞中表达(不同的三批)。

图8人FcγIIIA(V158)：Hu4D5二聚体的结合，该图显示CHO-S或Lec13细胞(分别是不同的三批和两批)中表达的Hu4D5或Hu4D5-AAA二聚体与人FcγIIIA(V158)的结合。

图9人FcγIIIA(F158)：Hu4D5二聚体的结合，该图显示CHO-S或Lec13细胞(不同的三批)中表达的Hu4D5二聚体或Lec13细胞(不同的两批)中表达的Hu4D5-AAA二聚体与人FcγIIIA(F158)的结合。

图10显示抗-IgE(E27)二聚体与人FcγRIIIA(V158)的结合。在该试验中检测了HEK293细胞，CHO-P细胞(两批)或Lec13细胞(两批)中表达的E27。

图11显示抗-IgE(E27)二聚体与人FcγIIIA(F158)的结合。在该试验中检测了HEK293细胞，CHO-P细胞(两批)或Lec13细胞(两批)中表达的E27。

图12抗-IgE E27六聚体与人FcγIIIA(F158)的结合，该图显示抗-IgE(E27)六聚体和E27-AAA与FcγIIIA(F158)的结合。该抗体是在CHO-P，Lec13或HEK293细胞中表达的。

图13抗-IgE E27六聚体与人FcγIIIA(V158)的结合，该图显示抗-IgE(E27)六聚体和E27-AAA与FcγIIIA(V158)的结合。该抗体是在CHO-P，Lec13或HEK293细胞中表达的。

图14mAb与人FcRn的结合，该图显示CHO-P，CHO-S或Lec13细胞中表达的Hu4D5与人FcRn的结合。

图15mAb与人C1q的结合，该图显示Hu4D5和抗-CD20(RITUXAN

)与人C1q的结合。Hu4D5在CHO-P或Lec13细胞(两批)中表达。RITUXAN

在CHO-P细胞中表达。

图16mAb与人C1q的结合，该图代表Hu4D5或RITUXAN与人C1q的结合。用于本试验的Hu4D5在CHO-P，Lec13(不同的三批)或CHO-S细胞中表达。RITUXAN

在CHO-P细胞中表达。

图17利用FcγRIII VF供体0557显示对SKBR3乳腺肿瘤细胞的PBMCADCC(E∶T 30∶1)。显示了自发ADCC与由CHO-S或Lec13细胞中表达的Hu4D5产生的ADCC的比较。

图18利用另一种FcγRIII VF供体8059显示对SKBR3乳腺肿瘤细胞的PBMC ADCC(E∶T 30∶1)。显示了自发ADCC与由CHO-S或Lec13细胞中表达的Hu4D5产生的ADCC的比较。

图19利用FcγRIII FF供体9123显示对SKBR3乳腺肿瘤细胞的PBMCADCC(E∶T 30∶1)。显示了自发ADCC与由CHO-S或Lec13细胞中表达的Hu4D5产生的ADCC的比较。

图20利用另一种FcγRIII FF供体1497显示对SKBR3乳腺肿瘤细胞的PBMC ADCC(E∶T 30∶1)。显示了自发ADCC与由CHO-S或Lec13细胞中表达的Hu4D5产生的ADCC的比较。

图21利用FcγRIIA RR供体8764显示对SKBR3乳腺肿瘤细胞的PBMCADCC(E∶T 10∶1)。利用FcγRIIA RR供体显示对SKBR3乳腺肿瘤细胞(E∶T10∶1)的PBMC ADCC。显示了自发ADCC与由CHO-S或Lec13细胞(不同的两批)中表达的Hu4D5产生的ADCC的比较。

图22利用FcγRIIA HH供体9730显示对SKBR3乳腺肿瘤细胞的PBMC ADCC(E∶T 10∶1)。显示了自发ADCC与由CHO-S或Lec13细胞中表达的Hu4D5产生的ADCC的比较。

图23显示天然序列IgG Fc区的比对。显示了天然序列人IgG Fc区的序列，humIgG1(非-A和A同种异型)(分别为SEQ ID NOs：1和2)，humIgG2(SEQ ID NO：3)，humIgG3(SEQ ID NO：4)和humIgG4(SEQ IDNO：5)。人IgG1序列是非-A同种异型，并在人IgG1序列下显示了该序列与A同种异型的差异(位置356和358；EU编号系统)。也显示了天然序列小鼠IgG Fc区的序列，murIgG1(SEQ ID NO：6)，murIgG2A(SEQ ID NO：7)，murIgG2B(SEQ ID NO：8)和murIgG3(SEQ ID NO：9)。

图24显示Hu4D5和Hu4D5-AAA与CD56阳性自然杀伤(NK)细胞的结合。被检物是：(1)FITC偶联的抗-人IgG，(2)来自CHO-S的Hu4D5，(3)Lec13细胞中表达的Hu4D5，和(4)Lec 13细胞中表达的Hu4D5-AAA。

图25显示表达FcγRIII(F/F)受体的纯化的NK细胞的免疫荧光染色。

图26提供了来自CHO-S的Hu4D5，来自Lec13细胞的Hu4D5，来自Lec 13细胞的Hu4D5-AAA，和来自HEK293细胞的Hu4D5的NK ADDC活性的比较。供体是FcγRIII(F/F)。

图27用不同的FcγRIII(F/F)供体重复了图26中的试验。

图28显示抗-HER2 Hu4D5单体与稳定转染人FcγRIIIAα链和γ链的CHO细胞系的结合(一次实验的图示)。Hu4D5 CHO-S，空心环；Hu4D5Lec13-D，空心正方形；Hu4D5 Lec13-E，空心菱形；Hu4D5 Lec13-F，空心三角形；Hu4D5 HEK293-AAA，实心环；Hu4D5 Lec13-AAA-B，实心正方形；Hu4D5 Lec13-AAA-C，实心菱形。

优选实施方案详述

I.定义

在本说明和权利要求书中，免疫球蛋白重链中残基的编号使用EU索引，如Kabat等所述，Sequences of proteins of Immunological Interest，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，第5版，其引入本文中作为参考。“Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号。

将参考通常用于描述寡糖的命名法描述本发明的碳水化合物部分。使用该命名法的碳水化合物化学的综述见Hubbard等Ann.Rev.Biochem.50：555-583(1981)。该命名法包括，例如，Man代表甘露糖；GlcNAc代表2-N-乙酰葡糖胺；Gal代表半乳糖；Fuc代表岩藻糖；和Glc代表葡萄糖。通过以简化符号NeuNAc代表5-N-乙酰神经氨酸，NeuNGc代表5-乙醇酰神经氨酸(5-glycolylneuraminic)描述唾液酸。

术语“糖基化”指寡糖(包含两个或更多连接在一起的单糖的碳水化合物，例如连接在一起的二到约十二个单糖)与糖蛋白的附着。寡糖侧链通常通过N或O连接与糖蛋白的骨干连接。本发明的寡糖通常作为附着于Fc区的CH2区的N连接的寡糖出现。

“N-连接的糖基化”指碳水化合物部分附着于糖蛋白链中的天冬酰胺残基。本领域熟练技术人员已知，例如小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3中的每一种，以及人IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgD CH2区在氨基酸残基297具有单独的N连接糖基化位点(Kabat等Sequences of蛋白s ofImmunological Interest，1991)。

“糖蛋白”是具有一个或多个附着于它的寡糖侧链的多肽。

本文的“成熟核心碳水化合物结构”指附着于Fc区的加工后的核心碳水化合物结构，通常由以下碳水化合物结构组成，GlcNAc(岩藻糖)-GlcNAc-Man-(Man-GlcNAc)₂，该结构通常是下图所示的双触角寡糖：

该术语特别包含缺乏β-1，2 GlcNAc残基的核心成熟碳水化合物结构的G-1形式。然而，优选该核心碳水化合物结构包含两种β-1，2 GlcNAc残基。本文的成熟核心碳水化合物结构通常不是高甘露糖基化的。

成熟核心碳水化合物结构通常通过与Fc区的CH2区的Asn297之间的N连接，附着于糖蛋白的Fc区。

“对分GlcNAc”是附着于成熟核心碳水化合物结构的β1，4甘露糖的GlcNAc残基。通过β(1，4)-N-乙酰葡糖胺酰转移酶III(Gn III)的作用，对分GlcNAc可附着于成熟核心碳水化合物结构。CHO细胞通常不表达GnTIII(Stanley等J.Biol.Chem.261：13370-13378(1984))，但经改造可以表达之(Umana等Nature Biotech.17：176-180(1999))。

“基本不含”一个或多个选定的糖基(例如对分GlcNAc，一个或多个半乳糖残基，或一个或多个唾液酸残基)的糖蛋白通常由将选定的糖基添加到成熟核心碳水化合物结构上有缺陷的宿主细胞产生，例如组合物中约90-100％的糖蛋白缺乏附着于成熟核心碳水化合物结构的选定的糖基。

“糖苷酶”是涉及天冬酰胺连接的(N-连接的)糖蛋白的生物合成的酶。“修剪(trimming)”酶是除去寡糖的酶，而“转移酶”添加寡糖。糖苷酶的实例包括修剪性葡萄糖苷酶(trimming glucosidase)例如葡萄糖苷酶I和葡萄糖苷酶II；修剪甘露糖苷酶例如粗面内质网甘露糖苷酶(rER甘露糖苷酶)，甘露糖苷酶IA，甘露糖苷酶IB和甘露糖苷酶II；以及转移酶如糖基转移酶，例如((1，4)-N-乙酰葡糖胺酰转移酶III(GnT III)，Gal-转移酶，唾液酸转移酶和岩藻糖转移酶。

“糖苷酶抑制物”指降低或阻止通过一种或几种糖苷酶所进行的N-连接的寡糖加工的化合物或组合物。实例包括，野艽霉素(nojirimycin)，1-脱氧野艽霉素(1-deoxynojirimycin)(dNM)，N-甲基-1-脱氧-野艽霉素(M-dNM)，栗树精胺(castanospermine)，溴环己烯四醇(bromoconduritol)，1-脱氧甘露野艽霉素(1-deoxymannojirimycin)(dMM)，australine，MDL，lentiginosine，和苦马豆素(Swainsonine)(Sw)。糖苷酶抑制物的综述见Fuhrmann等Biochim.Biophys.Acta 825：95-110(1985)；Kaushal和Elbein，Methods in Enzym.230：316-329(1994)；和Elbein，A.FASEB 5：3055-3063(1991)。

“Lec13”指凝集素抗性中国仓鼠卵巢(CHO)突变细胞系，该细胞系显示有缺陷的岩藻糖代谢，并因此具有降低的将岩藻糖添加到复合碳水化合物的能力。该细胞系在Ripka和Stanley，Somatic Cell & Molec.Gen.12(1)：51-62(1986)；和Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249(2)：533-545(1986)中描述并可自Albert Einstein College of Medicine of Yeshiva University，Bronx，New York获得。据信Lec13细胞缺乏GDP-D-甘露糖-4，6-脱水酶的转录物，该酶是岩藻糖代谢的关键酶。Ohyama等J.Biol.Chem.273(23)：14582-14587(1988)。GDP-D-甘露糖-4，6-脱水酶从GDP-甘露糖产生GDP-甘露糖-4-酮-6-D-脱氧甘露糖，后者随后被FX蛋白转化成GDP-L-岩藻糖。岩藻糖基化寡糖的表达有赖于GDP-L-岩藻糖供体底物和岩藻糖转移酶。

“岩藻糖转移酶”是将一个或多个岩藻糖添加于糖蛋白的酶。实例包括β-1，6-岩藻糖转移酶，FucTI，FucTII，FucTIII，FucTIV，FucTV，FucTVI和FucTVII。Uozumi等J.Biol.Chem.271：27810-27817(1996)，和Yanagidani等J.Biochem.121：626-632(1997)分别描述了猪和人α1，6-岩藻糖转移酶。

“唾液酸转移酶”是将一个或多个唾液酸残基添加到糖蛋白的酶。α2，3唾液酸转移酶可将唾液酸残基添加到附着于成熟核心碳水化合物结构的半乳糖残基。

“半乳糖转移酶”是将一个或多个半乳糖残基添加到糖蛋白的酶。β1，4-半乳糖转移酶可将半乳糖残基添加到成熟核心碳水化合物结构。

术语“包含Fc区的糖蛋白”指糖蛋白，例如包含Fc区的抗体或免疫粘附素。

术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，例如，如图1A所示。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的边界可变，人IgG重链Fc区通常被限定为自氨基酸残基Cys226位点，或自位点Pro230延伸至该重链羧基端的区段。免疫球蛋白的Fc区通常包括两个恒定区，CH2区和CH3区，如图1A所示。

“功能性Fc区”包括天然序列Fc区的“效应器功能”。“效应器功能”的实例包括：C1q结合；补体依赖的细胞毒作用(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，吞噬作用；细胞表面受体下调(例如B细胞受体，BCR)等。此种效应器功能通常需要Fc区与结合区(例如抗体的可变区)相组合，并可使用例如本文公开的多种方法对其进行评估。

“天然序列Fc区”包括与天然发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区显示于图23，并包括天然序列人IgG1 Fc区(非-A和A同种异型)；天然序列人IgG2 Fc区；天然序列人IgG3 Fc区和天然序列人IgG4 Fc区以及其天然存在的变体。天然序列小鼠Fc区也显示于图23。天然序列Fc区的其它实例包括天然序列人IgA Fc区和天然序列人IgD Fc区。

“变体Fc区”包含经过本文限定的至少一个“氨基酸修饰”，与天然Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。优选，变体Fc区与天然序列Fc区或与亲代多肽Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如天然序列Fc区中或亲代多肽Fc区中从约一个到约十个氨基酸取代，例如从约一个到约十个氨基酸取代，优选天然序列Fc区中或亲代多肽Fc区中从约一个到约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区将优选与天然序列Fc区和/或亲代多肽Fc区具有至少约80％的同一性，更优选地至少约90％的同一性，更优选地至少约95％的同一性。

“同一性”定义为经过序列比对氨基酸序列变体中相同残基的百分比，并在必要时引入缺口以获得序列最大百分比的同一性。本领域技术人员熟悉比对的方法和计算机程序。一种这样的计算机程序是“ALIGN-2”，该程序由Genentech，Inc.授权，其源代码已连同用户手册于1991年11月10日提交美国版权局，华盛顿特区，20559，

“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。而且，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)和包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体和这些受体的不同剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，这两种受体具有相似氨基酸序列，它们的差别主要在胞浆区域。活化受体FcγRIIA的胞浆区包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB的胞浆区包含免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)(参见Daeron，Annu.Rev.Immunol.，15：203-2349(1997)中的综述)。本文的Fc受体包括两种已知天然存在的人FcγRII同种异型，即FcγRII(H131)和FcγRII(R131)(由位置131的氨基酸决定(Clark等J.Immunol.143：1731-1734(1989)))，和人FcγRIIIA的天然存在的同种异型。人FcγRIIIA在位置48(Leu，His或Arg)和位置158(Val或Phe)上具有天然存在的同种异型。FcγRIIIA(V158)同种异型与人IgG的反应优于FcγRIIIA(F158)同种异型(Shields等J.Biol.Chem.276：6591-6604(2001)；Koene等Blood 90：1109-1114(1997)；和Wu等J.Clin.Invest.100：1059-1070(1997))。有关FcRs的综述可参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)；Capel等，Immunomenthods，4：25-34(1994)；和deHaas等，Lab.Clin.Med.，126：330-41(1995)。其它FcRs，包括有待将来鉴定的那些，均包含于本文术语“FcR”中。该术语还包括新生儿受体，FcRn，其负责将IgGs由母体转运至胎儿(Guyer等，J.Immunol.，117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.，24：249(1994))。

“抗体依赖细胞介导的细胞毒作用”或“ADCC”指一种细胞介导的反应，其中表达FcRs的非特异细胞毒作用细胞(例如自然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞的溶解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上FcγR的表达在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92(1991)464页的表3中总结。

“人效应器细胞”是表达一种或多种FcRs并行使效应器功能的白细胞。优选，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)，自然杀伤细胞(NK)，单核细胞，细胞毒性T细胞和中性粒细胞；优选PBMCs和NK细胞。效应器细胞可自其天然来源，例如自血液或PBMCs中分离。

“铰链区”通常被定义为人IgG1的自Glu216至Pro230的延伸区域(Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985))。可通过将形成重链间S-S键的最开始的和最后的半胱氨酸残基置于相同位置上，来比对其它IgG同种型的铰链区和IgG1的序列。

Fc区的“较低铰链区”通常被限定为紧邻铰链区C末端残基的延伸区，即Fc区的残基233到239。

本发明的“CH2”区用于描述具有至少一个N-连接寡糖的附着位点的CH2区，该位点通常在Asn297。本发明的糖蛋白的特征在于其包含或经修饰而至少包含具有人IgG CH2区的N-连接寡糖的CH2区。优选CH2区是人IgG1的CHγ2区。使用免疫球蛋白重链残基编号方式的EU索引，人IgGCH2区通常自Fc区的大约氨基酸231延伸至大约氨基酸340。

“CH3区”包括Fc区中C末端到CH2区残基的延伸区域(即IgG中自大约位点341的氨基酸残基到大约位点447的氨基酸残基)。

术语“氨基酸”指所有天然存在的α氨基酸的D和L的立体异构形式，及其类似物和衍生物。类似物定义为以通常具有相似性质的不同原子对氨基酸中的原子的取代。衍生物定义为具有附着于它的另一分子或原子的氨基酸。衍生物包括，例如氨基基团的乙酰化，羧基基团的氨化，或将两个半胱氨酸分子的硫残基氧化以形成胱氨酸。

本文的“多肽”通常指具有约十个以上氨基酸的肽和蛋白质。多肽可以和表达它的宿主细胞同源，或优选，可以是外源的，意味着它们是异源的，即，对所使用的宿主细胞而言是外来的，例如CHO细胞产生的嵌合的，人源化的或人抗体。

术语“抗体”是指最广义上的抗体并尤其包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异抗体(例如双特异抗体)和显示所需生物活性的抗体片段。

用于本发明目的的“抗体片段”包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合区或可变区或抗体的Fc区。抗体片段的实例包括线形抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

本文术语“单克隆抗体”是指自一群基本同质的(homogeneous)抗体群获得的抗体，即除了少量可能天然存在的突变以外，包含在该群中的各个抗体完全相同。单克隆抗体针对单个抗原位点高度特异。而且，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原的单个决定簇。除特异性外，单克隆抗体的优点在于可通过杂交瘤培养来合成，不受其它抗体污染。修饰词“单克隆”表明抗体的特点是来自基本同质的抗体群，而不解释为需通过任何特殊方法产生抗体。例如，根据本发明应用的单克隆抗体可通过Kohler等(Nature，256：495(1975))首先描述的杂交瘤法，或者重组DNA法制备(例如见美国专利4816567)。还可用例如Clackson等(Nature，352：624-628(1991))和Marks等(J.Mol.Biol.，222：581-597(1991))所述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。

本文中单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，但该链剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体(以及此抗体的片段，只要它们显示所需生物活性)的相应序列相同或同源。美国专利4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)。

非人(例如小鼠)抗体的“人源化”形式是包含非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在很大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者超变区的残基被具有所需特异性、亲合力和性能的来自非人物种例如小鼠、大鼠或家兔(供体抗体)的超变区残基所取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应非人残基取代。而且，人源化抗体可包括在受者抗体或供体抗体中未被发现的残基。这些修饰旨在进一步改善抗体的性能。通常，人源化抗体基本上包括至少一个(通常包括两个)可变区的全部，其中全部或基本上全部超变区环对应于非人免疫球蛋白的超变区环，而全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体可选还包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的Fc区。详见Jones等，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。

“人抗体”是具有相应于人产生的抗体的氨基酸序列的抗体和/或使用本文公开的任何一种制备人抗体的技术制备的抗体。人抗体的定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。使用各种本领域已知的技术可产生人抗体。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等Nature Biotechnology 14：309-314(1996)：Sheets等PNAS(USA)95：6157-6162(1998))；Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581(1991))。也可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物制造人抗体，该转基因动物可以是例如内源性免疫球蛋白基因被部分或完全灭活的小鼠。攻击后观察人抗体的产生，其与在人中所见的情形在各方面均十分相似，包括基因重排，组装，和抗体库。该方法在例如美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和以下科学出版物中描述：Marks等，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature368：812-13(1994)；Fishwild等，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。可选地，可通过将产生针对目的抗原(此种B淋巴细胞可自个体回收或在体外被免疫)的抗体的人B淋巴细胞永生化制备人抗体。见例如，Cole等，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boemer等，J.Immunol.，147(1)：86-95(1991)；和美国专利5,750,373。

本文中术语“超变区”是指抗体上负责与抗原结合的氨基酸残基。超变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变区中的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，重链可变区中的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequence of proteins of ImmunologicalInterest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))，和/或来自“超变环”的那些残基(即，轻链可变区中的残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)，重链可变区中的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基是那些可变区的残基而不是本文定义的超变区残基。

本文中所用术语“免疫粘附素”为抗体样分子，其组合了异源“粘附素”蛋白(例如受体，配体或酶)的“结合结构域”与免疫球蛋白恒定区。结构上，免疫粘附素包括不同于抗体的抗原识别和结合位点(抗原结合位点)，但具有所需结合特异性的粘附素氨基酸序列(即是“异源性的”)与免疫球蛋白恒定区序列的融合。

本文的术语“配体结合区”指任何细胞表面的天然受体或其至少保持相应天然受体性质上的配体结合能力的任何区或衍生物。在特定的实施方案中，受体来自于具有胞外区的细胞表面多肽，该多肽与该免疫球蛋白超家族的成员同源。其它不是免疫球蛋白超家族成员但又为该概念明确涵盖的受体是细胞因子的受体，特别是具有酪氨酸激酶(受体酪氨酸激酶)活性的受体，促红细胞生成素和神经生长因子受体超家族成员，以及细胞粘附分子，例如(E-，L-和P-)选择素。

术语“受体结合区”指任何受体的天然配体，包括细胞粘附分子，或至少保持相应天然配体性质上的受体结合能力的此种天然配体的任何区或衍生物。此外，该定义特别包括了上述受体的配体的结合序列。

“抗体-免疫粘附素嵌合体”包含将抗体(本文的)的至少一个结合区与至少一个免疫粘附素(本文的)结合的分子。抗体-免疫粘附素嵌合体的实例是双特异CD4-IgG嵌合体，见Berg等，PNAS(USA)88：4723-4727(1991)和Chamow等，J.Immunol.153：4268(1994)。

