CN201765234U - 一种检测水产中孔雀石绿的免疫胶体金试剂板 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种检测水产中孔雀石绿的免疫胶体金试剂板，可用于检测水产品中的孔雀石绿。本实用新型试剂板由上下两块塑料模板和背衬组成，背衬上依次紧密粘贴着样品垫、胶金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。硝酸纤维素膜从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和质控线，可将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。该试剂板可进行半定量直观检测，整个操作过程仅需40min，且无需任何昂贵实验设备辅助，利于大规模样本筛选，适合工商部门、检验检疫机构、水产养殖场及水产品生产加工企业对水产品原料及产品中的孔雀石绿进行大规模快速检测。

Description

一种检测水产中孔雀石绿的免疫胶体金试剂板

技术领域

本实用新型属于水产中药物残留检测技术领域，具体涉及一种检测水产中孔雀石绿的免疫胶体金试剂板。

背景技术

孔雀石绿(MG)是一种三苯甲烷类染料，由苯甲醛和N，N-二甲基苯胺在盐酸或硫酸中缩合生成四甲基代二氨基三苯甲烷的隐性碱体后，在酸介质中被二氧化铅秘氧化制得。因其氯化电位势与组成酶的某些氨基酸相近，从而通过竞争作用阻碍蛋白肽的形成，可用作抗菌杀虫药。

孔雀石绿曾被广泛用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。然而孔雀石绿具有高毒素、高残留、高致癌和高致畸性。孔雀石绿进入人类或动物机体后，可以通过生物转化，还原代谢成脂溶性的隐性孔雀石绿，毒性高于孔雀石绿，严重威胁人类身体健康。同时，孔雀石绿的残留还严重影响了我国水产品的对外出口，给我国水产品出口贸易带来了巨大壁垒。

欧盟、美国已宣布禁止其在经济鱼类(观赏鱼除外)养殖过程中使用。2002年12月农业部发布第235号公告《动物性食品中兽药残留最高限量》将孔雀石绿列为禁止使用药物，在动物性食品中不得检出。

目前，水产中孔雀石绿残留常用的检测方法主要有仪器法和免疫分析法。仪器法有高效液相色谱法(HPLC)、液-质联用(LC-MS)、气-质联用法、薄层色谱法、普通分光光度法等。2005年9月我国质检总局、国家标准委共同发布实施了GB/T 19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》国家标准，要求孔雀石绿及其代谢物在水产中的检出率不得超过1克/1000吨(1ppb)。该标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐性结晶紫残留量的液相色谱-串联质谱和高效液相色谱的测定方法，液相色谱-串联质谱法检测限为0.5ppb，高效液相色谱法检测限为2ppb。仪器法特异性好、准确率高，但由于对设备、环境、操作技能等存在一定的要求，检测周期长，不利于大规模样本筛选。免疫分析法有酶联免疫吸附法(ELISA)胶体金免疫层析法(GICA)。酶联免疫吸附法检测量大，操作相对简单，但是该法同样需要实验室设备辅助，分析时间较长，具有一定局限性。

胶体金免疫层析法(GICA)是80年代继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展起来的固相标记免疫测定技术。应用层析式抗体免疫竞争原理，特异性检测样品中的有毒有害物质残留，灵敏度高，成本低，操作简便快速，无需特殊设备辅助。

国内外市场上提供检测水产中孔雀石绿药物残留的ELISA产品应用较广，灵敏度多在0.5-2ppb。而操作更简便，成本更低的GICA产品市场认知度较低，灵敏度为2ppb，远不能满足当前检测需求。因此，研制开发一种检测限符合要求，重现性好，检测时间短，适合现场快速检测，技术产品或仪器设备成本较低，运行费用低的快速检测试剂势在必行。

实用新型内容

本实用新型的目的在于针对现有检测技术的不足，提供一种灵敏度高、特异性强、操作简便快捷、不需要特殊仪器设备辅助、生产成本低的孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板。

本实用新型试剂板由塑料模板上下板、背衬及粘附在背衬上依次紧密相连的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成。其中样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻各部分间有1-2mm的重叠，其目的一方面是保证层析作用从样品垫到吸水垫部位顺利进行，另一方面是为了使样品溶液与样品垫有充分反应时间，样品垫上的缓冲体系可以中和样品溶液的酸碱度