本文术语“制备物”定义了已被鉴定并分离和/或作为其环境的组分回收的组合物或糖蛋白。该制备物的环境的污染成分是干扰组合物或糖蛋白的诊断或治疗用途的物质，例如不需要的或不想要的糖形式(glycoform)，并且可包括酶，激素，和其它蛋白或非蛋白溶质。本发明的制备物基本不含这些污染物。在优选的实施方案中，糖蛋白制备物可被纯化(1)至通过Lowry方法测定的抗体重量的95％以上，并最优选大于99％重量，(2)至足以通过采用转杯式测序仪(spinning cup sequenator)得到N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基，或(3)至在还原或非还原条件下经SDS-PAGE及考马斯兰或优选银染色证实为均质。

本文的“药物制剂”是适合用药于哺乳动物，尤其是人的组合物。因此该组合物可用于治疗哺乳动物中的疾病或失调。此外，组合物中的活性成分糖蛋白经过一次或多次纯化或分离步骤，使得可能干扰其治疗用途的污染物从中分离出来。通常，药物制剂包含治疗性糖蛋白和可药用的载体或稀释剂，其实例在下文描述。该制剂通常是无菌的，也可以是冻干的。

本文的“亲本糖蛋白”是除岩藻糖附着于成熟核心碳水化合物结构外，具有与本发明糖蛋白变体相同的氨基酸序列和成熟核心碳水化合物结构的糖蛋白。例如在包含亲本糖蛋白的组合物中，约50-100％或约70-100％的亲本糖蛋白包含具有附着的岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构。

以比亲本糖蛋白“更好的亲合力”结合FcR的糖蛋白变体，是当结合实验中糖蛋白变体和亲本多肽的量基本相同时，以实质好于亲本糖蛋白的结合亲合力结合任何一种或几种上述的FcR的糖蛋白。例如，具有提高的FcR结合亲合力的变体与亲本糖蛋白相比，在FcR结合亲合力上可显示约5倍到约1000倍，例如从约10倍到约500倍的提高，其中按照如本文实施例公开的内容测定FcR结合亲合力。

与亲本多肽相比，“在人效应器细胞存在时更有效地介导抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)”的糖蛋白变体是当结合实验中糖蛋白变体和亲本糖蛋白的量基本相同时，在体外或体内比亲本糖蛋白更有效地介导ADCC的糖蛋白。通常，使用本文公开的体外ADCC实验可鉴定此种糖蛋白变体，但也涉及其它测定ADCC活性的实验或方法，例如在动物模型中等等。优选的糖蛋白变体介导ADCC的效率比其亲本糖蛋白高约1.5倍到约100倍，例如约2倍到约50倍，例如在本文公开的体外实验中。

“氨基酸修饰”指预先测定的氨基酸序列的氨基酸序列中的变化。修饰的实例包括氨基酸取代，插入和/或缺失。本文优选的氨基酸修饰是取代。

特定位点的“氨基酸修饰”，例如Fc区的氨基酸修饰，指特定残基的取代或缺失，或者与特定残基邻近的至少一个氨基酸残基的插入。“邻近”特定残基的插入指在其邻近一至二个残基内的插入。该插入可位于特定残基的N末端或C末端。

“氨基酸取代”指以另一个不同的“取代”氨基酸残基取代至少一个存在于预测定的氨基酸序列中的氨基酸残基。取代的一个残基或多个残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由基因密码编码)和选自以下的氨基酸：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；蛋氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。优选，取代残基不是半胱氨酸。以一个或多个非天然存在的氨基酸进行取代也包含在本文的氨基酸取代概念中。“非天然存在的氨基酸残基”指能够共价结合多肽链中的邻近氨基酸残基的残基，而不是上述的那些天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸残基的实例包括正亮氨酸，鸟氨酸，正缬氨酸，高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，例如Ellman等Meth.Enzym.202：301-336(1991)中描述的那些。为产生此种非天然存在的氨基酸残基，可使用Noren等Science 244：182(1989)和Ellman等，见上文中的方法。简言之，这些方法涉及以非天然存在的氨基酸残基以化学方法活化抑制tRNA，并随后进行RNA的体外转录和翻译。

“氨基酸插入”指至少一个氨基酸纳入预测定的氨基酸序列。尽管插入通常由一或两个氨基酸残基的插入组成，但本发明还涉及更大的“肽插入”，例如约三个到约五个甚至约十个氨基酸残基的插入。如上述，插入残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基。

“氨基酸缺失”指自预测定的氨基酸序列去除至少一个氨基酸残基。

“C1q”是包括免疫球蛋白Fc区的结合位置的多肽。C1q和两种丝氨酸蛋白酶，C1r和C1s，形成复合物C1，其是补体依赖的细胞毒作用(CDC)途径的第一成分。人C1q可自例如Quidel，San Diego，CA，作为商品购买。

“治疗”指治疗性疗法和防病或预防措施。需要治疗的包括那些已患该病或那些需预防该病的人。

文中的“疾病”指任何可从糖蛋白的治疗中受益的情况。包括慢性和急性疾病或包括使哺乳动物对所述疾病具有倾向性的那些病理情况。在一个实施方案中，该疾病是癌症，自身免疫病，炎性疾病，感染或其它情况例如需要去除不良组织或细胞的甲状腺肿。本文优选的待治疗疾病是癌症或自身免疫病。

术语“癌症”和“癌症的”指或描述哺乳动物以失控的细胞生长为典型特征的病理性情况。癌症的实例包括但不限于，癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤和白血病。此种癌症更具体的例子包括鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌，胃肠道癌，肺鳞状细胞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，和各种头颈部癌。

本文的“B细胞恶性疾病”包括非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，包括低级/滤泡状NHL，小淋巴细胞性(SL)NHL，中级/滤泡状NHL，中级弥漫型NHL，高级免疫母细胞性NHL，高级淋巴母细胞性NHL，高级小非凹陷(non-cleaved)细胞NHL，巨大肿块(bulkdy disease)NHL，套细胞(mantle cell)淋巴瘤，AIDS-相关的淋巴瘤，和原发性巨球蛋白血症；白血病，包括急性淋巴母细胞白血病(ALL)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，毛细胞白血病和慢性粒细胞白血病；和其它血液系统恶性疾病。针对B细胞表面标志物例如CD20的抗体可治疗此类恶性疾病。

“非激素依赖的”癌症是其生长不依赖于同癌症细胞表达的受体结合的激素的存在的一类癌症。施用可降低肿瘤中或其附近的激素浓度的药物或手术不能使此类癌症发生临床退化。非激素依赖的癌症的实例包括非雄激素依赖的前列腺癌，非雌激素依赖的乳腺癌，子宫内膜癌和卵巢癌。此种癌症可以开始是激素依赖的肿瘤，然后在抗激素治疗后，从激素敏感的阶段发展到激素抵抗的肿瘤。

本文中“自身免疫病”是一种源自个体自身组织或直接针对个体自身组织的非恶性疾病。自身免疫性疾病或失调的实例包括但不限于，炎性反应例如炎性皮肤病，包括银屑病和皮炎(如异位皮炎)；系统性硬化和硬皮病，与炎性肠管疾病相关的反应(例如克隆氏病(crohn’s disease)和溃疡性结肠炎)；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘迫综合症；ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏性疾病例如湿疹和哮喘以及其它涉及T细胞浸润的情况和慢性炎性反应；动脉硬化症；白细胞粘附缺陷；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化；雷诺综合症；自身免疫性甲状腺炎；过敏性脑脊髓炎；干燥综合症；幼年型糖尿病；和与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发超敏反应相关的免疫反应，常见于结核，结节病，多肌炎；肉芽肿病和血管炎；恶性贫血(艾迪森氏病)；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)感染性疾病；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括，但不限于冷球蛋白血症或Coombs阳性贫血)；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基底膜病；抗磷脂综合症；过敏性神经炎；Graves’病；Lambert-Eaton肌无力综合症；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多发性内分泌病；Reiter’s病；僵人综合症(stiff man syndrome)；白塞病；巨细胞动脉炎；免疫复合物肾炎；IgA肾病；IgM多发性神经病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症等等。

“炎性疾病”指由炎症造成的病理状态，通常由中性粒细胞的趋化作用引起。此种疾病的实例包括银屑病和异位皮炎；系统性硬化和硬皮病；与炎性肠病相关的反应(例如克隆氏病和溃疡性结肠炎)；缺血再灌注疾病包括手术组织再灌注损伤，心肌缺血病症例如心肌梗死，心脏骤停，心脏手术后再灌注和经皮穿透冠状血管扩张术(percutaneous transluminal coronaryangioplasty)后收缩，中风，和腹主动脉瘤；继发于中风的脑水肿，脑外伤；低血容量性休克；晕厥；成人呼吸窘迫综合症；急性肺损伤；白塞病；皮肌炎；多肌炎；多发性硬化；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；骨关节炎；狼疮肾炎；自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎，干燥综合症，血管炎；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性疾病；继发于败血症或外伤的多器官损伤综合征；酒精型肝炎；细菌性肺炎；抗原-抗体复合物介导的疾病包括肾小球肾炎；败血症；结节病；针对组织/器官移植的免疫病理应答；肺部炎症，包括胸膜炎，肺泡炎，血管炎，肺炎，慢性支气管炎，支气管扩张，弥漫性泛支气管炎，超敏反应性肺炎，特发性肺纤维化(IPF)，和囊性纤维化；等等。优选的指征包括急性肺损伤，成人呼吸窘迫综合症，缺血再灌注(包括手术组织缺血性损伤，心肌缺血和急性心肌梗死)，低血容量性休克，哮喘，细菌性肺炎和炎性肠管(bowel)病例如溃疡性结肠炎。自身免疫疾病可能与感染性疾病交叠，或反之。

“阻断”对异体抗原的“免疫应答”指减轻或防止至少一种由于暴露于异体抗原产生的免疫介导的应答。例如，通过预防或降低哺乳动物体内针对抗原的抗体的产生可减轻对异体抗原的体液反应。可选地，或此外，可抑制独特型；“平定”被同种抗体覆盖的细胞的去除；和/或通过抗原呈递细胞的损耗，影响对同种抗原(alloantigen)的呈递。

“外来抗原”指对暴露于它的哺乳动物是非内源或非天然的分子。外来抗原可以引起免疫应答，例如哺乳动物中体液和/或T细胞介导的应答。通常外来抗原会引起针对它的抗体的产生。本文涉及的外来抗原的实例包括免疫原性治疗剂，例如蛋白质如抗体，特别是包含非人氨基酸残基的抗体(例如啮齿类，嵌合/人源化，和灵长类化抗体)；毒素(可选地与目的分子例如抗体偶联，其中目的分子也可以是免疫源性的)；基因治疗病毒载体，例如逆转录病毒和腺病毒；移植物；感染性制剂(例如细菌和病毒)；同种抗原(即在同一物种的有些个体中出现，而在其它个体中不出现的抗原)例如血型的不同，人淋巴细胞抗原(HLA)，血小板抗原，在被移植器官上表达的抗原，血液成分，妊娠抗原(Rh)，和血友病因子(例如因子VIII和因子IX)。

本文的“肿瘤相关抗原”是其特征为在肿瘤细胞上的表达较正常细胞高的抗原。具体实例包括ErbB受体，B细胞表面标志物，神经节苷酯GD2，GD3和GM2(Ragupathi G.，Cancer Immunol.Immunother.43：152(1996))；CD52(Ginaldi等，Leukemia Research 22：185(1998))；前列腺干细胞抗原(PSCA)；和MAGE(Kirkin等，APMIS 106：665(1998)).

本文的“血管生成因子(angiogenic factor)”是刺激血管生成的分子。实例包括血管内皮生长因子(VEGF)，碱性或酸性纤维母细胞生长因子(FGF)，和血小板来源的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)。

“ErbB受体”是属于ErbB受体家族的受体蛋白酪氨酸激酶，并且包括EGFR，ErbB2，ErbB3和ErbB4受体和将在未来被鉴定的其它成员。ErbB受体通常包含结合ErbB配体的胞外区；亲脂跨膜区；保守的细胞内酪氨酸激酶区；和具有若干可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信号区。

术语“ErbB1”，“表皮生长因子受体”和“EGFR”在本文可互换使用，并且指如Carpenter等Ann.Rev.Biochem.56：881-914(1987)中公开的EGFR，包括其天然存在的突变体形式(例如如Humphrey等PNAS(USA)87：4207-4211(1990)中的缺失突变体EGFR)。erbB1指编码EGFR蛋白产物的基因。

术语“ErbB2”和“HER2”在本文可互换使用，并且指例如Semba等，PNAS(USA)82：6497-6501(1985)和Yamamoto等Nature319：230-234(1986)(Genebank保藏号X03363)中所述的人HER2蛋白。结合HER2的抗体的实例包括4D5，7C2，7F3和2C4，及其人源化变体，包括huMAb4D5-1，huMAb4D5-2，huMAb4D5-3，huMAb4D5-4，huMAb4D5-5，huMAb4D5-6，huMAb4D5-7和huMAb4D5-8，如美国专利5,821,337的表3所述，包含于文中作为参考；和WO01/00245中所述的人源化2C4突变体560，561，562，568，569，570，571，574，或56869。WO98/17797描述了7C2和7F3以及它们的人源化变体。优选的抗体是那些包含huMAb4D5-8，或人源化2C4突变体574的重链和轻链可变区的抗体。

“Trastuzumab”(HERCEPTIN

)是重组DNA来源的人源化抗体，它在基于细胞的检测中以高亲合力结合HER2的胞外区(Kd＝5nM)。该抗体是包含变体huMAb4D5-8的重链和轻链可变区的IgG1抗体，如美国专利5,821,337的表3所述。该抗体由CHO-DP12细胞产生。

“ErbB3”和“HER3”指在例如美国专利5,183,884和5,480,968以及Kraus等PNAS(USA)86：9193-9197(1989)中公开的受体多肽。

本文术语“ErbB4″”和“HER4”指在例如欧洲专利申请599,274；Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：1746-1750(1993)；和Plowman等，Nature，366：473-475(1993)中公开的受体多肽，包括1999年4月22日公布的WO99/19488中公开的其同种型。

本文的“B细胞表面标志物”是在B细胞表面表达的抗原，它可作为与之相结合的抗体的靶向目标。B细胞表面标志物的实例包括CD10，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD40，CD37，CD53，CD72，CD73，CD74，CDw75，CDw76，CD77，CDw78，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CDw84，CD85和CD86白细胞表面标志物。特别感兴趣的B细胞表面标志物是那些与哺乳动物的其它非B细胞组织相比，优先表达在B细胞上的标志物，并可在前体B细胞和成熟B细胞上表达。在一个实施方案中，所述标志物是像CD20或CD19一样，从该谱系的干细胞阶段到恰好最终分化成浆细胞之前的分化阶段，见于B细胞上的一种标志物。本文优选的B细胞表面标志物是CD19，CD20，CD22和CD40。

“CD20″抗原是见于外周血或淋巴器官中90％以上的B细胞表面的～35kDa，而非糖基化的磷蛋白质。CD20在早期前B细胞发育过程中表达，并持续存在，直到分化成浆细胞才消失。CD20存在于正常B细胞和恶性B细胞上。文献中CD20的其它名称包括“B淋巴细胞限制的抗原”和“Bp35”。在例如Clark等PNAS(USA)82：1766(1985)中描述了CD20抗原。

结合CD20抗原的抗体的实例包括：“C2B8”，现在称为“Rituximab”(“RITUXAN

”)(美国专利5,736,137，包含在文中作为参考)；钇-[90]标记的2B8小鼠抗体，称为“Y2B8”(美国专利5,736,137，包含在文中作为参考)；可选地以¹³¹I标记的小鼠IgG2a“B1”，以产生“¹³¹I-B1”抗体(BEXXAR^TM)(美国专利5,595,721，包含在文中作为参考)；小鼠单克隆抗体“1F5”(Press等Blood 69(2)：584-591(1987))；“嵌合2H7”抗体(美国专利5,677,180，包含在文中作为参考)；和单克隆抗体L27，G28-2，93-1B3，B-C1或NU-B2，自International Leukocyte Typing Workshop获得(Valentine等，Leukocyte Typing III(McMichael，Ed.，p.440，Oxford UniversityPress(1987))。

本文术语“Rituximab”或“RITUXAN”指针对CD20抗原的基因改造后的嵌合小鼠/人单克隆抗体，在美国专利5,736,137中称之为“C2B8″，包含在文中作为参考。该抗体包含小鼠轻链和重链可变区序列和人恒定区序列的IgG₁κ免疫球蛋白。Rituximab对约8.0nM的CD20抗原具有结合亲合力。Rituximab是由CHO DG44细胞产生的。

术语“哺乳动物”是指属于哺乳动物类的任何动物，包括人、牛、马、狗和猫。本发明优选的实施方案中，哺乳动物是人。

本文中“生长抑制剂”是指在体内或体外抑制细胞(例如癌症细胞)生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S期恶性细胞百分比的药物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期(在除S期以外的阶段)进展的药物，例如诱导G1停滞和M期停滞的药物。经典的M期阻断剂包括长春花类(长春新碱和长春花碱)，taxol，美登木素生物碱和topo II抑制剂如阿霉素、柔红菌素、依托泊甙和博来霉素等。那些使G1期停滞的药物还连带(spill over)使S期停滞，例如DNA烷化剂象他莫昔芬、强的松、达卡巴嗪、氮芥(mechlorethamine)、顺铂、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷等。详见“癌症的分子基础”Mendelsohn和Israel编，第一章，Murakami等的题为“细胞周期调节，肿瘤和抗肿瘤药物”的文章(WB Saunders：Philadephia，1995)，尤其见第13页。

“生长抑制性”抗体的实例是与抗原结合并抑制表达该抗原的细胞生长的那些。优选的生长抑制性抗-HER2抗体在约0.5到30μg/ml的抗体浓度下，抑制细胞培养中SK-BR-3乳腺肿瘤细胞的生长大于20％，并优选大于50％(例如从约50％到约100％)，其生长抑制是将SK-BR-3细胞暴露于抗体6天后测定的(见美国专利5,677,171，1997年0月14日公开)。优选的生长抑制抗体是huMAb4D5-8。

“诱导细胞死亡”的抗体是引起活细胞失去活力的抗体。文中的细胞是表达抗体结合的抗原的细胞。在补体和免疫效应细胞不存在时可测定体外细胞死亡，以区别抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)或补体依赖的细胞毒作用(CDC)诱导的细胞死亡。因此，可使用热灭活血清(即在补体不存在的情况下)和免疫效应细胞不存在的情况下进行细胞死亡的测定。为测定抗体能否诱导细胞死亡，以碘化丙啶(PI)，锥虫蓝(见Moore等Cytotechnology 17：1-11(1995))或7AAD的摄取进行评估，可相对于未经处理的细胞评定膜的完整性的丧失。优选的细胞死亡诱导抗体是在BT474细胞的PI摄取测定中诱导PI摄取的那些。

“诱导调亡”的抗体是诱导程序性细胞死亡的抗体，通过膜联蛋白V，DNA断裂，细胞皱缩，内质网扩张，细胞断裂，和/或膜小泡的形成(称为凋亡小体)测定程序性细胞死亡。细胞表达抗体结合的抗原。优选细胞是肿瘤细胞。评估与凋亡相关的细胞事件可采用多种方法。例如，通过膜联蛋白结合可测定磷脂酰丝氨酸(PS)易位；通过DNA梯子可评价DNA断裂；可通过亚二倍细胞中的任何增加评价核/染色体浓缩和DNA断裂。优选，诱导凋亡的抗体是在使用BT474细胞的膜联蛋白结合实验中，其导致膜联蛋白结合的诱导相对于未经处理的细胞为约2到50倍，优选约5到50倍，最优选约10到50倍。

术语“治疗有效量”指有效“治疗”个体或哺乳动物的疾病的药物的量。对于癌症，此药物治疗有效量可减少癌细胞的数量；减小肿瘤体积；抑制(即减慢到一定程度并优选停止)癌细胞对周围器官的浸润；抑制(例如减慢到一定程度并优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。根据阻止癌细胞的生长和/或杀死已有癌细胞的程度，该药物可以是抑制细胞生长和/或细胞毒作用的。对于癌症治疗，可通过例如评定肿瘤进展时间(TTP)和/或测定反应速率(RR)测定其功效。

“抗原表达的癌症”是一种疾病，它包含在其表面具有足够水平的抗原的细胞，从而使抗-抗原的抗体可与其结合并对癌症具有治疗效果。

“以受体过度活化”为特征的癌症是癌细胞中受体活化的程度显著超出同一组织类型中非癌细胞上该受体活化水平的癌症。此种过度活化可能是由于受体的过度表达和/或活化癌细胞中的受体的配体高于正常水平。此种过度活化可引起癌细胞的恶性状态和/或由癌细胞的恶性状态引起。在一些实施方案中，可对癌症进行诊断或预测性分析来确定导致受体如此过度活化的受体的扩增和/或过度表达是否存在。可选地，或此外，可对癌症进行诊断或预测性分析来确定导致受体过度活化的配体扩增和/或过度表达是否存在于癌症中。自此类癌症的亚类中，受体的过度活化可能由自分泌刺激途径引起。

“过度表达”受体的癌症是与同样组织类型的非癌细胞相比，在其细胞表面具有明显更高水平的受体，例如HER2的一种。此种过度表达可能由基因扩增或增加的转录或翻译引起。在诊断或预测性分析中，通过评估细胞表面上受体蛋白的增加水平(例如通过免疫组化分析；IHC)可测定受体的过度表达。可选地，或此外，可通过例如原位荧光杂交(FISH；见WO98/45479 published October，1998)，southern蛋白印迹，或聚合酶链反应(PCR)技术，例如实时荧光定量PCR(RT-PCR)，测定细胞中编码受体的核酸。也可通过测定生物液体例如血清中的脱落抗原(例如，胞外区)研究受体过度表达。(见，例如，美国专利4,933,294，1990年6月12日；WO91/05264，1991年4月18日公开；美国专利5,401,638，1995年3月28日公开；和Sias等J.Immunol.Methods 132：73-80(1990))。除了上述方法，熟练技术人员可利用多种体内实验方法。例如，可将病人体内的细胞暴露于可选地由可检测标志物标记的抗体，例如放射活性同位素，而且可以通过例如放射活性体外扫描或分析取自曾经暴露于该抗体的病人的活组织来评价抗体与细胞的结合。

“过度表达”配体的癌症是与同样组织类型的非癌细胞相比，产生明显更高水平的该配体的一种癌症。此种过度表达可能由基因扩增或增加的转录或翻译引起。在例如肿瘤活检或多种诊断实验如IHC，FISH，southern蛋白印迹，PCR或上述体内实验中，通过评估病人体内的配体(或编码它的核酸)的水平诊断性地测定配体的过度表达。

本文所用术语“细胞毒作用制剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意在包括放射性同位素(例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素)，化疗剂和毒素例如小分子毒素或细菌，真菌，植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。

“化疗剂”是在肿瘤治疗中使用的化学化合物。化疗剂实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa)h环磷酰胺(cyclosphamide)(CYTOXAN^TM)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)如苯并多巴(benaodopa)，卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；氮丙啶(ethyleneimine)和methylamelamine包括六甲蜜胺(altretamine)，三亚胺嗪(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥(nitrogenmustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌氮芥(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，盐酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin)，胆甾醇苯乙酸氮芥，松龙苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine)，尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素如阿克拉霉素，放线菌素，authramycin，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C(cactinomycin)，加利车霉素(加利车霉素)，carabicin，洋红霉素(chromomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放线菌素D，柔红菌素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，依索比星(esorubicin)，伊达比星(idarubicin)，发波霉素(marcellomycin)，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)，橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，嘌呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素；链脲霉素(streptozocin)，杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤，蝶罗呤，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷，双脱氧尿苷，去氟氧尿苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷，5-FU；雄激素类如二甲睾酮(calusterone)，丙酸甲雄烷酮(dromostanolong propionate)，环硫雄醇(epitiostanol)，美雄氨(mepitiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂如frolinic acid；醋葡内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；喷司他丁(pintostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼树酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK

；雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2’，2’”-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；乌拉坦(urethan)；长春碱酰胺；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；三胺硫磷(thiotepa)；taxanes，如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL

，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和紫杉萜(doxetaxel)(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊甙(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾(vinorelbine)；新霉酰胺(navelbine)；novantrone；替尼泊甙(teniposide)；柔红霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；esperamicins；capecitabine；以及上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。此定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素制剂，如抗雌激素制剂包括他莫昔芬(tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制剂4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，onapristone，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素制剂如氟他米特(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物质的药用盐、酸或衍生物。

本文术语“EGFR定向药物”指结合EGFR，并可选地，抑制EGFR活化的药剂。此种药剂的实例包括抗体和结合EGFR的小分子。结合EGFR的抗体的实例包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)，MAb 455(ATCC CRLHB8507)，MAb 225(ATCC CRL 8508)，MAb 528(ATCC CRL 8509)(见美国专利4,943,533，Mendelsohn等)及其变体，例如嵌合225(C225)和再造(reshaped)人225(H225)(见WO 96/40210，Imclone Systems Inc.)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利5,212,290)；如美国专利5,891,996中所述的结合EFGR的人源化和嵌合抗体；和结合EGFR的人抗体(见WO98/50433，Abgenix)。抗-EGFR抗体可以和细胞毒作用剂偶联，从而产生免疫偶联物(见例如，EP659，439A2，Merck Patent GmbH)。结合EGFR的小分子的实例包括ZD1839(IRESSA

)(Astra Zeneca)，CP-358774或OSI-774(TARCEVA^TM)(Genentech)和AG1478。

术语“细胞因子”是一般性术语，指由一个细胞群释放的对另一个细胞群起细胞间介质作用的蛋白。此种细胞因子的实例是淋巴细胞因子，单核细胞因子和传统的多肽激素。这些细胞因子包括生长激素，如人生长激素，N-甲二磺酰人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松驰素；前松驰素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲状腺刺激素(TSH)，促黄体(生成)激素(LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳激素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和β；苗勒氏管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；苯丙酸诺龙；血管内皮细胞生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductivefactors)；干扰素如干扰素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。本文中术语细胞因子包括天然蛋白或来自重组细胞培养物的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。

本文所用术语“前体药物”指药物学活性物质的前体或衍生物形式，其较亲本药物对癌细胞的细胞毒作用小并能被酶活化或转化成更具活性的亲本形式。见例如Wilman“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”BiochemicalSociety Transanctions，14，pp.357-382，615^th Meeting Belfast(1986)和Stella等，“Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，”Directed DrugDelivery，Borchardt等，(ed.)，pp.247-267，人a Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于，含磷酸盐前体药物，含硫代磷酸脂前体药物，含硫酸盐前体药物，含肽前体药物，D氨基酸修饰的前体药物，糖基化前体药物，含β内酰胺的前体药物，任选取代的含苯氧基乙酰胺的前体药物或任选取代的含苯基乙酰胺的前体药物，可被转化成更具活性且不具有细胞毒作用的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿嘧啶前体药物。可被衍生为本发明所用前提药物形式的细胞毒作用药物的实例包括，但不限于，上述那些化疗剂。

“脂质体”是由能向哺乳动物有效运送药物(如本文的抗体)的各类脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡。脂质体的组分通常排列为双层形式，与生物膜的脂质排列相似。

术语“包装插页”通常指包含在治疗产品的商品包装中给用户的说明，其包含有关适应症，用途，剂量，施用方法，禁忌症，和/或与使用此种治疗产品有关的说明。

“分离的”核酸分子是一种从通常与该多肽核酸天然来源相关的至少一种混合核酸分子中鉴定并分离的核酸分子。分离的核酸分子不同于其天然发现的形式。因此分离的核酸分子可从天然细胞中的该核酸分子区别出来。然而，分离的核酸分子包括包含于通常表达该多肽的细胞中的核酸分子，在该细胞中核酸分子位于与天然细胞不同的染色体位置。

术语“调控序列”指特定宿主有机体中可操作地连接的编码序列的表达所需的DNA序列。适合原核生物的调控序列，例如，包括启动子，可选地包括操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子，多腺苷化信号和增强子。

当与另一核酸序列发生功能关联时，核酸是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌性前导序列如果被表达为参与多肽分泌的前蛋白，其可操作地连接该多肽的DNA；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，其可操作地连接于该序列；或如果核糖体结合位点位于可促进翻译的位置，其可操作地连接编码序列。通常，“可操作地连接于”的意思是被连接的DNA序列是相邻的，并且如果是分泌性前导序列，应是相邻的并且处于阅读阶段。然而，增强子则不一定是相邻的。通过在方便的限制位点接合(ligation)而实现连接(linking)。如果此种位点不存在，合成的寡核苷酸连接物或连头的使用符合常规的作法。

本文术语“细胞”，“细胞系”，和“细胞培养”可互换使用并且所有此种名称包括其子代。因此，术语“转化体”和“转化后细胞”包括原代处理细胞及其衍生的培养物，而不考虑传代的次数。由于有意和无意的突变，也可理解所有子代的DNA含量均不是恰好相同的。具有与原始转化后细胞中筛选到的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突变体子代也包括在内。尽管命名截然不同，从上下文来看这一点是清楚的。

II.具体实施方案

本发明涉及制造基本均一的包含Fc区的糖蛋白制备物的方法，组合物中的糖蛋白约80-100％包含附着于糖蛋白Fc区的缺乏岩藻糖的成熟核心碳水化合物。在本文优选的实施方案中，所述蛋白是抗体或免疫粘附素。可通过例如以下方法制备糖蛋白(a)使用改造后的或突变体宿主细胞，其岩藻糖代谢是有缺陷的，因此它具有降低的(或不能)岩藻糖基化所表达的蛋白的能力；(b)在防止或降低岩藻糖基化的条件下培养细胞；(c)岩藻糖的翻译后去除(例如使用岩藻糖苷酶)；(d)所需碳水化合物的翻译后添加，例如在非糖基化糖蛋白的重组表达后；(e)糖蛋白的纯化用以选出未被岩藻糖基化的产物。本发明涉及结合这些典型方法(a)-(e)中的两种或多种方法。

最优选地，编码所需糖蛋白的核酸在宿主细胞内表达，该宿主细胞具有降低的(或不能)岩藻糖基化其中表达的蛋白的能力。优选，宿主细胞是二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，例如Lec13 CHO细胞，或例如，CHO-K1，DUX-B11，CHO-DP12或CHO-DG44 CHO宿主细胞，其经修饰使得其中产生的糖蛋白实质上不被岩藻糖基化。因此，细胞可能显示岩藻糖转移酶改变的表达或活性，或者宿主细胞中涉及将岩藻糖添加到N-连接的寡糖的另一种酶或底物可能具有减小的活性和/或降低的水平。

核心碳水化合物结构是成熟的，因此，通常应避免使用抑制物例如栗树精胺，它抑制或干扰成熟碳水化合物的加工。根据一个本发明优选的实施方案，从产生糖蛋白的重组宿主细胞中回收的组合物中的糖蛋白约80-100％具有附着于糖蛋白Fc区的缺乏岩藻糖的核心碳水化合物结构，下文称为“不含岩藻糖的糖蛋白组合物”。文中“回收”的意思是自宿主细胞培养物中直接获得而不经过纯化步骤(可富集不含岩藻糖的糖蛋白)的物质。

然而，本发明涉及通过各种技术富集不含岩藻糖的糖蛋白，例如使用凝集素底物从所需的组合物中去除含有岩藻糖的糖蛋白的纯化技术。

可以认识到来自不同批重组产生的糖蛋白的不含岩藻糖的糖蛋白的量不同。例如，在以下的实例中，不含附着于CHO-Lec13细胞表达的糖蛋白的岩藻糖的寡糖之总百分比的范围是88％-95％。

优选组合物中的糖蛋白约90-99％包含附着于糖蛋白Fc区的缺乏岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构。

碳水化合物结构的各种形式可存在于组合物中。例如，附着于糖蛋白的碳水化合物可由以下公式代表：

其中，

M是甘露糖。

GN是GlcNAc。

X₁是可选的对分GlcNAc残基，其具有任选地附着于对分GlcNAc的附加单糖。

X₂是优选的GlcNAc残基。

X₃是任选的Gal残基，一个Gal残基可附着于每个GN臂。

X₄是任选的末端唾液酸残基，可附着一个或二个唾液酸残基。

与同样的糖蛋白组合物相比，文中不含岩藻糖的糖蛋白组合物显示与一种或多种FcγRIII受体更好的结合，但该组合物中的大部分(例如约50-100％，或约70-100％)糖蛋白具有附着于成熟核心碳水化合物结构的岩藻糖(下文的“含有岩藻糖的糖蛋白组合物”)。例如，文中不含岩藻糖的糖蛋白组合物与含岩藻糖的糖蛋白组合物相比，显示100-1000倍更好的与FcγRIII，例如FcγRIII(F158)的结合。F158同种异型与人IgG的相互作用不如V158有效，因而这从治疗角度提供了显著的优点，尤其是在表达FcγRIII(F158)的病人中。此外，文中不含岩藻糖的糖蛋白组合物与其对应的含岩藻糖的糖蛋白组合物相比，显示更好的ADCC活性，例如约2-20倍提高的ADCC活性。

除了不含岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构，其它寡糖可附着于核心碳水化合物结构。例如，对分GlcNAc可以附着或不附着。通过举例，宿主细胞可能缺乏GnTIII酶并因此糖蛋白可基本不含对分G1cNAc。可选地，糖蛋白可在添加了对分GlcNAc的宿主细胞中表达(例如Y0宿主或改造的CHO细胞)。一个或多个(通常是一或二个)半乳糖残基也可附着于核心碳水化合物结构。最后，一个或多个(通常是一或二个)末端唾液酸残基可附着于核心碳水化合物结构，例如通过与半乳糖残基的连接。

在优选的实施方案中，制备本文的组合物并将它用于治疗用途。因此，优选的组合物是包含糖蛋白和可药用的载体或稀释剂(例如下文示例的那些)的药物制剂。此种制剂通常是无菌的并且可以是冻干的。

在本发明优选的实施方案中，糖蛋白是抗体，而且产生抗体的典型方法在下面的部分更详细地叙述。然而，糖蛋白可以是任何其它包含Fc区的糖蛋白，例如免疫粘附素。制造免疫粘附素的方法在下文详述。

A.变体Fc区序列

在本发明的一个实施方案中，糖基化变体进一步包含具有与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列的变体Fc区。变体Fc区具有多于一处的氨基酸取代时，通常但非必要地，结合同一类别的氨基酸取代以达到所需的结果。下表描述了氨基酸取代的各种类别。

                              表1

                          Fc区变体的种类

种类	FcR结合特性	Fc区取代的位置
			1A	对所有FcγR的结合降低	238，265，269，270，297*，327，329
1B	对FcγRII和FcγRIII的结合降低	239，294，295，303，338，373，376，416，435
			2	对FcγRII和FcγRIII的结合改善	256，290，312，326，330，339，378，430
3	对FcγRII的结合改善而对FcγRIII的结合没有作用	255，258，267，276，280，283，285，286，305，307，309，315，320，331，337，398
			4	对FcγRII的结合改善而对FcγRIII的结合降低	268，272，301，322，340
5	对FcγRII的结合降低而对FcγRIII的结合没有作用	292，324，335，414，419，438，439
			6	对FcγRII的结合降低而对FcγRIII的结合改善	298，333
7	对FcγRII的结合没有作用而对FcγRIII的结合降低	248，249，252，254，278，289，293，296，338，382，388，389，434，437
			8	对FcγRII的结合没有作用而对FcγRIII的结合改善	334，360

^*去糖基化版本

除了氨基酸取代，本发明还涉及对亲代Fc区氨基酸序列的其它修饰，以产生具有改变的效应器功能的Fc区变体。

技术人员可以，例如，缺失Fc区的一个或多个氨基酸残基来降低与FcR的结合。通常，技术人员缺失一个或多个本文鉴定影响FcR结合的Fc区残基以产生此种Fc区变体。通常，根据本发明的实施方案，将缺失不多于一个到约十个Fc区残基。本文中包含一个或多个氨基酸缺失的Fc区优选保留亲代Fc区或天然序列人Fc区的至少约80％，并优选至少约90％，更优选至少约95％。

技术人员也可以制造氨基酸插入Fc区的变体，该变体具有改变的效应器功能。例如，技术人员可在邻近本文鉴定为影响FcR结合的一个或多个Fc区位置处引入至少一个氨基酸残基(例如一到二个氨基酸残基和通常不多于十个残基)。“邻近的”意思是距离本文鉴定的Fc区残基一个到二个氨基酸残基内。此种Fc区变体显示增强或减弱的FcR结合和/或ADCC活性。为产生此种插入变体，技术人员可评估包含FcR结合区(例如感兴趣的FcR的胞外区)和氨基酸残基待插入的Fc区(见，例如，Deisenhofer，Biochemistry20(9)：2361-2370(1981)；和Burmeister等，Nature 342：379-383，(1994))的多肽的共结晶结构，从而理性地设计具有例如改善的FcR结合能力的Fc区变体。此种插入通常在Fc区环中进行，而不在Fc区的二级结构中(即在β链中)。

通过在亲代Fc区中引入适宜的氨基酸序列修饰，技术人员可产生在人效应细胞存在时更有效地介导抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或较亲代多肽以更好的亲合力结合Fcγ受体(FcγR)的变体Fc区。此种Fc区变体通常包含Fc区内的至少一个氨基酸修饰。联合氨基酸修饰被认为是特别可取的。例如，变体Fc区可能包括对例如本文鉴定的特定Fc区位置中的二个，三个，四个，五个等取代。

优选地，亲代多肽Fc区是人Fc区，例如天然序列人Fc区人IgG1(A和非A同种异型)，IgG2，IgG3或IgG4Fc区。此类序列显示于图23中。

为产生具有增强的ADCC活性的Fc区，亲代多肽优选具有已经存在的ADCC活性，例如，它包含人IgG1或人IgG3Fc区。在一个实施方案中，具有增强的ADCC活性的变体介导ADCC比具有天然序列IgG1或IgG3的Fc区和变体的抗原结合区的抗体有效得多。优选地，变体包含Fc区位置298，333和334中的二个或三个残基的取代，或者基本由这些取代组成。最优选地，位置298，333和334上的残基被取代(例如被丙氨酸残基)。此外，为产生具有增强的ADCC活性Fc区变体，技术人员通常改造对FcγRIII具有增强的结合亲合力的Fc区变体，FcγRIII被认为是重要的介导ADCC的FcR。例如，技术人员可将氨基酸修饰(例如取代)引入亲代Fc区的氨基酸位置256，290，298，312，326，330，333，334，360，378或430中的任何一个或多个氨基酸位置，以产生此种变体。对FcγRIII具有增强的结合亲合力的变体可进一步对FcγRII具有降低的结合亲合力，尤其是对抑制性FcγRIIB受体具有降低的亲合力。

由于本发明的实验表明CH2区对FcR结合活性很重要，氨基酸修饰优选被引入Fc区的CH2区。此外，与上述所引用技术的教导不同，本申请涉及将修饰引入除较低铰链区外的Fc区部分。

用于修饰以产生具有改变的Fcγ受体(FcγR)结合亲合力或活性的变体IgG Fc区的氨基酸位置包括Fc区氨基酸位置238，239，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438或439中的任何一个或多个。优选，用作模板以产生此种变体的亲本Fc区包含人IgG Fc区。残基331被取代之处的亲本Fc区优选不是人天然序列IgG3，或包含位置331处的取代的变体Fc区优选显示FcR例如对FcγRII的结合增强。

为产生具有减弱的与FcγR结合的Fc区变体，技术人员可在氨基酸位置238，239，248，249，252，254，265，268，269，270，272，278，289，292，293，294，295，296，298，301，303，322，324，327，329，333，335，338，340，373，376，382，388，389，414，416，419，434，435，437，438或439中的任何一个或多个位置引入氨基酸修饰。

显示减弱的与FcγRI结合的变体包括那些含有位于氨基酸位置238，265，269，270，327或329中任何一个或多个氨基酸位置上的Fc区氨基酸修饰的变体。

显示减弱的与FcγR II结合的变体包括那些含有位于氨基酸位置238，265，269，270，292，294，295，298，303，324，327，329，333，335，338，373，376，414，416，419，435，438或439中的任何一个或多个氨基酸位置上的Fc区氨基酸修饰的变体。

显示减弱的与FcγRIII结合的Fc区变体包括那些含有位于氨基酸位置238，239，248，249，252，254，265，268，269，270，272，278，289，293，294，295，296，301，303，322，327，329，338，340，373，376，382，388，389，416，434，435或437中任何一个或多个氨基酸位置上的Fc区氨基酸修饰的变体。

也可制备具有增强的与一个或多个FcγRs结合的变体。此种Fc区变体可以包含位于Fc区氨基酸位置255，256，258，267，268，272，276，280，283，285，286，290，298，301，305，307，309，312，315，320，322，326，330，331，333，334，337，340，360，378，398或430中任何一个或多个氨基酸位置上的氨基酸修饰。

例如，具有增强的FcγR结合活性的变体可以显示增加的与FcγRIII的结合，并可选地可进一步显示降低的与FcγRII的结合；例如所述变体可包含位于Fc区氨基酸位置298和/或333上的氨基酸修饰。

具有增加的与FcγRII结合的变体包括那些包括那些含有位于Fc区氨基酸位置255，256，258，267，268，272，276，280，283，285，286，290，301，305，307，309，312，315，320，322，326，330，331，337，340，378，398或430中任何一个或多个氨基酸位置上的氨基酸修饰的变体。此种变体可进一步显示降低的与FcγRIII的结合。例如，它们可包括位于氨基酸位置268，272，298，301，322或340中任何一个或多个位置上的Fc区氨基酸修饰。

虽然优选改变与FcγR的结合，本文也涉及具有改变的对新生儿受体(FcRn)的结合亲合力的Fc区变体。据预计具有增强的对新生儿受体(FcRn)的亲合力的Fc区变体具有更长的血清半衰期，而且此种分子在需要长半衰期的给药多肽来治疗哺乳动物的方法中具有有益的用途，例如治疗慢性疾病。相反，预计具有降低的对新生儿受体(FcRn)的亲合力的Fc区变体具有较短的半衰期，例如此种分子可在短的循环时间有利时用于哺乳动物，例如用于多肽的体内诊断性显像，当该多肽较长时间遗留在血流中随之循环时，具有毒副作用，如此等等。据预计具有降低的FcRn结合亲合力的Fc区变体不太可能穿过胎盘，因此可用于治疗怀孕妇女的疾病。

具有改变的对FcRn的结合亲合力的Fc区变体包括含有位于氨基酸位置238，252，253，254，255，256，265，272，286，288，303，305，307，309，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，386，388，400，413，415，424，433，434，435，436，439或447中的任何一个或多个氨基酸位置上的Fc区氨基酸修饰的那些。显示降低的与FcRn的结合的那些变体通常包含位于氨基酸位置252，253，254，255，288，309，386，388，400，415，433，435，436，439或447中的任何一个或多个氨基的位置上的Fc区氨基酸修饰；而具有增强的与FcRn的结合的那些变体通常包含位于氨基酸位置238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434中的任何一个或多个氨基酸位置上的Fc区氨基酸修饰。

通常根据多肽的预期用途，进一步修饰以上述方法制备的多肽变体。此种修饰可能涉及氨基酸序列的进一步改变(氨基酸序列的取代，插入和/或缺失，与异源多肽的融合和/或共价修饰。此种“进一步修饰”可在以上公开的氨基酸修饰(导致Fc受体结合和/或ADCC活性的改变)之前，同时，或之后进行。在一个实施方案中，技术人员可结合本文的Fc区修饰和本说明“相关技术”部分中引用的对比文件中公开的Fc区取代。

可选地或此外，将上述氨基酸修饰和改变Fc区的C1q结合和/或补体依赖的细胞毒作用功能的一个或多个进一步的氨基酸修饰结合可能是有用的。

本文特别感兴趣的起始多肽是通常结合C1q和显示补体依赖的细胞毒作用(CDC)的多肽。本文所述的进一步的氨基酸取代通常用于改变起始多肽结合C1q的能力和/或修饰该多肽的补体依赖的细胞毒作用功能，例如降低或优选消除这些效应器功能。然而，本文涉及包含位于所述位置中一个或多个位置上的取代的多肽，它具有增强的C1q结合和/或补体依赖的细胞毒作用(CDC)功能。例如，起始多肽可能不能结合C1q和/或介导CDC，但可以根据本文的教导进行修饰使该多肽获得这些进一步的效应器功能。此外，可以修饰具有已有C1q结合活性，并可选地还具有介导CDC能力的多肽，以便使这些活性之一或均被增强。

为产生具有改变的C1q结合和/或补体依赖的细胞毒作用(CDC)功能的Fc区，通常从重链位置270，322，326，327，329，331，333，和334中选择待修饰的氨基酸位置，其中IgG重链中残基的编号按照Kabat等，Sequences ofproteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991)中EU索引的方式。在一个实施方案中，以上鉴定的八个位置中只有一个被改变，以便产生具有改变的C1q结合和/或补体依赖的细胞毒作用(CDC)功能的多肽变体区。在这种情况下，优选只改变残基270，329或322。可选地，修饰以上鉴定的两个或多个位置。如果取代将被组合，通常组合增强人C1q结合的取代(例如残基位置326，327，333和334上的取代)或结合那些降低人C1q结合的取代(例如残基位置270，322，329和331上的取代)。在后一种实施方案中，可以取代所有的四个位置(即，270，322，329和331)。优选地，将位于位置326，327，333或334中的二个，三个或所有位置上的进一步的取代，可选地与其它Fc区取代组合，产生具有增强的人C1q结合和优选在体外或体内具有增强的CDC活性的多肽。

脯氨酸在人IgG’s中的位置329是保守的。该残基优选由丙氨酸取代，然而，也可用任何其它氨基酸取代，例如丝氨酸，苏氨酸，天冬酰胺，甘氨酸或缬氨酸。

赖氨酸在人IgG’s中的位置322是保守的。该残基优选由丙氨酸残基取代，然而，也可用任何其它氨基酸取代，例如丝氨酸，苏氨酸，甘氨酸或缬氨酸。

D270在人IgGs中是保守的。而且，该残基可被另一种氨基酸残基取代，例如丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甘氨酸，缬氨酸或赖氨酸。

K326在人IgGs中也是保守的。而且，该残基可被另一种氨基酸残基取代包括，但不限于，缬氨酸，谷氨酸，丙氨酸，甘氨酸，天冬氨酸，蛋氨酸，或色氨酸，优选色氨酸。

同样地，E333在人IgGs中也是保守的。E333优选地被具有较小的侧链体积的氨基酸残基取代，例如缬氨酸，甘氨酸，丙氨酸，或丝氨酸，优选丝氨酸。

K334在人IgGs中是保守的，而且，可被另一种残基取代，例如丙氨酸或其它残基。

在人IgG1和IgG3中，残基327是丙氨酸。为产生具有增强的C1q结合的变体，该丙氨酸由另一种残基取代例如甘氨酸。在IgG2和IgG4中，残基327是甘氨酸，并且可由丙氨酸(或另一种残基)取代来减少C1q的结合。

如上述，技术人员可设计具有改变的效应器功能的Fc区，例如，通过修饰C1q结合和/或FcR结合，并从而改变CDC活性和/或ADCC活性。例如，技术人员可以产生具有增强的C1q结合和增强的FcγRIII结合的变体Fc区；例如具有增强的ADCC活性和增强的CDC活性的变体Fc区。可选地，需要效应器功能降低或消失时，技术人员可以改造出具有降低的CDC活性和/或减弱的ADCC活性的变体Fc区。在其它实施方案中，技术人员可以仅增加这些活性之一，并可选地还减弱其它活性，例如产生具有增强的ADCC活性和减弱的CDC活性的Fc区变体或反之。

至于进一步的氨基酸序列变异，通常也可由丝氨酸取代任何未参与保持多肽变体的正确构象的半胱氨酸残基，从而增进该分子的氧化稳定性并防止错误的交联。

另一种类型的氨基酸取代用于改变多肽的糖基化模式。这可以消除多肽中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或增加多肽中不存在的一个或多个糖基化位点获得。多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接指碳水化合物部分对天冬酰胺残基的附着。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是碳水化合物部分对天冬酰胺侧链的酶附着的识别序列，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。因此，多肽中这些三肽序列任何一个的存在都创造了一个潜在的糖基化位置。O-连接的糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺，半乳糖，或木糖之一对羟基氨基酸的附着，最常见的羟基氨基酸是丝氨酸或苏氨酸，尽管也使用5-羟脯氨酸和羟赖氨酸。通过改变氨基酸序列使其包含上述三肽序列中的一种或多种，可轻易实现糖基化位点之于多肽的增加(适于N-连接的糖基化位点)。也可通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基加入原始多肽，或用这些残基进行取代造成改变。典型糖基化变体的重链具有残基Asn 297上的氨基酸取代。

此外，通过一处或多处进一步的氨基酸取代可改变Fc区的种类，亚类或同种异型，产生出具有与所需的不同类型，亚类或同种异型更同源的氨基酸序列的Fc区。例如，可以改变小鼠Fc区以产生与人Fc区更同源的氨基酸序列；人非-A同种异型IgG1 Fc区可经修饰产生人A同种异型IgG1 Fc区如此等等。在一个实施方案中，本文中改变FcR结合和/或ADCC活性的氨基修饰在Fc区的CH2区中产生，而CH3区被缺失或者被另一种二聚化的区域所替换。然而优选地，CH3区是保留的(除了如本文中公开的改变效应器功能的氨基酸修饰)。

通常根据糖蛋白的预期用途，将如上述制备的糖蛋白做进一步修饰。此种修饰可能涉及氨基酸序列的进一步改变(氨基酸残基的取代，插入和/或缺失)，与异源性多肽融合和/或共价修饰.

另一种类型的氨基酸取代用于改变多肽的糖基化模式。由于缺乏本文所述的海藻糖，此种糖基化改变可能是文中糖基化改变以外的形式，并且可以通过缺失多肽中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或增加多肽中不存在的一个或多个糖基化位置获得。多肽的糖基化通常是N-连接或O-连接的。N-连接指碳水化合物部分对天冬酰胺残基的附着。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰氨胺-X-苏氨酸是碳水化合物部分对天冬酰胺侧链的酶附着的识别序列，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。因此，多肽中这些三肽序列中任何一个的存在都创造了一个潜在的糖基化位置。O-连接的糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺，半乳糖，或木糖之一对羟基氨基酸的附着，最常见的羟基氨基酸是丝氨酸或苏氨酸，尽管也使用5-羟脯氨酸和羟赖氨酸。通过改变氨基酸序列使其包含上述三肽序列中的一种或几种三肽序列，可轻易实现糖基化位点之于多肽的增加(适于N-连接的糖基化位点)。也可通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基加入原始多肽，或用这些残基进行取代造成改变。

B.生物活性筛查

通过一项或多项试验，可评估糖蛋白变体较起始多肽在生物活性上的任何变化。

优选地，与非变体多肽相比，糖蛋白变体基本保持与抗原结合的能力，即其结合能力不差于非变体多肽的约20倍，例如不差于非变体多肽的约5倍。例如，使用例如荧光活化的细胞分类(FACS)或放射免疫沉淀(RIA)技术可测定多肽变体的结合性能。

可评估糖蛋白变体结合FcR的能力。若FcR是高亲合力Fc受体，例如FcγRI，FcRn，FcγRIIB或FcγRIIIA，可使用抗体通过滴定单体糖蛋白变体并测定结合的糖蛋白变体来测定结合，所述抗体在标准ELISA形式中特异地结合糖蛋白变体(见以下实施例)。低亲合力FcRs的另一种FcR结合实验在WO00/42072(Presta)和美国专利6,242,195B1中叙述。

为评定糖蛋白变体的ADCC活性，可使用不同的效应物：目标比(effector-target)进行体外ADCC实验。对此类实验有用的“效应物细胞”包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选地，或此外，可在体内评定糖蛋白变体的ADCC活性，例如，在如Clynes等PNAS(USA)95：652-656(1998)公开的动物模型中。

可以评定变体结合C1q和介导补体依赖的细胞毒作用(CDC)的能力。

为测定C1q的结合，可进行C1q结合ELISA。简言之，将实验板置于含有糖蛋白变体或起始多肽(对照)的包被缓冲液中包被，4℃下过夜。然后洗涤并封闭该板。洗涤后，将等量的人C1q加入每个孔中，并在室温下孵育2小时。进一步洗涤后，将100μl绵羊抗-补体C1q过氧化物酶偶联的抗体加入每个孔中，并在室温下孵育1小时。再次用洗涤缓冲液洗涤该板，并在每孔中加入100μl含有OPD(O-二盐酸亚苯二胺(phenylenediaminedihydrochloride)(Sigma))的底物缓冲液。通过黄色的出现观察氧化反应，使反应进行30分钟，然后加入100(14.5N H₂SO₄终止反应。可在(492-405)nm读取吸收值。

典型糖蛋白变体是在本实验中显示“C1q结合显著减少”的糖蛋白变体。这意味着与100μg/ml具有未突变的IgG1 Fc区的对照抗体相比，约100μg/ml的糖蛋白变体显示约50倍或更多C1q结合的减少。在最优选的实施方案中，糖蛋白变体“不结合C1q”，即与100μg/ml对照抗体相比，100μg/ml糖蛋白变体与C1q的结合降低约100倍或更多。

另一种典型变体是“对人C1q具有比亲代多肽更好的结合亲合力”的变体。此种分子可以显示，例如与亲代多肽相比，与人C1q的结合提高约两倍或更多，并优选约五倍或更多(例如这两种分子在IC₅₀值时)。例如，与亲代多肽相比，与人C1q的结合提高约两倍到约500倍，并优选从约两倍或约五倍到约1000倍。

为评定补体活化，可进行补体依赖的细胞毒作用(CDC)测定，例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202：163(1996)所述。简言之，可用缓冲液稀释得到各种浓度的糖蛋白变体和人补体。可将表达糖蛋白变体结合抗原的细胞稀释到～1x10⁶细胞/ml的浓度。可将糖蛋白变体混合物，稀释的人补体和表达该抗原的细胞加到平底组织培养96孔板上，使其在37℃和5％CO₂下孵育2小时，以便促进补体介导的细胞溶解。随后将50(1的alamar blue(Accumed International)加入每个孔中，并在37℃下孵育过夜。在530nm激发，并在590nm发射下使用96孔荧光计测定吸收值结果以相对荧光单位(RFU)表示。样品浓度可用标准曲线计算，并且报告感兴趣的糖蛋白变体较非变体多肽的百分比活性。

另一种典型变体“不活化补体”。例如，与0.6(g/ml具有未突变的IgG1Fc区的对照抗体相比，0.6(g/ml糖蛋白变体在本实验中显示约0-10％的CDC活性。优选地，变体在上述CDC测定中，不具有任何CDC活性。

糖蛋白可以是与亲代多肽相比，显示增强的CDC的一种，例如，在体外或体内CDC活性中CDC的活性显示约两倍到约100倍的提高(例如在每个被比较的分子的IC₅₀值时)。

本文也涉及对新生儿受体(FcRn)具有变异的结合亲合力的Fc区变体。对FcRn具有增强的亲合力的Fc区变体据预计具有更长的血清半衰期，而且此种分子在需要长半衰期给药多肽来治疗哺乳动物的方法中具有有益的用途，例如治疗慢性疾病。相反，预计具有降低的对新生儿受体(FcRn)的亲合力的Fc区变体具有较短的半衰期，例如此种分子可在短的循环时间有利时用于哺乳动物，用于例如多肽的体内诊断性显像，当该多肽较长时间遗留在血流中随之循环时，具有毒副作用，如此等等。据预计具有降低的FcRn结合亲合力的Fc区变体不太可能穿过胎盘，因此可用于治疗怀孕妇女的疾病。

C.抗体的制备

在本发明优选的实施方案中，根据本文的教导修饰的糖蛋白是抗体。产生抗体的方法如下：

(i)抗原选择和制备

当糖蛋白是抗体时，它针对感兴趣的抗原。优选地，所述抗原是生物学上重要的糖蛋白而且将该抗体用药于患病哺乳动物可在该哺乳动物中产生治疗益处。然而，也涉及针对非多肽抗原的抗体(如肿瘤相关的糖脂类抗原；见美国专利5,091,178)。

当抗原是多肽时，它可以是跨膜分子(例如受体)或配体例如生长因子。典型抗原包括如下分子：例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；甲状腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；前胰岛素；滤泡刺激激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子例如因子VIIIC，因子IX，组织因子(TF)，和von Willebrands因子；抗-凝血因子例如蛋白C；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或组织类型的纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽(bombesin)；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(由活化调解，通常是T细胞表达和分泌的)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白例如人血清白蛋白；苗勒管抑制物(Muellerian-inhibiting substance)；松弛素A-链；松弛素B-链；前松弛素；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，例如β-内酰胺酶；DNase；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素(inhibin)；活化素(activin)；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子例如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3，-4，-5，或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神经生长因子例如NGF-β；血小板源性生长因子(PDGF)；纤维母细胞生长因子例如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4，或TGF-β5；肿瘤坏死因子(TNF)例如TNF-α或TNF-β；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)；胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白例如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD22和CD40；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素例如干扰素-α，-β和-λ；集落刺激因子(CSFs)，例如，M-CSF，GM-CSF，和G-CSF；白介素(ILs)，例如，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9和IL-10；过氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原如，例如，AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整合素例如CD11a，CD11b，CD11c，CD18，ICAM，VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原例如HER2，HER3或HER4受体；和任何上述多肽的片段。

本发明包括的抗体的典型靶分子包括CD蛋白例如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD22，CD34和CD40；ErbB受体家族成员，例如EGF受体，HER2，HER3或HER4受体；前列腺干细胞抗原(PSCA)；细胞粘附分子例如LFA-1，Mac1，p150.95，VLA-4，ICAM-1，VCAM，α4/β7整合素，和αv/β3整合素包括其α或β亚单位(例如抗-CD11a，抗-CD18或抗-CD11b抗体)；生长因子例如VEGF；组织因子(TF)；肿瘤坏死因子(TNF)例如TNF-α或TNF-β，(，干扰素(α-IFN)；白介素，例如IL-8；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C等等。

可选地与其它分子偶联的可溶抗原及其片段，可用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子，例如受体，这些抗原的片段(例如受体的胞外区)可用作免疫原。可选地，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。此种细胞可来自天然来源(例如癌细胞系)或者可以是经重组技术转化表达跨膜分子的细胞。其它抗原及其可用于制备抗体的形式对本领域技术人员来说是显而易见的。

(ii)多克隆抗体

优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物体内制备多克隆抗体。它可用来将相关抗原(尤其使用合成肽时)与在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白偶联。例如，可以用双功能制剂或衍生制剂使抗原与钥孔血蓝蛋白(KLH)，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制物结合，所述双功能或衍生制剂例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐，SOCl₂，或R¹N＝C＝NR，其中R和R¹是不同的烷基基团。

通过将例如100μg或5μg蛋白或偶联物(分别对兔子或小鼠而言)与3倍体积的弗氏(Freund′s)完全佐剂混合，并经皮内多位点注射该溶液，可以使动物对抗原、免疫原性偶联物、或衍生物接受免疫。一个月后，将含有1/5到1/10最初量的多肽或偶联物的弗氏完全佐剂经皮下注射到多个位点，来给动物加强免疫。7到14天后，自动物取血并分析血清中抗体的滴度。对动物加强免疫直到抗体滴度至平台。优选，用同一抗原的偶联物，但与不同蛋白和/或通过不同交联剂对动物加强免疫。偶联物也可在重组细胞培养中产生，为蛋白融合体形式。另外，聚集剂例如明矾也适宜用来增强免疫应答。

(iii)单克隆抗体

单克隆抗体可用Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)首先描述的杂交瘤法制备或通过重组DNA法(美国专利4,816,567)制备。

在杂交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，例如仓鼠，来激发产生或能产生特异结合免疫所用蛋白的抗体的淋巴细胞。可选地，所述淋巴细胞可被体外免疫。免疫后，淋巴细胞可被分离并随后使用适宜的融合剂例如聚乙二醇与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体：Principles and Practice，59-103页(Academic Press，1986))。

由此制备的杂交瘤细胞被接种于适宜的培养基并在其中生长，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合亲代骨髓瘤细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的选择培养基通常包括次黄嘌呤，氨基蝶呤，和胸腺嘧啶(“HAT培养基”)这些抑制HGPRT-缺陷细胞生长的物质。

优选骨髓瘤细胞为那些能有效融合、支持所选抗体生成细胞以稳定的高水平产生抗体、并对如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞系。在众多这样的细胞系中，优选的骨髓瘤细胞系是小鼠骨髓瘤系，如由Salk Institute CellDistreibution Center，San Diego，California USA提供的MOPC-21和M.C.-11小鼠肿瘤，和由美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland USA提供的SP-2或其衍生物，如X63-Ag8-653细胞。也描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系可用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；和Brodeur等，单克隆抗体的制备技术和应用(Marcel Dekker，Inc.，New York纽约，(1987))51-63页]。

可在含有生长的杂交瘤细胞的培养基中分析抗所述抗原的单克隆抗体的产生。优选地，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合试验，如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析。

单克隆抗体的结合亲合力可通过，例如Muson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)所述Scatchard分析来测定。

一旦鉴定出产生具有所需特异性、亲合力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，这些细胞克隆可通过有限稀释进行亚克隆，并通过标准方法(Goding，单克隆抗体：Principles and Practice，59-103页(Academic Press，1986))使其生长。适合此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，通过例如将细胞注射入小鼠中，可以使杂交瘤细胞以动物腹水肿瘤的形式在体内生长。

上述亚克隆所分泌的单克隆抗体可用经典抗体纯化方法如，例如，亲和层析(例如使用蛋白A-Sepharose)，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析等从培养基，腹水或血清中分离。

使用传统方法(例如通过使用能与编码小鼠抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)可轻易分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞是此DNA的优选来源。一旦分离出该DNA，可以将它置入表达载体中，该载体随后被转染至宿主细胞中例如大肠杆菌细胞，猴COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不另外生成抗体蛋白的骨髓瘤细胞，从而在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。抗体的重组生产将在下文详述。

在进一步的实施方案中，可从使用McCafferty等，Nature，348：552-554(1990)描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离小鼠和人抗体。随后的文章描述了通过链改组产生高亲和性(纳米级)人抗体(Marks等，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及将组合感染和体内重组作为策略构建非常大的噬菌体文库(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行(viable)选择。

也可采用以下方法对DNA进行修饰：例如，以人重链和轻链恒定区的编码序列代替同源小鼠序列(美国专利4,816,567；Morrison等，Proc.NatlAcad.Sci.USA，81：6851(1984))，或将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的完整或部分编码序列共价结合。

通常，上述非免疫球蛋白多肽序列可取代抗体的恒定区，或它们可取代抗体的一个抗原结合位点的可变区以产生嵌合二价抗体，该抗体包含两个特异于不同抗原的抗原结合位点。

(iv)人源化抗体和人抗体

人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入它的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为“引进的”残基，它们通常来自“引进的”可变区。人源化过程基本是按照Winter及其同事(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))的方法，通过用啮齿类CDRs或CDR序列替换人抗体的对应序列来进行。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中完整人类可变区的很少一部分被非人物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中一些CDR残基且可能有部分FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。

选择人源化抗体制备所用的人轻链和重链可变区，对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最适”方法，针对已知人可变区序列的整个文库筛选啮齿类抗体的可变区序列。随后将与啮齿类最接近的人序列作为人框架区(FR)用于人源化抗体(Sims等，J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196：901(1987))。另一种方法是使用从轻链或重链特定亚群的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同样的框架区可被用于几种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151：2623(1993))。

更重要的是，将抗体人源化后保留了对抗原的高亲合力和其它有利的生物特性。为达到此目的，根据优选方法，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性(conceptual)人源化产物来制备人源化抗体。免疫球蛋白三维模型已有商品，是本领域技术人员所熟悉的。还有用于描述和展示所选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。通过观察这些展示结果可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。通过这种方法，可从受体序列和引进序列中选出FR残基并组合，从而得到所需抗体性质，如对靶抗原的亲合力增加。总之，超变区残基直接并且最主要涉及对抗原结合的影响。

可选的，可以制备转基因动物(如小鼠)，它经过免疫能在缺乏内源性免疫球蛋白生成的情况下产生全套人抗体。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突变小鼠中，抗体重链连接区(J_H)基因的纯合缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。将人胚系免疫球蛋白基因阵列(array)转移到此胚系突变小鼠中，将导致在抗原攻击的情况下产生人抗体。见例如，Jakobovits等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；和Duchosal等，Nature355：258(1992)。人抗体也可来自噬菌体展示文库(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；Vaughan等，Nature Biotech 14：309(1996))。

(v)多特异抗体

多特异抗体对至少两种不同的抗原具有结合特异性。尽管此种分子通常只结合两种抗原(即双特异抗体，BsAbs)，具有附加特异性的抗体例如三特异抗体也包含在文中所用的术语中。BsAbs的实例包括具有针对肿瘤抗原的一条臂和针对细胞毒作用触发分子(cytotoxic trigger molecule)的另一条臂的那些抗体，例如抗-FcγRI/抗-CD15，抗-p185^HER2/FcγRIII(CD 16)，抗-CD3/抗-恶性B-细胞(1D10)，抗-CD3/抗-p185^HER2，抗-CD3/抗-p97，抗-CD3/抗-肾细胞癌，抗-CD3/抗-OVCAR-3，抗-CD3/L-D1(抗-结肠癌)，抗-CD3/抗-黑色素细胞刺激激素类似物，抗-EGF受体/抗-CD3，抗-CD3/抗-CAMA1，抗-CD3/抗-CD19，抗-CD3/MoV18，抗-神经细胞粘附分子(NCAM)/抗-CD3，抗-叶酸结合蛋白(FBP)/抗-CD3，抗-泛癌相关抗原(AMOC-31)/抗-CD3；一条臂特异地结合肿瘤抗原而另一条臂结合毒素的BsAbs例如抗-皂草素/抗-Id-1，抗-CD22/抗-皂草素，抗-CD7/抗-皂草素，抗-CD38/抗-皂草素，抗-CEA/抗-蓖麻毒素A链，抗-干扰素-α(IFN-α)/抗-杂交瘤独特型，抗-CEA/抗-长春花碱；转化酶活化的前体药物的BsAbs例如抗-CD30/抗-碱性磷酸酶(催化磷酸丝裂霉素前药物向丝裂霉素醇的转化)；可用作纤维蛋白溶解剂的例如抗-纤维蛋白/抗-组织纤溶酶原激活物(tPA)，抗-纤维蛋白/抗-尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)；将免疫复合物靶向细胞表面受体的BsAbs例如抗-低密度脂蛋白(LDL)/抗-Fc受体(例如FcγRI，FcγRII或FcγRIII)；用于治疗感染性疾病的BsAbs例如抗-CD3/抗-单纯疱疹病毒(HSV)，抗-T-cell受体：CD3复合物/抗-流感病毒，抗-FcγR/抗-HIV；体外或体内检测肿瘤的BsAbs例如抗-CEA/抗-EOTUBE，抗-CEA/抗-DPTA，抗-p185^HER2/抗-hapten；作为疫苗佐剂的BsAbs；和作为诊断工具的BsAbs例如抗-兔IgG/抗-铁蛋白，抗-辣根过氧化物酶(HRP)/抗-激素，抗-生长抑素/抗-物质P，抗-HRP/抗-FITC，抗-CEA/抗-β-半乳糖苷酶。三特异抗体的实例包括抗-CD3/抗-CD4/抗-CD37，抗-CD3/抗-CD5/抗-CD37和抗-CD3/抗-CD8/抗-CD37。双特异抗体可被制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)₂双特异性抗体)。双特异性抗体的综述见Segal等J.Immunol.Methods 248：1-6(2001)。

制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，全长双特异性抗体的重组制备是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein and Cuello，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链轻链随机搭配，这些杂交瘤(quadroma)产生10种不同抗体分子的潜在的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤来进行)非常复杂，且产量很低。类似的方法见WO93/08829(1993年5月13日公开)和Traunecker等，EMBO J，10：3655-3659(1991)。

依据不同的方法，可将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与至少包含铰链区、CH2及CH3区部分的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主生物。这使得在使用非等比的三种多肽链进行构建的实施方案中，能够较灵活地调整三种多肽片段的相互比例，以获得最佳产量。但也可在至少两种多肽链以等比例表达而获得高产时或所述比例无特别意义时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。

在该方法的一个优选实施方案中，所述双特异性抗体由一条臂上的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现这种不对称结构有利于从非必要免疫球蛋白链的组合中分离出所需双特异性化合物，因为只在该双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链，这使得分离更加容易。此方法公开于1994年3月3日公开的WO94/04690中。制备双特异性抗体的进一步细节可以参见，例如Suresh等，Methods in Enzymology，121：210(1986)。根据WO96/27011所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中获得的异二聚体的百分比最大。优选的界面包括抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子界面上的一条或多条小的氨基酸侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的界面上形成。这提供了一种机制，其使异二聚体的产量比不想要的终产物如同二聚体高。

双特异性抗体包括交联抗体或“异源偶联的”抗体。例如，可使异源偶联物中的抗体之一与抗生物素蛋白偶联，使另一抗体与生物素偶联。有观点认为，这类抗体可用于将免疫细胞导向不想要的细胞(美国专利4676980)，也可用于治疗HIV感染(WO91/00360，WO92/200373和EP03089)。异源偶联抗体可通过任何适当的交联方法制备。适当的交联制剂和多种交联技术为本领域已知，可在美国专利4676980号中获得。

本发明还涉及二价以上的抗体。例如可制备三特异抗体。Tutt等J.Immunol.147：60(1991)。

(vi)多价抗体

多价抗体比二价抗体可更快地被表达与该抗体结合的抗原的细胞内化(和/或异化)。本发明的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如四价抗体)(它们不是IgM类)，通过使编码所述抗体多肽链的核酸重组表达可轻易制备该抗体。多价抗体可以包含二聚体化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚体化结构域包括Fc区或铰链区，或由它们组成。在本文中，抗体包含一个Fc区和三个或更多个位于Fc区氨基端的抗原结合位点。优选的多价抗体在此包括三到约八个抗原结合位点，但优选四个抗原结合位点，或由它们组成。多价抗体包括至少一条多肽链(并优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变区。例如，多肽链可包含VD1-(X1)_n-VD2-(X2)_n-Fc，其中VD1是第一可变区，VD2是第二可变区，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，n是0或1。例如，多肽链可包括VH-CH1-柔韧接头(flexible linker)-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选进一步包含至少二个(优选四个)轻链可变区多肽。例如本文的多价抗体可包含从约二个到约八个轻链可变区多肽。本文的轻链可变区多肽包含轻链可变区以及可选地进一步包含CL结构域。对多价抗体的描述见WO 01/00238and WO 00/44788。

(vii)亲和力成熟的抗体

本文的抗体可以是亲和力成熟的抗体，它包含对亲代抗体(例如人源化或人抗体)一个或多个超变区残基的取代。通常，相对于其产生的亲代抗体，生成的用于进一步改造的变体具有改良的生物学特性。产生此种取代变体的便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，若干超变区位点(例如6-7位点)经突变在每个位点产生所有可能的氨基取代。以单价形式从丝状噬菌体颗粒将如此产生的抗体变体显示为包裹在每个颗粒中的与M13的基因III产物的融合物。随后筛选该噬菌体展示的变体的生物活性(例如结合亲合力)。为鉴定修饰的候选超变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变鉴定对抗原结合有显著贡献的超变区残基。可选地，或此外，分析抗原抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体及其抗原之间的接触点是有益的。此种接触残基和邻近残基是根据本文所述技术进行取代的候选残基。一旦产生这样的变体，便对这样的变体组(panel)进行筛选，可选出在一项或几项相关实验中具有出众特性的抗体进一步改造。

(viii)免疫偶联物

本发明还涉及用包含与抗癌药剂例如细胞毒作用剂或生长抑制剂偶联的糖蛋白的免疫偶联物所进行的治疗。

用于产生此种免疫偶联物的化疗剂已在上文中描述。

本文也涉及抗体和一个或多个小分子毒素的偶联物，例如加利车毒素，美登木素(maytansinoid)，单端孢霉烯(trichothene)和CC1065，以及这些毒素具有毒素活性的衍生物。

在一个优选的实施方案中，本发明的糖蛋白与一个或多个美登木素分子偶联。

本领域已知多种制造抗体-美登木素生物碱偶联物的连接基团，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利EP 0 425 235 B1，和Chari等CancerResearch 52：127-131(1992)公开的那些。连接基团包括二硫基，硫醚基，酸不稳定基团，光不稳定基团，肽酶不稳定基团，或酯酶不稳定基团，如上述专利所公开，优选二硫基和硫醚基。

通过以化学方法将糖蛋白(例如抗体)连接与美登木素分子而不显著减少糖蛋白或美登木素分子的生物活性可以制备糖蛋白-美登木素偶联物。虽然即使是一个分子的毒素/抗体比起使用裸露的抗体来，就可以增强细胞毒作用，每个抗体分子平均偶联的3-4个美登木素分子已显示出在不负面影响抗体的功能和溶解性下，增强目的细胞细胞毒作用的效力。本领域人员了解美登木素生物碱并可通过已知技术合成或从天然来源分离它。适宜的美登木素生物碱在例如美国专利5,208,020和上述的其它专利以及非专利文献中公开。优选的美登木素生物碱是美登木醇(maytansinol)和对美登木醇分子的芳香环或其它位点进行修饰的美登木醇类似物，例如美登木醇的各种酯。本领域已知许多制造抗体-美登木素偶联物的连接基团，包括，例如，美国专利5,208,020或EP专利0 425 235B1，和Chari等Cancer Research 52：127-131(1992)重公开的那些。连接基团包括二硫基团，硫醚基团，酸不稳定基团，光不稳定基团，肽酶不稳定基团，或酯酶不稳定基团，如上述专利公开，优选二硫基和硫醚基。使用多种双功能蛋白偶联剂可制造抗体和美登木素偶联物，所述双功能蛋白偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚胺基硫烷(iminothiolane)(IT)，亚胺酸酯的双功能衍生物(如盐酸二甲基己二酸亚胺酯(dimethyladipimidate HCl))，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glutareldehyde))，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。尤其优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173：723-737[1978])和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)来提供二硫连接。接头可附着于美登木素生物碱分子的不同位点，这取决于连接的类型。例如，使用传统的偶联技术通过与羟基反应形成酯连接。该反应可出现在含有羟基的C-3位置，经羟甲基修饰的C-14位置，经羟基修饰的C-15位置，以及含羟基的C-20位置。在优选的实施方案中，在美登木醇或美登木醇类似物的C-3位置形成连接。

另一种感兴趣的免疫免疫偶联物包括与一个或多个加利车霉素分子偶联的糖蛋白。抗生素的加利车霉素家族能够在亚皮摩尔的浓度造成双链DNA断裂。加利车霉素家族偶联物的制备见美国专利5,712,374，5,714,586，5,739,116，5,767,285，5,770,701，5,770,710，5,773,001，5,877,296(均属于American Cyanamid Company)。可利用的加利车霉素的结构类似物包括，但不限于，γ₁ ^I，α₂ ^I，α₃ ^I，N-乙酰-γ₁ ^I，PSAG和θI1(Hinman等Cancer Research 53：3336-3342(1993)，Lode等Cancer Research 58：2925-2928(1998)和前述所有属于American Cyanamid的专利)。另一种可偶联糖蛋白的抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸剂。加利车霉素和QFA都具有作用的胞内位点，而且不轻易穿过胞浆膜。因此，通过抗体介导的内化，这些药剂的细胞摄取大大地增强了其细胞毒作用。

其它可与本发明的抗体偶联的抗肿瘤药物包括BCNU，链脲菌素(streptozoicin)，长春新碱和5-氟尿嘧啶，美国专利5,053,394，5,770,710所述的已知统称为LL-E33288复合物的药物家族，以及esperamicins(美国专利5,877,296)。

可以应用的酶活性毒素及其片段包括：白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲毒素、油桐(Aleutites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂，白树毒素、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。参见例如1993年10月28日公开的WO93/21232。

本发明还涉及一种免疫偶联物，其由抗体与具有核酸分解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶如脱氧核糖核酸酶；DNase)形成。

为选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射活性原子。多种放射性同位素可用于制备放射性偶联的抗体，实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²以及Lu的放射性同位素。当偶联物用于诊断时，它包含可用于闪烁照相研究的放射活性原子，例如tc^99m或I¹²³，或可以用于核磁共振(NMR)成像(也称磁共振现象，mri)的旋转标记(spin label)，例如碘-123，碘-131，铟-111，氟-19，碳-13，氮-15，氧-17，钆，锰或铁。

放射性标记或其它标记可通过已知方法掺入偶联物中。例如，所述肽可以生物合成，或使用涉及例如氟-19取代氢的适宜氨基酸前体进行化学氨基酸合成。标志物例如tc^99m或I¹²³，Re¹⁸⁶，Re¹⁸⁸和In¹¹¹可以借助所述肽中的半胱氨酸残基来附着。钇-90可以借助赖氨酸残基来附着。可用IODOGEN法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57掺入碘-123。“免疫闪烁照相术中的单克隆抗体”(Chatal，CRC Press 1989)详细描述了其它方法。

抗体和细胞毒作用制剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚胺基硫烷(IT)，亚胺酸酯的双功能衍生物(如盐酸二甲基己二酸亚氨酯)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛)，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2，6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，Science 238：1098(1987)所述制备。C¹⁴标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至抗体的偶联剂之一。见WO94/11026。这种接头可能是有利于细胞毒作用药物在细胞内释放的“可断开的接头”。例如，可使用酸不稳定型接头，肽酶敏感型接头，光不稳定型接头，二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利5,208,020)。

可选地，通过例如重组技术或肽合成制备包含抗体和细胞毒作用剂的融合蛋白。DNA的长度可包含分别编码该偶联物的两个部分的区域，它们彼此邻接，或被编码接头肽但不破坏该偶联物的所需特性的区域分开。

在另一实施方案中，抗体可与肿瘤预靶向中应用的“受体”(如链霉亲和素)偶联，将该抗体-受体偶联物给予患者，之后用清除剂(clearing agent)除去循环中未结合的偶联物，再给予已偶联了细胞毒作用制剂(如放射性核苷酸)的“配体”(如抗生物素蛋白)。

(ix)抗体依赖酶介导的前体药物的治疗(ADEPT)

通过将抗体偶联于前体药物活化酶，本发明的抗体也可用于ADEPT，该酶将前体药物(例如肽基化疗剂，见WO81/01145)转化成活性抗癌药物。参见，例如，WO 88/和美国专利4,975,278。

用于ADEPT的免疫结合物的酶组分包括任何能够对前体药物起作用，将它转化成更加有活性的细胞毒作用形式的酶。

可用于本发明的方法的酶包括，但不限于，碱性磷酸酶，用于将含有磷酸盐的前体药物转化成游离药物；芳香硫酸酯酶，用于将含有硫酸盐的前体药物转化成游离药物；胞嘧啶脱氨酶，用于将含有无毒的5-氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，例如沙雷氏菌属蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶，羧肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)，用于将含肽的前体药物转化成游离药物；D-丙酰胺羧肽酶，用于转化含有D-氨基酸取代物的前体药物；碳水化合物-切割酶，例如β-半乳糖苷酶和神经酰氨酶，用于将糖基化的前体药物转化成游离药物；β-内酰胺酶，用于将β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物；和青霉素酰氨酶，例如青霉素V酰氨酶或青霉素G酰氨酶，用于将由苯氧乙酰基或苯乙酰基自其胺氮衍生的药物分别转化成游离药物。可选地，具有酶活性的抗体(本领域也称“抗体酶”)可用将本发明的前体药物转化成游离活性药物(参见，例如，Massey，Nature 328：457-458(1987))。可如本文所述方法制备抗体-抗体酶偶联物，从而将抗体酶递送到肿瘤细胞群。

通过本领域已知的技术，本发明的酶可与抗体共价偶联，例如使用上述的异双功能交联剂。可选地，使用本领域技术人员熟悉的重组DNA技术构建融合蛋白，该融合蛋白至少包含本文抗体的抗原结合区，并连接于本发明的酶的至少一个功能活化部分。(见，例如，Neuberger等，Nature，312：604-608(1984))。

(x)其它糖蛋白修饰

本文涉及糖蛋白的其它修饰。例如，糖蛋白可与多种非蛋白聚合物之一连接，例如，聚乙二醇、聚丙二醇，聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。也可以将抗体包封在按照例如凝聚技术或界面聚合技术制备的微胶囊(分别例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，在胶体药物释放系统(例如脂质体，白蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和毫微胶囊)中或在大乳剂中。这类技术公开在Remington′s PharmaceuticalSciences，16th edition，Oslo，A.，Ed.，(1980)。

可将本文公开的糖蛋白配制成免疫脂质体。“脂质体”是由能向哺乳动物有效运送药物(如本文公开的抗ErbB2抗体，和任选的一种化疗剂)的各类脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小分子囊泡。脂质体的组分通常排列为双层形式，与生物膜的脂质排列相似。含有所述抗体的脂质体可通过本领域已知方法制备，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：4030(1980)；美国专利4,485,045和4,544,545；以及公开于1997年10月23日的WO97/38731。在美国专利5,013,566中公开了循环时间已增加了的脂质体。

特别有用的脂质体可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物经反相蒸发法产生。通过使脂质体在挤压之下穿过指定孔径大小的滤膜，可获得具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab’片段可如Martin等，J.Biol.Chem.，257：286-288(1982)所述，经二硫键交换反应与脂质体偶联。可任选在所述脂质体中包含一种化疗药物。见Gabizon等，J.National Cancer Inst，81(19)1484(1989)。

(xi)抗体的实例

本发明范围内优选的抗体包括包含以下抗体的氨基酸序列的那些：

抗-HER2抗体，包括含有huMAb 4D5-8(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289(1992)，美国专利5,725,856)的重链和轻链可变区的抗体；抗-CD20抗体，例如美国专利5,736,137(RITUXAN

)中的嵌合抗-CD20“C2B8”，美国专利5,721,108，B1中2H7抗体的嵌合或人源化变体或Tositumomab(BEXXAR

)；

抗-IL-8(St John等，Chest，103：932(1993)，和国际申请(国际申请No.)WO 95/23865)；

抗-VEGF抗体，包括人源化和/或亲合力成熟抗-VEGF抗体，例如人源化抗VEGF抗体huA4.6.1 AVASTIN^TM(Kim等，Growth Factors，7：53-64(1992)，WO 96/30046，和WO 98/45331，1998年10月15日公开)；

抗-PSCA抗体(WO01/40309)；

抗-CD40抗体，包括S2C6及其人源化变体(WO00/75348)；

抗-CD11a(美国专利5,622,700，WO 98/23761，Steppe等，Transplant Intl.4：3-7(1991)，和Hourmant等，Transplantation 58：377-380(1994))；

抗-IgE(Presta等，J.Immunol.151：2623-2632(1993)，和国际申请WO95/19181；美国专利5,714,338，1998年2月3授权或美国专利5,091,313，1999年2月25日授权，WO 93/04173，1993年3月4日公开，或WO99/01556，1999年1月14日公开，美国专利5,714,338)；

抗-CD18(美国专利5,622,700，1997年4月22日授权或WO 97/26912，1997年7月31日公开)；

抗-Apo-2受体抗体(WO 98/51793，1998年11月19日公开)；

抗-TNF-α抗体包括cA2(REMICADE

)，CDP571和MAK-195(见美国专利5,672,347，1997年9月30日授权，Lorenz等J.Immunol.156(4)：1646-1653(1996)，和Dhainaut等Crit.Care Med.23(9)：1461-1469(1995))；

抗-组织因子(TF)(欧洲专利0 420 937 B1，1994年11月9日授权)；

抗-人α₄-β₇整合素(WO 98/06248，1998年2月19日公开)；

抗-EGFR(例如WO96/40210中的嵌合或人源化225抗体1996年11月19日公开)；

抗-CD3抗体，例如OKT3(美国专利4,515,893，1985年5月7日授权)；

抗-CD25或抗-tac抗体例如CHI-621(SIMULECT

)和(ZENAPAX)(参见美国专利5,693,762，1997年12月2日授权)；

抗-CD4抗体例如cM-7412抗体(Choy等Arthritis Rheum 39(1)：52-56(1996))；

抗-CD52抗体，例如CAMPATH-1H(Riechmann等Nature 332：323-337(1988)；

抗-Fc受体抗体，例如针对FcγRI的M22抗体，Graziano等J.Immunol.155(10)：4996-5002(1995)；

抗-癌胚抗原(CEA)抗体，例如hMN-14(Sharkey等Cancer Res.55(23Suppl)：5935s-5945s(1995)；

针对乳腺上皮细胞的抗体包括huBrE-3，hu-Mc3和CHL6(Ceriani等Cancer Res.55(23)：5852s-5856s(1995)；和Richman等Cancer Res.55(23Supp)：5916s-5920s(1995))；

与结肠癌细胞结合的抗体例如C242(Litton等Eur J.Immunol.26(1)：1-9(1996))；

抗-CD38抗体，例如AT 13/5(Ellis等J.Immunol.155(2)：925-937(1995))；

抗-CD33抗体，例如Hu M195(Jurcic等Cancer Res 55(23 suppl)：5908s-5910s(1995)和CMA-676或CDP771；

抗-CD22抗体，例如LL2或LymphoCide(Juweid等Cancer Res 55(23Suppl)：5899s-5907s(1995)；

抗-EpCAM抗体，例如17-1A(PAN或EX

)；

抗-GpIIb/IIIa抗体，例如abciximab或c7E3 Fab(REOPRO

)；

抗-RSV抗体，例如MEDI-493(SYNAGIS)；

抗-CMV抗体，例如PROTOVIR

；

抗-HIV抗体，例如PRO542；

抗-肝炎抗体，例如抗-Hep B抗体OSTAVIR

；

抗-CA 125抗体OvaRex；

抗-独特型GD3表位抗体BEC2；

抗-αvβ3抗体VITAXIN

；

抗-人肾细胞癌抗体，例如ch-G250；ING-1；

抗-人17-1A抗体(3622W94)；

抗-人结肠直肠肿瘤抗体(A33)；

抗-人黑素瘤抗体R24，它针对GD3神经节苷脂；

抗-人鳞状细胞癌(SF-25)；和

抗-人白细胞抗原(HLA)抗体，例如Smart ID10和抗-HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。

本文感兴趣的糖蛋白优选是抗体，和其它可根据本文所述方法修饰的含有Fc区的糖蛋白。此种分子的实例是免疫粘附素。

D.免疫粘附素制备

最简单和最直接的免疫粘附素设计将粘附素的结合结构域(例如受体的胞外结构域(ECD))和免疫球蛋白重链的Fc区结合。通常，制备本发明的免疫粘附素时，编码粘附素结合结构域的核酸将以C末端与编码免疫球蛋白恒定区序列的N末端的核酸融合，而以N末端融合也是可能的。

典型地，在所述融合中，所编码的嵌合多肽会保留至少具有功能活性的免疫球蛋白重链恒定区的铰链，CH2和CH3区。也可产生与恒定区Fc部分的C-末端，或重链CH1的临近N-末端或轻链的对应区域的融合物。融合所在的精确位置是不严格的；特别的位点是众所周知的并可选以最优化免疫粘附素的生物活性，分泌或结合特性。

在优选方案中，将粘附素序列融合到免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc区域的N-末端。可将整个重链恒定区融合到粘附素序列。然而，更优选地，在融合物中应用开始于铰链区，刚好位于化学限定IgG Fc的木瓜蛋白酶剪切位点上游的序列(即残基216，将重链恒定区的第一个残基作为114)或其它免疫球蛋白的类似位点。在特别优选实施方案中，将所述粘附素氨基酸序列融合到IgG重链的(a)铰链区，CH2和CH3区，或(b)铰链区，CH1，CH2和CH3区。

对于双特异性免疫粘附素，该免疫粘附素作为多聚体，特别作为异源二聚体或异源四聚体组装。一般，这些组装的免疫球蛋白会具有已知的单位结构。基本的四链结构单位是IgG，IgD和IgE存在的形式。在较高分子量的免疫球蛋白中重复一种四链单位；IgM通常以四个基本单位通过二硫键抱团的五聚体存在。IgA球蛋白，偶尔是IgG球蛋白，也会以血清中的多聚体形式存在。在多聚体情况下，每个四单位可相同或不同。

本文范围内多个举例组装的免疫粘附素见如下图表示意：

(a)AC_L-AC_L；

(b)AC_H-(AC_H，AC_L-AC_H，AC_L-V_HC_H，或V_LC_L-AC_H)；

(c)AC_L-AC_H-(AC_L-AC_H，AC_L-V_HC_H，V_LC_L-AC_H，或V_LC_L-V_HC_H)；

(d)AC_L-V_HC_H-(AC_H，或AC_L-V_HC_H，V_LC_L-AC_H)；

(e)V_LC_L-AC_H-(AC_L-V_HC_H，或V_LC_L-AC_H)；和

(f)(A-Y)_n-(V_LC_L-V_HC_H)₂，

其中每个A代表同一或不同的粘附素氨基酸序列；

V_L为免疫球蛋白轻链可变区；

V_H为免疫球蛋白重链可变区；

C_L为免疫球蛋白轻链恒定区；

C_H为免疫球蛋白重链恒定区；

N为大于1的整数；

Y命名的是共价交联剂的残基。

为简短起见，前述结构只表现出主要性质；它们不表示免疫球蛋白的连接区(J)或其它结构域，也不显示二硫键。然而，当所述结构域对结合活性所必需时，它们将被构建在免疫球蛋白分子中其所占据的常规(ordinary)位置。

可选地，该粘附素序列可被插入免疫球蛋白重链和轻链序列之间，因而可获得包含嵌合重链的免疫球蛋白。在此实施方案中，所述粘附素序列被融合到免疫球蛋白每条臂上的免疫球蛋白重链的3’末端，或者在铰链和CH2结构域之间，或者在CH2和CH3结构域之间。相似构建体已被Hoogenboom等，Mol.Immunol.，28：1027-1037(1991)报道。

尽管本发明的免疫粘附素不需要免疫球蛋白轻链的存在，免疫球蛋白轻链可以共价连接到粘附素-免疫球蛋白重链融合多肽，或直接融合到粘附素的方式存在。在前者的情况下，编码免疫球蛋白轻链的DNA通常与编码粘附素-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。一旦分泌，杂交重链和轻链可共价连接以提供包含两个双硫-连接的免疫球蛋白重链-轻链对的类免疫球蛋白结构。适合制备此种结构的方法，在例如美国专利4,816,567(发表于1989年3月28日)中公开。

通过将编码框内粘附素部分的cDNA序列与免疫球蛋白cDNA序列融合来非常方便地构建免疫粘附素。然而，也可用与基因组免疫球蛋白片段的融合(见例如，Aruffo等，Cell，61：1303-1313(1990)；和Stamenkovic等，Cell，66：1133-1144(1991))。后一种类型的融合需要Ig表达调控序列的存在。基于源自脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库的公布序列，用杂交或聚合酶链式反应(PCR)技术，分离编码IgG重链恒定区的cDNA。将编码“粘附素”的cDNA和免疫粘附素的免疫球蛋白部分的cDNA串联插入到在所选宿主细胞中指导有效表达的质粒载体中。

E.载体，宿主细胞和重组方法

本发明还提供编码本文糖蛋白的分离的核酸，载体和包含该核酸的宿主细胞，和生产糖蛋白的重组技术。

为进行糖蛋白的重组生产，分离编码它的核酸并把核酸插入可复制的载体中进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码糖蛋白的DNA易于利用传统方法分离和测序(例如，通过使用能够与编码糖蛋白的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可利用许多载体。载体的组分通常包括，但不限于，以下物质中的一种或多种：信号序列，复制起点，一个或多个标记基因，增强子，启动子，和转录终止序列。

(i)信号序列成分

本发明的糖蛋白不仅可直接被重组生产，也可以作为与异源多肽的融合蛋白被生产，该异源多肽优选是信号序列或在成熟蛋白或多肽的N末端具有特定切割位点的其它多肽。选定的异源信号序列优选是可由宿主细胞识别和加工(即，由信号肽酶切割)的序列。对于不识别和加工天然多肽信号序列的原核细胞，信号序列由以下原核信号序列取代，例如选自碱性磷酸酶，青霉素酶，lpp，或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌物，天然信号序列可由例如酵母转化酶前导序列，α因子前导序列(包括糖酵母(Saccharomyces)和克鲁维酵母(Kluyveromyces)α-因子前导序列)，或酸性磷酸酶前导序列，白色念珠菌(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列，或WO 90/13646中所述的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列，例如，单纯疱疹gD信号。

在阅读框架中，此种前体区的DNA连接于编码多肽的DNA。

(ii)复制成分的起点

表达载体和克隆载体都包含能使该载体在一或多种选定的宿主细胞中复制的核酸序列。一般情况下，在克隆载体中，这种序列是能使该载体独立于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自我复制序列。这样的序列在各种细菌、酵母和病毒中都是众所周知的。质粒pBR322的复制起点适合大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合酵母菌，多种病毒起点(SV40，多瘤病毒(Polyoma)，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。复制起点组分一般不是哺乳动物表达载体所必需的(SV40起点的使用通常仅仅是由于其包含早期启动子)。

(iii)选择基因成分

表达载体和克隆载体应该包含选择基因，也称选择标记。该基因编码使经过转化的宿主细胞在选择性培养基中存活或生长所必需的蛋白。没有被包含该选择基因的载体转化的宿主细胞在所述选择性培养基中不能存活。典型的选择基因编码具有以下性质的蛋白：(a)赋予对抗生素或其它毒素(如氨苄青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四环素)的抗性，(b)弥补营养缺陷，或(c)提供复合培养基不能供给的关键营养物，例如编码芽孢杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。

选择方案的一个实例是利用药物限制(arrest)宿主细胞的生长。那些被异源基因成功转化的细胞产生一种赋予药物抗性的蛋白，从而在该选择环境中存活。这种显性选择可以采用的药物有新霉素，霉酚酸和潮霉素。

适合于哺乳动物细胞的另一例选择标记是允许鉴定能摄取多肽核酸的细胞的那些标记，如DHFR或胸苷激酶，金属硫蛋白-I和-II，优选灵长类金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等。

例如，用DHFR选择基因转化的细胞首先通过将所有转化体培养在包含氨甲蝶呤(Mtx，为DHFR的一种竞争型拮抗剂)的培养基中来进行鉴定。当采用野生型DHFR时，合适的宿主细胞包括DHFR活性有缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

或者，宿主细胞(尤其包含内源DHFR的野生型宿主)被编码Bv8的DNA序列，野生型DHFR蛋白，以及另一种选择标记如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH)转化或共转化以后，可以通过在含有针对该选择标记的选择试剂如氨基糖苷类抗生素(如卡那霉素，新霉素或G418)的培养基中培养细胞来进行选择。参见美国专利4,965,199。

适用于酵母的合适选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，282：39(1979))。Trp1基因为不能在色氨酸中生长的酵母突变株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了选择标记(Jones，Genetics，85：12(1977))。此后，酵母宿主细胞基因组中trp1损伤的存在提供了通过在缺乏色氨酸的条件中生长而检测转化的有效环境。类似地，Leu2-缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)可以由携带Leu2基因的已知质粒来补充。

此外，源自1.6μm环状质粒pKD1的载体可以用于转化克鲁维酵母(Kluyveromyces)。Bianchi等，Curr.Genet.，12：185(1987)。可选地，Van den Berg，Bio/Technology，8：135(1990)报道了一种用于在乳克鲁维酵母(K.lactis)中大规模制备重组小牛凝乳酶的表达系统。已公开由克鲁维酵母的工业生产菌株产生分泌重组人血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体。Fleer等，Bio/Technology，9：968-975(1991)。

(iv)启动子成分

表达载体和克隆载体通常包含能被宿主生物识别的启动子，它与多肽核酸可操作相连。适用于原核宿主的启动子，包括phoA启动子，β-内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统，和杂化启动子如tac启动子。然而，也可以使用其它已知的细菌启动子。适用于细菌系统的启动子还包含与编码多肽的DNA可操作相连的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。

真核生物的启动子序列也是已知的。几乎所有的真核基因在转录起始点上游约25-30个碱基处具有AT-富集区。很多基因在其转录起始点上游70-80个碱基处有另一种序列：CXCAAT，其中X可以是任何核苷酸。大多数真核基因的3’端是AATAAA序列，它可以作为一种信号用于将poly-A尾添加到编码序列3’端。所有这些序列都适合于插入真核表达载体中。

适用于酵母宿主的启动序列的实例包括：3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，J.Biol.Chem.，255：2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7：149(1968)；Holland，Biochemistry，17：4900(1978))的启动子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸异构酶，3-磷酸甘油变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。

其它的酵母启动子，即那些还具有由生长条件控制转录的优点的诱导型启动子，是下述基因的启动子区：醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。在EP 73,657中进一步描述了适用于酵母表达系统的载体和启动子。酵母增强子与酵母启动子联合使用也是有利的。

在哺乳动物宿主细胞中，从载体转录多肽可以受启动子调控，所述启动子例如来自病毒基因组，如多形瘤病毒、鸡痘病毒(1989年7月5日公布的UK 2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的启动子，或者来自异源哺乳动物的启动子，如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子等，来自热休克蛋白的启动子，以及来自通常与Bv8序列相连的启动子，前提是这些启动子与宿主细胞系统相容。

SV40病毒的早期和晚期启动子可以作为还包含SV40病毒复制起点的SV40限制性片段而方便地获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子可以作为Hind III E限制性片段方便地获得。美国专利4,419,446中公开了在哺乳动物宿主中用牛乳头瘤病毒作为载体来表达DNA的系统。美国专利4,601,978中叙述了对这个系统的改进。另见Reyes等，Nature，297：598-601(1982)中关于在单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子控制下在小鼠细胞中表达人β干扰素cDNA。可选地，可将劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。

(v)增强子成分

编码本发明多肽的DNA在高等真核生物中的转录常常通过将增强子序列插入载体中来增加。目前已知很多哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。但通常使用真核细胞病毒的增强子。实例包括在其复制起始点晚期侧的SV40增强子(bp 100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，在其复制起始点晚期侧的多形瘤增强子，和腺病毒增强子。也可参见Yaniv，Nature，297：17-18(1982)所述用于活化真核启动子的增强元件。所述增强子可以剪接插入载体中多肽编码序列的5’或3’侧，但优选位于启动子的5’侧。

(vi)转录终止成分

用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的有核细胞)的表达载体，还包括对转录终止和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常来自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶尔为3’)非翻译区。这些区域包含转录为编码多肽的mRNA的非翻译区中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一种有用的转录终止元件是牛生长激素多腺苷区。见WO94/11026和其中公开的表达载体。

(vii)宿主细胞的选择和转化

克隆或表达本文所述载体中DNA的适宜宿主细胞，包括原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如，大肠杆菌(E.coli)，肠杆菌属(Enterobacter)，欧文菌属(Erwinia)，克雷白菌属(Klebsiella)，变形菌杆属(Proteus)，沙门菌属(Salmonella)(如鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium))，沙雷菌属(Serratia)(如粘质沙雷菌(Serratia marcescans))和志贺菌属(Shigella)等，以及芽孢杆菌属(Bacilli)如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日出版的DD 266,710中所述地衣芽孢杆菌41P)等，假单胞菌属(Pseudomonas)如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，及链霉菌(Streptomyces)。优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，但其它菌株，如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些实例是用于说明，并非限制。

除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合于多肽编码载体的克隆或表达的宿主。酿酒酵母或常见的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。还有多个其它属、种和株已有商品供应，并且可以用于本发明，例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，例如乳克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维氏酵母(K.marxianus)等；yarrowia(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)(EP 183,070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28：265-278(1988))；念珠菌属；Trichoderma reesia(EP244,234)；粗糙链孢霉；许旺氏酵母属(schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)等；和丝状真菌，例如链孢霉属、青霉属、Tolypocladium以及曲霉属宿主如构巢曲霉和黑曲霉。

适合于表达糖基化多肽的宿主细胞来自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。目前已经从下述宿主中鉴定了大量的杆状病毒株和变体以及相应的容许型昆虫宿主细胞：草地夜蛾(SpodopteraFrugiperda，毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti，蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus，蚊子)、Drosophila melanogaster(果蝇)和家蚕蛾(Bombyx mori)等。用于转染的各种病毒株公众可以获得，例如加利福尼亚Y级夜蛾(Autographa california)NPV的L-1变体和家蚕蛾NPV的Bm-5株，并且这些病毒可以在此用作本发明的病毒，尤其是用于转染草地夜蛾细胞。

棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草等的植物细胞培养物也可以用作宿主。

然而，关注最多的是脊椎动物细胞，而且在培养(组织培养)中繁殖脊椎动物细胞已经成为常规方法。有效哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293细胞或经过再克隆以便能在悬浮培养物中生长的293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：4216(1980))；小鼠足细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCCCCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK ATCC CCL 34)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；小鼠骨髓瘤细胞，例如NSO(如RCB0213，Bebbington等，Bio/Technology 10：169(1992))和SP2/0细胞(例如SP2/0-Ag14细胞，ATCCCRL 1581)；大鼠骨髓瘤细胞，例如YB2/0细胞(例如YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞，ATCC CRL 1662)；和人肝癌细胞系(HepG2)。实施本发明优选的细胞系是二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷的CHO，如CHO-K1，DUX-B11，CHO-DP12，CHO-DG44(Urlaub等，Somatic Cell andMolecular Genetics 12：555(1986))，而Lec13是典型的CHO宿主细胞系。DUX-B11细胞已由携带前胰岛素原cDNA的pSVEHIGNeo转染，产生克隆CHO-DP12。对于CHO-K1(ATCC CRL 61)，DUX-B11(Simonsen等PNAS(USA)80：2495-2499(1983))，DG44或CHO-DP12宿主细胞，它们可能发生变异导致其岩藻糖基化其中表达的蛋白的能力有缺陷。

本发明也可用于杂交瘤细胞。术语“杂交瘤”指通过免疫来源的无限增殖细胞系与抗体生产细胞的融合产生的杂交细胞系。该术语包含异种杂交瘤融合物的子代，它是与人细胞和小鼠骨髓瘤细胞系的融合的结果，其中小鼠骨髓瘤细胞系后来与浆细胞融合，通常称为三瘤细胞系。进一步地，该术语意在包括任何产生抗体的无限增殖杂交细胞系例如，quadromas(见，例如，Milstein等，Nature，537：3053(1983))。杂交细胞系可以是任何物种的，包括人和小鼠的。

在最优选的实施方案中，哺乳动物细胞是非杂交瘤哺乳动物细胞，它由体外分离的感兴趣的多肽编码核酸转化。“外源性核酸”或“异源核酸”是指与对该细胞而言是外来的核酸序列，或与细胞同源但其在宿主细胞中的位置通常没有核酸被发现。

(viii)培养宿主细胞

宿主细胞由上述多肽生产的表达或克隆载体转化，并在传统培养基中培养，该宿主细胞经修饰适合诱导启动子，选择转化体，或扩增编码所需序列的基因。

可在多种培养基中培养用于生产本发明多肽的宿主细胞。作为商品提供的培养基例如Ham’s F10(Sigma)，Minimal EssentialMedium((MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)，和Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium((DMEM)，Sigma)适宜培养宿主细胞。此外，Ham等，Meth.Enzym.58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)，美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985中所述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。在需要时均可向这些培养基的任何一种补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素，转铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(例如氯化钠，钙，镁，和磷酸盐)，缓冲液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷酸和胸腺嘧啶)，抗生素(例如GENTAMYCIN^TM药物)，微量元素(定义为无机化合物，通常终浓度在微摩尔范围内)，和葡萄糖或对等的能源。也可包括本领域熟练技术人员所知的适当浓度的任何其它必需添加剂。培养条件，例如温度，pH，等是此前选择用于表达的宿主细胞的条件，并且是本领域普通熟练技术人员显而易见的。

所有培养基通常提供以下一种或多种类别中的至少一种组分：

1)能源，通常是碳水化合物的形式，例如葡萄糖；

2)所有必需氨基酸，通常是二十种基础氨基酸加半胱氨酸；

3)维生素和/或其它需要保持低浓度的有机化合物；

4)游离脂肪酸；和

5)微量元素，其中微量元素定义为无机化合物或天然存在的元素，通常需要保持极低浓度，多在微摩尔范围内。

培养基优选不含血清和其它动物源性蛋白，例如少于约5％，优选少于1％，更优选0到0.1％血清。然而，如果需要，可以使用上述物质。在本发明优选的实施方案中，细胞培养基包括超量的氨基酸。超量提供的氨基酸可，例如，选自Asn，Asp，Gly，Ile，Leu，Lys，Met，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val。优选，超量提供Asn，Asp，Lys，Met，Ser和Trp。例如，可使用的氨基酸，维生素，微量元素和其它介质成分的量是欧洲专利EP307,247或美国专利6,180,401中所述范围的一或两倍。

对于表达所需蛋白并能够将所需碳水化合物添加到特定位置的哺乳细胞的培养，只要特别注意到所培养的细胞，可使用多种培养条件。本领域人员熟悉适宜哺乳细胞的培养条件(Cleveland等，J.Immunol.Methods56：221-234(1983))或者可由熟练技术人员轻易确定(见，例如，Animal CellCulture：A Practical Approach 2^nd Ed.，Rickwood，D.和Hames，B.D.，eds.Oxford University Press，New York(1992))，并可根据具体选定的宿主细胞变化。

(ix)糖蛋白的纯化

使用重组技术时，糖蛋白可在细胞内，壁膜间隙产生，或直接分泌到培养基中。如果糖蛋白在细胞内产生，第一步需要去除宿主细胞或溶解片段的粒状残骸，例如，通过离心或超滤作用。Carter等，Bio/Technology10：163-167(1992)描述了分离抗体的方法，该抗体被分泌到大肠杆菌的壁膜间隙。简言之，细胞悬浊液(paste)在乙酸钠(pH 3.5)，EDTA，和phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF)存在下，经过30分钟解冻。通过离心可去除细胞碎片。如果糖蛋白被分泌到培养基中，通常首先使用作为商品提供的蛋白浓缩滤纸(例如，Amicon或Millipore Pellicon ultrafiltration unit)浓缩该表达系统的上清。在此前的任何步骤中，可使用蛋白酶抑制物例如PMSF抑制蛋白溶解，以及使用抗生素防止外来污染物的生长。

由细胞制备的糖蛋白组合物可使用如下方法纯化：例如，羟磷灰石层析，凝胶电泳，透析和亲和层析，优选亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性有赖于存在于糖蛋白中的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人(1，γ2，或γ4重链的糖蛋白(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和配体附着的基质通常是琼脂糖，但也可用其它基质。物理稳定的基质例如孔径被控制的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)比使用琼脂糖获得更快的流率而且加工时间更短。对于含有C_H3区的糖蛋白，Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)可用于纯化。根据待回收的糖蛋白，也可利用其它蛋白纯化技术例如；在离子-交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅石(silica)上层析，在肝素SEPHAROSE^TM上层析，在阳离子或阴离子-交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上层析；聚焦层析；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀。

在一个实施方案中，利用对凝集素底物(例如凝集素亲合柱)的吸附也可以纯化糖蛋白，该吸附作用可从制备物中去除含有岩藻糖的糖蛋白，从而富集不含岩藻糖的糖蛋白。

F.糖蛋白分析

可轻易分析按照本发明的方法生产的糖蛋白的复合碳水化合物部分，从而确定上述糖基化反应已完成。通过传统的碳水化合物分析技术分析寡糖。因此，例如，本领域人员熟悉的凝集素蛋白印迹技术，显示了末端甘露糖或其它糖例如半乳糖的比例。

优选地，利用实施例1和Shields等，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)中的MALD1-TOF质谱分析来分析碳水化合物。

本领域已知若干糖基化分析方法，这些方法可用在本文中。这些方法提供了关于附着于多肽的寡糖的同一性和组成的信息。用于本发明的碳水化合物分析法包括但不限于，凝集素层析；HPAEC-PAD，它利用高PH阳离子交换层析根据电荷分离寡糖；NMR；质谱分析；HPLC；GPC；单糖成分分析；连续酶消化。

此外，本领域人员已知释放寡糖的方法。这些方法包括

1)酶的方法，例如使用岩藻糖苷酶例如α-L-岩藻糖苷酶去除岩藻糖；

2)苛刻碱性环境下的消除，释放主要是O-连接的结构；和

3)化学方法，使用无水肼释放N-连接的和O-连接的寡糖。

通过高效阳离子交换层析和脉冲电流检测(HPAE-PAD碳水化合物系统，Dionex Corp.)检测中性糖和氨基糖。例如，100℃条件下，通过在20％(v/v)的三氟乙酸中水解6小时可释放糖。随后通过冻干法或由Speed-Vac(SavantInstruments)干燥水解产物。然后在1％的乙酸钠三水合物溶液中溶解残基，并如Anumula等Anal.Biochem.195：269-280(1991)所述在HPLC-AS6柱上分析。

在平行三份样品中，通过Yao等Anal Biochem.179：332-335(1989))的直接比色法可单独测定唾液酸。在优选的实施方案中，使用Warren，L.J.BiolChem 238：(8)(1959)的硫代巴比妥酸(TBA)。

可选地，可进行免疫印迹碳水化合物分析。根据本方法，使用商品化的多糖检测系统(Boehringer)可检测蛋白连接的碳水化合物，该系统基于Haselbeck和Hosel(Haselbeck等Glycoconjugate J.，7：63(1990))所述的氧化物免疫印迹法。

分析的方法包括为分析抗体相关的寡糖所述的那些和例如Wormald等，Biochem.36：1370-1380(1997)；Sheeley等Anal.Biochem.247：102-110(1997)and Cant等，Cytotechnology 15：223-228(1994)以及其中引用的对比文件所述的那些。

G.药物配制剂

可以通过将具有适当纯度的所需化合物与可选的药用载体，赋形剂，或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.ed.(1980))混合形成冻干制剂或水溶液制备治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkonium chloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN^TM，PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

本文的配制剂也可包含治疗特定指征所需的一种以上的活性化合物，优选活性互补但相互无副作用的那些。例如，该配制剂可进一步包含另一种抗体或化疗剂。此种分子以有效治疗量出现于联合用药中。

该活性成分也可包裹在通过诸如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊中，例如，分别在胶质药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳状液，纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开于Remington′sPharmaceutical Sciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980)。

用于体内给药的本发明化合物必需是无菌的。这可以通过在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。

可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且含有糖蛋白的固体疏水聚合物半通透基质，例如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3773919，EP 58,481)，L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22：547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出处同上)，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron Depot^TM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。当胶囊化抗体长时间停留在体内时，它们可能由于暴露在37℃潮湿环境中而变性或凝聚，导致损失生物活性，且免疫原性可能会改变。可以根据相关机理来设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特异性聚合物基质组合物来实现稳定。

药物组合物可以是冻干的。美国专利6,267,958描述了冻干的抗体配制剂。美国专利6,171,586B1描述了稳定的液体抗体配制剂。

H.糖蛋白的非治疗用途

本发明的糖蛋白可用作亲合纯化试剂。在该方法中，利用本领域已知的方法将糖蛋白固定于例如葡聚糖凝胶树脂或滤纸的固相上。固定的糖蛋白与含有待纯化抗原的样品接触，随后使用适宜的溶剂洗涤支持物，该溶剂可充分去除样品中除结合与固定糖蛋白的待纯化抗原外所有的物质。最后，以另一种适宜的洗涤剂例如甘氨酸缓冲液，pH 5.0，洗涤支持物，该缓冲液可将抗原从糖蛋白上释放出来。

糖蛋白也可用于诊断分析，例如，用于检测特定细胞，组织或血清中感兴趣的抗原的表达。

用于诊断时，通常用可检测的部分标记糖蛋白。可利用多种标记，通常分为以下几类；

(a)放射性同位素，例如³⁵S，¹⁴C，¹²⁵I，³H，和¹³¹I。使用例如CurrentProtocols in Immunology，Volumes 1 and 2，Coligen等，Ed.Wiley-Interscience，New York，New York，Pubs.(1991)中所述的技术可用放射性同位素标记糖蛋白并且可使用闪烁技术测定放射活性。

(b)可利用荧光标记，例如稀土元素螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰，里沙明(Lissamine)，藻红蛋白和Texas Red。利用例如上文的Current Protocols in Immunology，中公开的技术可将荧光标志物偶联于糖蛋白。可用荧光计定量荧光。

(c)可利用各种酶底物标记，美国专利4,275,149提供了其中的一些的综述。酶通常催化产色底物的化学变化，利用各种技术可测量这种化学变化。例如，酶可催化底物中的颜色变化，这种变化可用分光光度法测定。可选地，酶可改变底物的荧光或化合光。定量荧光变化的技术见上文。化学发光底物经化学反应而电激发，发射出可测量的光(例如使用化学光度计)或将能量释放到荧光接收器。酶标记的实例包括荧光素酶(例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利4,737,456)，虫荧光素(luciferin)，2，3-二氢二氮杂萘啶(2，3-dihydrophthalazinedione)，苹果酸脱氢酶，脲酶，过氧化物酶例如辣根过氧化物酶(HRPO)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，杂环氧化酶(例如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)，乳过氧化物酶，微过氧化物酶(microperoxidase)，如此等等。对将酶偶联于抗体的技术描述见O’Sullivan等，Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates foruse in Enzyme Immunoassay，in Methods in Enzym.(ed J.Langone & H.VanVunakis)，Academic press，New York，73：147-166(1981)。

酶底物结合物的实例包括，例如：

(i)辣根过氧化物酶(HRPO)，以氢过氧化物酶为底物，其中氢过氧化物酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(OPD)或盐酸3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB))；

(ii)碱性磷酸酶(AP)，以磷酸对硝基苯作为产色底物；和

(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)和产色底物(例如，p-硝基苯-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形酰(methylumbelliferyl)-β-D-半乳糖苷酶.

本领域熟练技术人员熟悉许多其它的酶-底物结合物。有关综述见美国专利4,275,149和4,318,980。

有些情况下，标志物间接地与糖蛋白偶联。熟练技术人员熟悉各种实现此种偶联的技术。例如，糖蛋白可与生物素偶联，而且上述标志物的三种广义类别中的任何一种均可与抗生物素蛋白偶联，或反之。生物素选择性地结合抗生物素蛋白，并由此将标志物以这种间接的方式偶联于糖蛋白。可选地，为获得标志物与糖蛋白的间接偶联，糖蛋白与小的半抗原(例如，地高辛)偶联，而且上述不同类型的标志物之一可以和抗-半抗原多肽(例如，抗-地高辛抗体)偶联。由此实现标志物和糖蛋白的间接偶联。

在本发明的另一实施方案中，无需标记糖蛋白，而且利用与糖蛋白结合的标记抗体可检测糖蛋白的存在。

本发明的糖蛋白可用于任何已知的实验方法，例如，竞争结合分析，直接和间接夹心法分析，和免疫沉淀分析。Zola，单克隆抗体：A Manual ofTechniques，147-158页(CRC Press，Inc.1987)。

糖蛋白也可用于体内诊断分析。通常，以放射性核素(例如¹¹¹In，⁹⁹Tc，¹⁴C，¹³¹I，¹²⁵I，³H，³²P或³⁵S)标记糖蛋白，使得利用免疫闪烁照相可以定位表达该糖蛋白的抗原或细胞。

I.糖蛋白的体内使用

据预计本发明的糖蛋白可用于治疗哺乳动物例如患有将从该糖蛋白的用药中受益的疾病或有得病倾向的病人。可由该糖蛋白治疗的情形很多，包括癌症(例如糖蛋白结合肿瘤相关抗原，B-细胞表面抗原例如CD20，ErbB受体例如HER2受体，血管生成因子例如血管内皮生长因子(VEGF)的情形)；过敏性疾病例如哮喘(利用抗-IgE抗体)；和LFA-1-介导的疾病(例如糖蛋白是抗-LFA-1或抗-ICAM-1抗体时)等等。如果抗体结合B-细胞表面标志物例如CD20，优选的指征是B-细胞恶性疾病(例如非何杰金氏淋巴瘤)，自身免疫性疾病，或为阻断对外来抗原的免疫反应(见WO01/03734)。

如果抗体结合ErbB受体，优选的疾病是表达ErbB的癌症，例如良性或恶性肿瘤，其特征是ErbB受体的过度表达。此种癌症包括，但不限于，乳腺癌，鳞状细胞癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，胃肠道癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，膀胱癌，肝癌(hepatoma)，结肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌，唾液腺癌，肾癌，肝癌(liver cancer)，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌(liver carcinoma)和各种头颈部癌。

根据本发明的教导，技术人员可以制备具有变体Fc区的糖蛋白，它具有增强的ADCC活性。此种分子常见地用于治疗不同的疾病。

例如，具有增强的ADCC活性的糖蛋白可用于治疗需要破坏或去除组织或外来微生物的疾病。例如，该糖蛋白可用于治疗癌症，自身免疫性疾病，炎性疾病；感染(例如细菌，病毒，真菌或酵母菌感染)；和其它需要去除组织的情形(例如甲状腺肿)等等。

糖蛋白可以任何适宜的途径给药，包括，胃肠外，皮下，腹膜内，肺内和鼻内，而且如果用于局部免疫抑制治疗，可通过损伤部部位内给药。胃肠外输液包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内或皮下给药。此外，糖蛋白适合脉冲输液给药，尤其是糖蛋白的剂量递减时。优选通过注射给药，更优选静脉内或皮下注射，根据用药是短期或长期而不同。

为预防或治疗疾病，糖蛋白的适当剂量依赖于所治疾病的类型，疾病的严重程度和进程，糖蛋白给药的目的是预防还是治疗，先前的治疗，患者的临床病史和对抗体的应答，以及主治医生的判断。糖蛋白适宜一次性地或以一系列治疗的方式施用于患者。

根据受治疾病的严重程度和类型，施用于患者的糖蛋白的初始侯选剂量是约1μg/kg到约15mg/kg体重(例如约0.1-20mg/kg/剂)，无论是例如通过一次或分多次给药，还是通过连续输注给药。典型的日剂量可从约1μg/kg到约100mg/kg或更多，根据上述因素不同而变化。对于数天或更长时间的重复给药，视具体情况而将治疗持续到出现对疾病症状的所需抑制为止。然而，除此之外，其它的剂量方案也可以使用。治疗的进展很容易通过常规技术和试验来监测。本文的实施例显示，与含有岩藻糖的糖蛋白相比，可给药较低剂量的糖蛋白(例如不含岩藻糖的抗体)。

糖蛋白组合物的配制，确定剂量，和给药均应以符合良好医疗实践的方式进行。本文考虑的因素包括待治疗的具体疾病，待治疗的具体哺乳动物，每个病人的临床情况，疾病的原因，药剂的传送部位，给药方法，给药方案，和其它医务人员已知的因素。给药糖蛋白的“治疗有效量”由上述因素控制，而且是预防，改善或治疗疾病所必需的最小量。糖蛋白无需，但任选地可与一种或几种目前用来预防或治疗所述疾病的药剂配制在一起。这些其它药剂的有效量有赖于配置剂中糖蛋白的量，疾病或治疗的类型，和上述讨论的其它因素。通常它们使用的剂量相同，用药途径如上文所述或约为迄今使用剂量的1到99％。

治疗抗体组合物通常置于具有无菌存取口的容器中，例如静脉注射袋或带有能通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。

用作为拮抗剂的本发明抗体治疗的患者，也可接受放射治疗。或者或此外，可以将其它化疗剂给药该患者。此类化疗剂的配制和给药方案可以按照制造商的指示进行或者由熟练的临床医师根据经验决定。此类化疗剂的配制和给药方案也可以参见Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。化疗剂可以在给药本发明抗体之前或之后给药，或者二者同时给药。对于癌症的指征，也可给药针对肿瘤相关抗原或针对血管生成因子的额外抗体，例如与HER2或血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体。可选地，或此外，可将一种或多种细胞因子共同给药病人。

本发明进一步提供了制品和含有对治疗癌症有用的物质的试剂盒。所述制品包含有标签的容器。适宜容器包括，例如，瓶，小瓶，和试管。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。该容器内盛放包含上述糖蛋白制剂的组合物。该组合物中的活性剂是特定糖蛋白。容器上的标签说明该组合物用于治疗或预防特定疾病，并说明了体内的用法，例如上述那些。

本发明的试剂盒包含上述容器和包含缓冲液的第二容器。进一步包括具有商业需要以及符合用户需要的其它材料，如其它缓冲液、稀释剂，过滤用品，针头，注射器，以及带有使用说明的包装插页。

参考以下实施例可更充分的理解本发明。然而，不能将其理解为限制本发明的范围。涉及的所有文献和专利说明包含于本文中作为参考。

实施例

为评价岩藻糖基化的寡糖在IgG功能中的作用，使用Lec13细胞系(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986))表达人IgG1。该CHO细胞系添加岩藻糖的能力有缺陷，但提供了具有寡糖的IgG，该IgG在其它方面与正常CHO细胞系中发现的和来自人血清的相似。产生的IgG产物用于评估岩藻糖基化的碳水化合物对抗体效应器功能的影响，包括对与人FcγR，人C1q，人FcRn结合的影响，和对利用人效应器细胞的ADCC的影响。

实施例1：与人FcR的结合

稳定细胞系的cDNA构建体：将人源化抗-HER2抗体Hu4D5(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992))，人源化的亲合成熟抗-IgE抗体E27(美国专利6,172,213)，和嵌合抗-CD20抗体C2B8(美国专利5,736,137)的重链和轻链亚克隆入前述的哺乳动物细胞表达载体中(Lucas等Nucl.AcidRes.24，1774-1779(1996))。使用嘌呤霉素作为DHFR(+)细胞中的选择标记，例如Lec13细胞，并且保留DHFR位点用于稳定细胞系的甲氨喋呤扩增。

Lec13和野生型CHO细胞的转染和培养：CHO细胞系Pro-Lec13.6a(Lec13)自Albert Einstein College of Medicine of YeshivaUniversity的Pamela Stanley教授获得。亲代细胞系是Pro-(脯氨酸营养缺陷型)和Gat-(甘氨酸，腺苷，胸苷营养缺陷型)。用于野生型抗体的CHO-DP12细胞系是CHO-K1细胞系(ATCC #CCL-61)的衍生物，它是二氢叶酸还原酶缺陷的，并且具有降低的对胰岛素的需求。使用Superfect法(Qiagen，Valencia，CA)用cDNA转染细胞系。使用10μg/ml的二盐酸嘌呤霉素(puromycindihydrochloride)在含有以下成分的培养基中选择表达所转染抗体的Lec13细胞：含有L-谷氨酰胺，核糖核苷和脱氧核糖核苷(GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)的MEMα培养基，添加10％灭活的FBS(GIBCO)，10mM HEPES，和1X青霉素/链霉素(GIBCO)。类似地，在含有无GHT的Ham′s F12生长培养基中选择CHO细胞：低葡萄糖DMEM，不含甘氨酸，含有NaHCO3，添加5％FBS(GIBCO)，10mM HEPES，2mM L-谷氨酰胺，1X GHT(甘氨酸，次黄嘌呤，胸苷)，和1X青霉素/链霉素。菌落在两到三周内形成，收集后用于扩增和蛋白表达。开始将细胞按照3x10⁶个细胞/10cm板接种，用于小批蛋白的表达。一旦细胞长满该板的90-95％时，将其转至不含血清的培养基中，3-5天后，收集细胞上清，并在Fc IgG-ELISA和完整IgG-ELISA中进行检验，估测蛋白表达水平。转至PS24生产培养基的前一天，按照大约8x10⁶个细胞/15cm板接种Lec13和CHO细胞，并添加10mg/L重组人胰岛素和1mg/L微量元素。

蛋白表达：Lec13细胞和CHO细胞在不含血清的生产培养基中保持3-5天。收集上清，在150ml锥形试管中离心去除细胞和碎片。加入蛋白酶抑制物PMSF和抑肽酶(Sigma，St.Louis，MO)，在使用蛋白G层析(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ))进行即刻纯化前，使用MWCO30滤纸(Amicon，Beverly，MA)在搅匀的细胞上浓缩上清5倍。使用Centripriep-30浓缩器(Amicon)将所有蛋白的缓冲液都换成磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。用A280测定蛋白浓度并用氨基酸组成分析验证。平均每个15cm的板中的Lec13细胞产生10μg mAb；对照CHO细胞中所有抗体的表达比Lec13细胞中高4-5倍。由板上生长的CHO-DP12产生的抗体表示为CHO-P。

CHO-DP12细胞也在玻璃旋转培养瓶中生长。以6x10⁵细胞/ml接种细胞，并在37℃下生长两天。第三天，温度改为33℃，并且允许细胞生长直到由于PH降低到～6.5其生存力降低到70％。玻璃旋转培养瓶中生长的来自CHO-DP12细胞的抗体表示为CHO-S。

天冬酰胺-连接寡糖的基质辅助激光电离吸附飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析：使用Papac等，Glycobiology 8，445-454(1998)的方法，将N-连接的寡糖自重组糖蛋白中解离。简言之，用100μl甲醇处理96孔PVDF覆盖的微滴定板(Millipore，Bedford，MA)的各孔，即使微孔过滤器多银幕真空歧管(Millipore Multiscreen vacuum manifold)处于真空从而使甲醇通过真空抽吸穿过PDVF膜。以3X250μl水洗涤处理后的PVDF膜。在所有洗涤步骤之间，通过将微真空加于歧管而完全抽空各孔。使用还原和羧甲基化的缓冲液(RCM)洗涤膜，该缓冲液由6M盐酸胍，360mM Tris，2mM EDTA组成，pH为8.6。将糖蛋白样品(50μg)加入各孔，再次通过微真空抽吸使样品通过PVDF膜，并使用2X50μl RCM缓冲液洗涤各孔。在各孔中加入50μl0.1M二硫苏糖醇(DTT)溶液，并在37℃下孵育1小时以还原固定后的样品。通过真空去除DTT，并用4x250μl水洗涤各孔。加入50μl 0.1M碘乙酸(IAA)溶液羧甲基化半胱氨酸残基，所述IAA溶液在1M NaOH中新鲜制备，并用RCM缓冲液稀释至0.1M。室温下避光孵育30分钟完成羧甲基化。对该板施用真空以去除IAA溶液，并用4x250μl纯净水洗涤各孔。加入100μl1％PVP360(polyvinylpyrrolidine 360,000MW)(Sigma)溶液封闭PVDF膜并在室温下孵育1小时。利用温和的真空吸引去除PVP-360溶液并用4x250μl水洗涤各孔。将PNGase F(New England Biolabs，Beverly，MA)消化液，10mM醋酸Tris中的25μl的25单位/ml溶液，pH 8.4，加入各孔并在37℃下消化3小时。消化后，将样品转移到500μl Eppendorf管中，并将2.5μl的1.5M乙酸溶液加入各样品中。酸化的样品在室温下孵育3小时，将寡糖由氨基葡糖转化成羟基形式。在MALDI-TOF质谱分析前，使用以搅拌方式紧密填充的0.7-ml柱床体积的阳离子交换树脂反应管(氢形式AG50W-X8树脂)(Bio-Rad，Hercules，CA)(US Biochemical，Cleveland，OH)对释放的寡糖脱盐。

对于样品在正电荷模式中的MALDI-TOF质谱分析，将脱盐的寡糖(0.5μl等份)和0.5μl 2，5-二羟基苯甲酸基质(sDHB)用于没有污染的靶点(stainless target)，该基质是通过将2mg 2，5二羟基苯甲酸和0.1mg 5-甲氧基唾液酸(5-methoxyslicylic acid)溶解于1ml乙醇/10mM氯化钠1∶1(v/v)中制得的。样品/基质混合物由真空干燥。对于样品在负电荷性模式中的MALDI-TOF质谱分析，将脱盐的N-连接的寡糖(0.5μl等份)和0.5μl 2’，4’，6’-三羟基苯乙酮基质(THAP)用于没有污染的靶点，该基质是在1∶3(v/v)乙腈/13.3mM柠檬酸铵缓冲液中制得的。样品/基质混合物经真空干燥，并且在分析前允许样品吸收空气中的水分。通过MALDI-TOF在PerSeptiveBioSystems Voyager-DE质谱分析仪上分析释放的寡糖。在20kV、具有线性构象的正电荷或负电荷模式下，利用延迟提取(delayed extraction)操作质谱分析仪。使用1300的激光能量获得总和状态的数据(240倍扫描)以提高信号抗噪音的能力。使用标准寡糖混合物校准仪器，并在给出质谱值前利用19点Savitsky-Golay算法(19 point Savitsky-Golay algoritym)处理数据。使用Caesar 7.0数据分析软件包(SciBridge Software)整合质谱数据。结果总结于下表中。

      表2.抗体与人FcγR的结合

均值(S.D.)        N  ％-Fucc  ％Gal0    ％Gal1   ％Gal2

FcγRI^a，b

CHO-S             1.00         5         3        53        42      6

CHO-P             0.97(0.07)   5         2        73        25      3

Lec13(A)          1.04(0.07)   4         92       50        43      7

Lec13(B)          1.04(0.10)   5         91       55        40      5

FcγRIIA(R131)^c

CHO-S             1.00         3         3        53         42     6

CHO-P             0.87(0.14)   2         2        73         25     3

Lec13(A)          1.70(0.04)   3         92       50         43     7

Lec13(B)          1.49(0.16)   3         91       55         40     5

Lec13(C)          1.77(0.38)   3         93       51         43     7

Lec13(D)          1.71(0.40)   3         88       51         43     7

Lec13-Avg         1.62(0.32)   12        91(2)    52(2)      42(2)  7(1)

FcγRIIA(H131)^d

CHO-S           1.00           3         3        53         42     6

CHO-P             0.87(0.07)   2         2        73         25     3

Lec13(A)          0.93(0.08)   3         92       50         43     7

Lec13(B)          0.75(0.07)   3         91       55         40     5

Lec13(C)          0.94(0.15)   3         93       51         43     7

Lec13(D)          0.91(0.07)   3         88       51         43     7

Lec13-Avg         0.88(0.12)   12        91(2)    52(2)      42(2)  7(1)

FcγRIIB^c

CHO-S             1.00         3         3        53         42     6

CHO-P             0.81(0.11)   2         2        73         25     3

Lec13(A)          2.27(0.35)   3         92       50         43     7

Lec13(B)          1.51(0.22)   3         91       55         40     5

Lec13(C)          2.07(0.33)   2         93       51         43     7

Lec13(D)          1.60(0.45)   3         88       51         43     7

Lec13-Avg         1.81(0.49)   12        91(2)    52(2)      42(2)  7(1)

FcγRIIIA(F158)^e

CHO-S             1.00             3         3        53         42     6

CHO-P             0.94(0.01)   2         2        73         25     3

Lec13(A)          27.0(2.1)    3         92       50         43     7

Lec13(B)          22.8(2.3)    3         91       55         40     5

Lec13(C)          25.1(2.4)    3         93       51         43     7

Lec13(D)          22.3(1.0)    3         88       51         43     7

Lec13-Avg         24.3(2.6)    12        91(2)    52(2)      42(2)  7(1)

HEK293-AAA        20.8(0.9)2

Lec13-AAA(A)      32.8         1         95       75         22     2

Lec13-AAA(B)      32.9(2.9)    3         92       75         22     3

Lec13-AAA(C)      34.8(3.0)    2

Lec13-AAA-Avg     33.5(2.1)    6

FcγRIIIA(F158)^f

HEK293          1.00           2

DP12            0.35(0.01)     2

Lec13           7.63(0.20)     2

FcγRIIIA(F158)^g

HEK293            1.00        3

CHO-P             0.65(0.24)  3

Lec13             1.92(0.39)  3

HEK293-AAA        1.87(0.24)  3

FcγRIIIA(F158)-转染的CHO细胞^h

CHO-S1.004

Lec13-D           15.7         2.4       4

Lec13-E           17.0         3.1       3

Lec13-F           15.8         3.2       3

Lec13-Avg         16.1         2.5       10

HEK293-AAA        10.7         1.4       3

Lec13-AAA-B       26.8         6.6       3

Lec13-AAA-C       25.9         5.9       3

Lec13-AAA-Avg     26.4         5.6       6

FcγRIIIA(V158)^e

CHO             1.00        3    3       53     42     6

DP12            0.61(0.01)  2    2       73     25     3

Lec13(A)        14.9(2.9)   3    92      50     43     7

Lec13(B)        12.5(1.3)   3    91      55     40     5

Lec13(C)        12.6(3.3)   3    93      51     43     7

Lec13(D)        14.5(1.9)   3    88      51     43     7

Lec13-AVg       13.6(2.4)   12   91(2)   52(2)  42(2)  7(1)

HEK293-AAA      9.3         1

Lec13-AAA(A)         25.4        1       95     75     22     2

Lec13-AAA(B)         23.8(1.1) 3     92      75     22     3

Lec 13-AAA(C)        22.5(0.2) 2

Lec13-AAA-AVg        23.1(1.4) 6

FcγRIIIA(V158)^f

HEK293               1.00        2

CHO-P                0.32(0.01)  2

Lec13                6.44(0.19)  2

FcγRIIIA(V158)^g

HEK293               1.00        3

CHO-P                1.00(0.13)  3

Lec13                1.18(0.10)  3

HEK293-AAA           1.15(0.05)  3

a：所有的值是A490nm测定的A(变体)/A(标准品)的比例。CHO-S代表玻璃旋转培养瓶中CHO细胞表达的IgG，CHO-P代表15cm板中CHO细胞表达的IgG，Lec13代表板上Lec13细胞表达的IgG，HEK293代表人胚胎肾293细胞表达的IgG，AAA代表Ser298Ala/Glu333Ala/Lys334Ala IgG1变体，Lec13-S代表玻璃旋转培养瓶(而不是板)中Lec13细胞表达的IgG。括号中的字母表示独立表达的IgG群。

b：Hu4D5二聚体，[mAb]＝0.12μg/ml.

c：％-Fuc是不含岩藻糖的寡糖总量的百分比，％Gal0，％Gal1，％Gal2是不含(无半乳糖基)，含一个(单半乳糖基)或二个(二半乳糖基)与末端甘露糖残基共价连接的半乳糖残基的寡糖总量的百分比。括号中的数值是四个独立表达的Lec13-Hu4D5群的均值的偏差。

d：Hu4D5二聚体，[mAb]＝3.33μg/ml

e：Hu4D5二聚体，[mAb]＝1.11μg/ml

f：Hu4D5二聚体，[mAb]＝0.12μg/ml

g：E27二聚体，[mAb]＝0.12μg/ml

h：E27六聚体，[mAb]＝0.12μg/ml

测定IgG1与FcγR和FcRn结合的实验(ELISA-形式和基于细胞的)已在(Shields等J.Biol.Chem.276：6591-6604(2001)和WO00/42072(Presta)描述。

单体Lec13-Hu4D5 IgG1与人FcγRI的结合与Hu4D5-CHO-S和CHO-P的结合等同(图4；表2)。尽管碳水化合物的存在对于FcγRI的结合是必需的(Walker等Biochem.J.259：347-353(1989))，但无论岩藻糖含量存在什么差异(Lec13对CHO)或半乳糖含量存在什么差异(CHO-P对CHO-S)，IgG1的结合是相等的这一事实显示人FcγRI对碳水化合物上这些部分的存在不敏感。已经研究了半乳糖苷化对IgG与人FcγRI的结合的影响(Wright等J.Immunol.160：3393-3402(1998)；Kumpel等Antibod bod.Hybridomas 5：143-151(1994)；和Tsuchiya等J.Rheumatol.16：285-290(1989))，数据表明如果半乳糖苷化影响与FcγRI的结合，也是非常微小的，并且是同种型(isotype)依赖的(Wright等J.Immunol.160：3393-3402(1998))。

与IgG1和人FcγRI的单体结合不同，低亲和力的人FcγR(FcγRII，FcγRIII)的结合实验需要二聚体(Hu4D5，HuE27)或六聚体(HuE27)的形成才能对结合进行检测。人FcγRIIA具有两种已知的、天然存在的同种异型，由氨基酸位置131确定(Clark等J.Immunol.143：1731-1734(1989))。人FcγRIIIA在氨基酸位置48(亮氨酸，组氨酸，或精氨酸)和位置158(缬氨酸或苯丙氨酸)上具有天然存在的同种异型；FcγRIIIA(Val158)同种异型与人IgG的反应优于FcγRIIIA(Phe158)同种异型(Shields等J.Biol.Chem.276：6591-6604(2001)；Koene等Blood 90：1109-1114(1997)；和Wu等J.Clin.Invest.100：1059-1070(1997))。

与CHO-Hu4D5(图5，6；表2)相比，Lec13-Hu4D5二聚体与人FcγRIIB和FcγRIIA的人R131多态形式的结合显示分别提高1.8-倍和1.6-倍。反之，缺乏岩藻糖不影响与人FcγRIIA H131多态形式的结合(图7；表2)。与对FcγRIIA(H131)没有作用相比，不含岩藻糖的IgG1与人FcγRIIA(R131)和FcγRIIB(均在位置131上具有精氨酸)的结合的提高程度相似，提示岩藻糖或者可与在位置131上的FcγR残基直接作用或者当精氨酸出现在位置131上时，改变IgG1构型从而对结合造成微弱的负面影响。

FcγRIIIA的多态形式均显示出与缺乏岩藻糖的IgG1的结合显著增强。二聚体Lec13-Hu4D5与FcγRIIIA(V158)的结合比CHO-Hu4D5增强14倍(图8；表2)而与FcγRIIIA(F158)的结合显示至少增强100倍(图9)。Lec13-HuE27二聚体也显示与FcγRIIIA的两种多态形式的结合增强(图10，11；表2)。

以往关于人IgG1蛋白-序列变体对与人FcγR的结合的影响的研究中，使用由三个抗-IgE E27和三个IgE组成的六聚体复合物(Shields等J.Biol.Chem.276：6591-6604(2001))；因此，这些复合物在抗-IgE E27中是三聚体。在该研究中，S298A/E333A/K334A-IgG1变体与FcγRIIIA(F158)和FcγRIIIA(V158)的结合分别增强1.5-到2-倍和1.1-倍；尽管这样的增强可能看起来极小，但对ADCC的影响是显著的(Shields等J.Biol.Chem.276：6591-6604(2001))。在目前的研究中，S298A/E333A/K334A-IgG1六聚体复合物显示与两种FcγRIIIA多态形式的结合增强，这与前述的研究数值相符(图12，13；表2)；同样Lec13-HuE27六聚体复合物(天然IgG1)显示与FcγRIIIA(F158)的结合约增强两倍(表2)。作为二聚体分析时，具有岩藻糖的S298A/E333A/K334A-IgG1变体与FcγRIIIA(V158)和FcγRIIIA(F158)的结合分别增强9-倍和20-倍；不含有岩藻糖的同样变体与所述多态形式的结合增加更多，分别是21-倍和33-倍(表2)。因此，缺乏岩藻糖不仅增加了天然IgG1与FcγRIIIA的结合，还可增强了IgG1 Fc变体的结合。因此，蛋白和碳水化合物的改变是协同的。

对于所有形式的HuE27(天然的，S298A/E333A/K334A-IgG1，Lec13-衍生的)，较大复合物(在HuE27中为三聚体)的结合的增加比作为二聚体复合物的相同mAb中所观察到的要小得多。例如，二聚体Lec13-HuE27的结合显示增强约20-倍，但对于较大复合物，只有2倍(表2)。这表明随着免疫复合物体积的增加，对亲合力的影响开始在结合中占优势。

用与γ链在CHO细胞上共表达的FcγRIIIA(Phe 158)全长α链(图28；表2)证实了岩藻糖缺陷的IgG1与FcγRIIIA的结合的增强。对于ELISA-中单独的α链融合蛋白，岩藻糖缺陷与S298A/E333A/K334A-IgG1变体是协同的。

也可评价天然和去掉岩藻糖的IgG1与小鼠FcγRII和FcγRIII的结合。人IgG1，即使是二聚体，与这些受体的结合也很差，而且在不含岩藻糖的IgG1中没有发现结合增强。另一种IgG受体，新生儿Fc受体(FcRn)，在结构上与FcγR无关(Burmeister等Nature 372：379-383(1994)；和Raghavan等Annu.Rev.Cell Dev.Biol.12：181-220(1996))，并且据称参与多种生物过程包括IgG的清除(Ghetie等Annu.Rev.Immunol.18：739-766(2000))。岩藻糖基化和非岩藻糖基化的IgG1与FcRn的结合相等(图14)。由于未糖基化的IgG1和糖基化的IgG1(无糖(aglyco)Ab结合FcRn)与该受体的结合相似，因此前述现象并不令人吃惊。

Asn29连接的碳水化合物缺乏岩藻糖导致在ELISA形式的实验中，与人FcγRIIIA(F158和V158多态形式)的结合显著增强。与FcγRIIIA增强的结合进一步由利用纯化的人PBMCs在ADCC分析中，去掉岩藻糖的IgG提高细胞毒作用的能力证实。增强的细胞毒作用在低浓度的抗体时尤其明显，表明可给予低剂量的利用ADCC的治疗性抗体产生与较高剂量的岩藻糖化IgG相同的杀细胞作用。

发现去掉岩藻糖的IgG与人FcγRIIA(R131)和FcγRIIB的结合较小程度地增强；而与人FcγRIIA(H131)的结合没有区别。前两种受体在位置131上都具有精氨酸，意味着不限于本理论的情况下，在岩藻糖化的IgG中，岩藻糖残基或可以直接(并且明显地，负性地)与FcγRII残基131反应，或可以轻微影响IgG构型，从而导致负性反应(negative interaction)。尽管去掉岩藻糖-的IgG与FcγRIIA(R131)和FcγRIIB的结合的增强在ELISA-形式的实验中较小(～2-倍)，但使用单核细胞的ADCC实验还是显示了在抗体浓度较低时细胞毒作用的增强。单核细胞表达FcγRI，FcγRIIA，FcγRIIB，而且只有单核细胞的一个亚群表达FcγRIIIA。由于岩藻糖基化的IgG和不含岩藻糖的IgG与人FcγRI的结合相同，因此ADCC的增强不太可能由于与Fcγ则不同的相互作用引起。FcγRIIA(R131/R131)和FcγRIIA(H131/H131)供体单核细胞的ADCC都显示有所增强(图21，22)，表明不限于任何理论，(1)FcγRIIA在单核细胞上的表达水平可能不够高，不能显示两种多态形式之间的差异，(2)FcγRIIB可能是优势结合FcγR(因此对R131/R131和H131/H131单核细胞的影响相等)，或(3)表达FcγRIIA的单核细胞的亚群可能导致增强的ADCC。

天然IgG上发现的碳水化合物与Lec13-产生的和CHO-产生的IgG上发现的碳水化合物相比，没有发现半乳糖基化程度有明显差异，因而该结果可完全归结于岩藻糖的存在/缺失。然而，相对于S298A/E333A/K334A IgG1变体，Lec13产生的，HEK293-产生的和DP12-产生的IgG在半乳糖基化中显示差异。但是，蛋白序列的改变和岩藻糖的缺乏相组合的结果看来确实是相加性的。

以前关于人IgG蛋白序列变体的研究发现某些Fc位置上的丙氨酸(和其它)取代会降低或增强与FcγR的结合并显示增强的ADCC(Shields等J.Biol.Chem.276(9)：6591-6604(2001))。有趣的是，一些取代不临近人IgG Fc-人FcγRIIIA复合物晶体结构的(Sondermann等Nature 406：267-273(2000))作用界面。例如，在三个用于本发明的丙氨酸取代S298A/E333A/K334A中，仅S298位于Fc-FcγRIIIA晶体结构的界面。同样的，在共结晶结构中，两条Fc重链上的岩藻糖残基均不与FcγRIIIA反应。对人和啮齿类Fc或IgG的晶体结构观察显示岩藻糖可采用不同的构型，并显示高B-因子，表明高活动性。

正常CHO和HEK293细胞将岩藻糖添加于IgG寡糖，达到较高程度(97-98％)。血清中的IgG也是高度岩藻糖基化的。

实施例2：C1q和FcRn的结合

C1q与抗体的结合是经典补体活化途径中的第一步(Makrides，S.C.Pharmacol.Rev.50：59-87(1998))。IgG上碳水化合物的性质影响与C1q的相互作用(Wright等J.Immunol.160：3393-3402(1998)；Boyd等Molec.Immunol.32：1311-1318(1995)；和Tsuchiya等J.Rheumatol.16：285-290(1989))。Hu4D5结合人C1q不如RITUXAN

，后者是抗-CD20小鼠/人嵌合IgG1(图15，16)(Idusogie等J.Immunol.164：4178-4184(2000))，而且缺乏岩藻糖不影响Hu4D5和人C1q反应的能力(图15，16)。同样的，岩藻糖的存在或缺乏不影响IgG1与FcRn的结合。

实施例3：抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)

使用人乳腺癌细胞系SK-BR-3(Hudziak等Mol.Cell Biol.9：1165-1172(1989))上的Lec13-Hu4D5IgG1评价缺乏岩藻糖对ADCC的影响。将来自两个FcγRIIIA(V158/F158)供者和两个FcγRIIIA(F158/F158)供者的PBMCs作为效应细胞，其效应细胞∶靶细胞比是30∶1。对于所有的供者，不含有岩藻糖的IgG1与含有岩藻糖的IgG1相比，其ADCC显著增强(图17-20)。值得注意的，对于所有的供者，细胞毒作用随抗体浓度的降低更加明显增强。这反映了所见到的二聚体的结合与六聚体相比增强的幅度更大，即为影响效应细胞的结合/活化，不含岩藻糖的变体需要位于靶细胞表面的mAbs更少。

人单核细胞表达FcγRI，FcγRIIA，FcγRIIB，而只有一个亚群表达FcγRIIIA。由于缺乏岩藻糖不影响与FcγRI的结合，但对与FcγRIIA(R131)和FcγRIIB的结合有较小的影响，将纯化的人单核细胞作为效应细胞，在效应细胞∶靶细胞比为20∶1，10∶1，和5∶1时进行ADCC实验。单核细胞的纯化比PBMCs的纯化更困难，因此ADCC实验也较为困难。与PBMC的ADCC相比，尽管效应看似不明显，而且单核细胞杀死靶细胞的能力也比PBMCs降低了(图21-22)，但是单核细胞ADCC还是显示了缺乏岩藻糖的IgG1具有增强的细胞毒作用。

实施例4：Fc变体抗体的ADCC活性

以下实验比较了：(1)CHO细胞中表达的Hu4D5(Hu4D5 CHO-S)，(2)Lec13细胞中表达的Hu4D5岩藻糖缺陷变体(hu4D5 Lec13)，(3)293HEK细胞中表达的Hu4D5三丙氨酸Fc区取代变体(Hu4D5HEK293-AAA)；和(4)Lec13细胞中表达的Hu4D5岩藻糖缺陷的三丙氨酸Fc区取代变体(Hu4D5-Lec13-AAA)。

ADCC方法：使用磁性珠子(Miltenyi Biotech，Auburn，CA)自两个供者的外周血中通过负选择纯化自然杀伤(NK)细胞。选择的供者是等位基因的纯合子，该等位因表达FcγR3(CD16)(F/F158)的F158形式(Shields等，J.Biol.Chem.276：6591-6604(2001))，该FcγR3表现出与IgG表型的较低的亲和力。在5℃，由1ng/ml各种抗体在实验介质(含有50∶50 Hams F12∶DMEM，其中包含1％热灭活的胎牛血清和10mM Hepes缓冲液)中调理过度表达HER2的SKBR-3乳腺癌细胞45分钟，然后在效应细胞对靶细胞比(E∶T)为10∶1到0.156的情况下，将各种浓度的NK细胞于37℃下在潮湿的CO₂孵育箱中孵育5小时。通过乳酸脱氢酶(LDH)的释放，使用商品试剂盒(RocheDiagnostics，Indianapolis，IN)可测定细胞毒作用。

NK细胞的间接免疫荧光染色法：纯化的NK细胞与2μg/ml各种Hu4D5变体在4℃的染色缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，0.1％牛血清白蛋白，0.01％叠氮钠)中共同孵育30分钟。洗涤细胞3次，并与藻红蛋白偶联的小鼠单克隆抗体抗-人CD56(Pharmingen，San Diego，CA)和特异性的FITC-F(ab’)₂山羊抗-人IgG(F(ab’)₂(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)一起于4℃下再孵育30分钟。在FACScan^TM流式细胞仪上(B.D.Biosciences，SanJose，CA)分析细胞的双色免疫荧光染色。

结论：在两个供者中(5365和7580)，当E/T比大于2时，相对于Hu4D5的Hu4D5-Lec13形式，Hu4D5的Hu4D5-Lec13-AAA形式具有增强的ADCC活性(见图26和27)，表明在岩藻糖缺陷的三丙氨酸Fc变体中，FcγRIII结合/ADCC协同增强。在表达CD56/CD16的NK细胞中的供体5365(见图24和25)中，通过NK细胞的间接免疫荧光染色证实了结合的增强。

尽管本发明的叙述与具体实施方案相关，应理解还可对本发明进行进一步修饰。本申请意在涵盖根据本发明原则进行的任何变更，使用或改写，并且包括脱离本发明但又符合本发明所属领域的已知或习惯性做法，而且其与所附权利要求范围内的、上文所述的本质特征相符合。

                 序列表

<110> 杰南技术公司(Genentech，Inc.)

<120> 糖蛋白组合物

<130> P1877R1PCT

<140> PCT/US02/33739

<141> 2002-10-22

<150> US 60/337,642

<151> 2001-10-25

<150> US 60/347,694

<151> 2002-01-09

<160> 9

<210> 1

<211> 218

<212> PRT

<213> 人(homo sapiens)

<400> 1

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

  1               5                  10                  15

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

                 20                  25                  30

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

                 35                  40                  45

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

                 50                  55                  60

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

                 65                  70                  75

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

                 80                  85                  90

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

                 95                 100                 105

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

                110                 115                 120

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

                125                 130                 135

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

                140                 145                 150

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

                155                 160                 165

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

                170                 175                 180

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

                185                 190                 195

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

                200                 205                 210

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

215

<210> 2

<211> 218

<212> PRT

<213> 人(homo sapiens)

<400> 2

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

  1               5                  10                  15

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

                 20                  25                  30

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

                 35                  40                  45

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

                 50                  55                  60

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

                 65                  70                  75

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

                 80                  85                  90

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

                 95                 100                 105

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

                110                 115                 120

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

                125                 130                 135

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

                140                 145                 150

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

                155                 160                 165

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

                170                 175                 180

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

                185                 190                 195

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

                200                 205                 210

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                215

<210> 3

<211> 217

<212> PRT

<213> 人(homo sapiens)

<400> 3

Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

  1               5                  10                  15

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

                 20                  25                  30

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe

                 35                  40                  45

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

                 50                  55                  60

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val

                 65                  70                  75

Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

                 80                  85                  90

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

                 95                 100                 105

Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

                110                 115                 120

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

                125                 130                 135

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

                140                 145                 150

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

                155                 160                 165

Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

                170                 175                 180

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

                185                 190                 195

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

                200                 205                 210

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                215

<210> 4

<211> 218

<212> PRT

<213> 人(homo sapiens)

<400> 4

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

  1               5                  10                  15

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

                 20                  25                  30

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln

                 35                  40                  45

Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

                 50                  55                  60

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

                 65                  70                  75

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

                 80                  85                  90

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

                 95                 100                 105

Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

                110                 115                 120

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

                125                 130                 135

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

                140                 145                 150

Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr

                155                 160                 165

Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

                170                 175                 180

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser

                185                 190                 195

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys

                200                 205                 210

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

                215

<210> 5

<211> 218

<212> PRT

<213> 人(homo sapiens)

<400> 5

Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

  1               5                  10                  15

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

                 20                  25                  30

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

                 35                  40                  45

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

                 50                  55                  60

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

                 65                  70                  75

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

                 80                  85                  90

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

                 95                 100                 105

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

                110                 115                 120

Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

                125                 130                 135

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

                140                 145                 150

Glu Trp Glx Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

                155                 160                 165

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg

                170                 175                 180

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

                185                 190                 195

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

                200                 205                 210

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

                215

<210> 6

<211> 215

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 6

Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro

  1               5                  10                  15

Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val

                 20                  25                  30

Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp

                 35                  40                  45

Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg

                 50                  55                  60

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro

                 65                  70                  75

Ile Met His Gln Asp Cys Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg

                 80                  85                  90

Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

                 95                 100                 105

Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro

                110                 115                 120

Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys

                125                 130                 135

Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln

                140                 145                 150

Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile

                155                 160                 165

Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val

                170                 175                 180

Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

                185                 190                 195

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser

                200                 205                 210

His Ser Pro Gly Lys

                215

<210> 7

<211> 218

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 7

Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

  1                   5              10                  15

Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val

                 20                  25                  30

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln

                 35                  40                  45

Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

                 50                  55                  60

Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser

                 65                  70                  75

Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe

                 80                  85                  90

Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg

                 95                 100                 105

Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr

                110                 115                 120

Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr

                125                 130                 135

Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val

                140                 145                 150

Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr

                155                 160                 165

Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys

                170                 175                 180

Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser

                185                 190                 195

Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys

                200                 205                 210

Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

                215

<210> 8

<211> 218

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 8

Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

  1               5                  10                  15

Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val

                 20                  25                  30

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln

                 35                  40                  45

Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

                 50                  55                  60

Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser

                 65                  70                  75

His Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe

                 80                  85                  90

Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg

                 95                 100                 105

Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr

                110                 115                 120

Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser

                125                 130                 135

Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val

                140                 145                 150

Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr

                155                 160                 165

Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys

                170                 175                 180

Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser

                185                 190                 195

Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys

                200                 205                 210

Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

                215

<210> 9

<211> 218

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 9

Pro Pro Gly Asn Ile Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

  1               5                  10                  15

Pro Lys Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val

                 20                  25                  30

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val His

                 35                  40                  45

Val Ser Trp Phe Val Asp Asn Lys Glu Val His Thr Ala Trp Thr

                 50                  55                  60

Gln Pro Arg Glu Ala Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

                 65                  70                  75

Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Arg Gly Lys Glu Phe

                 80                  85                  90

Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg

                 95                 100                 105

Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Arg Ala Gln Thr Pro Gln Val Tyr

                110                 115                 120

Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu Gln Met Ser Lys Lys Lys Val Ser

                125                 130                 135

Leu Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe Phe Ser Glu Ala Ile Ser Val

                140                 145                 150

Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gln Asp Tyr Lys Asn Thr

                155                 160                 165

Pro Pro Ile Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys

                170                 175                 180

Leu Thr Val Asp Thr Asp Ser Trp Leu Gln Gly Glu Ile Phe Thr

                185                 190                 195

Cys Ser Val Val His Glu Ala Leu His Asn His His Thr Gln Lys

                200                 205                 210

Asn Leu Ser Arg Ser Pro Gly Lys

                215

Claims (10)

1.包含人Fc区的糖蛋白，其中约51％-100％的糖蛋白包含成熟的核心碳水化合物结构，该结构缺乏岩藻糖，附着于糖蛋白的Fc区，其中Fc区包含不同于天然序列人IgG Fc区的氨基酸序列，并且与具有附着于糖蛋白Fc区的包含岩藻糖的成熟核心碳水化合物结构的糖蛋白相比，其中所述糖蛋白

(a)以更好的亲和力结合FcγRIII，或者

(b)更有效地介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。

2.根据权利要求1的糖蛋白，对其中的Fc区残基采用EU编号，该Fc区包含在氨基酸位置256，290，298，312，326，330，333，334，360，378或430中的任何一个或多个位置上的氨基酸取代。

3.根据权利要求2的糖蛋白，其中Fc区包含对位置298，333和334中的任何两个或三个残基的氨基酸取代。

4.根据权利要求3的糖蛋白，其中Fc区包含对位置298，333和334的氨基酸取代。

5.根据权利要求4的糖蛋白，其中位置298，333和334上的取代残基是丙氨酸。

6.根据权利要求1-5中任一项的糖蛋白，其中的糖蛋白包括抗体。

7.根据权利要求6的糖蛋白，其中抗体是嵌合的，人源化的或人的抗体。

8.根据权利要求7的糖蛋白，其中抗体结合选自如下的抗原：B细胞表面标志物，ErbB受体，肿瘤相关抗原或血管生成因子。

9.根据权利要求8的糖蛋白，其中抗体结合CD20，HER2，血管内皮生长因子(VEGF)，CD40，或前列腺干细胞抗原(PSCA)。

10.根据权利要求9的糖蛋白，其中抗体包括人源化抗-HER2抗体，嵌合抗-CD20抗体和人源化抗-VEGF抗体。

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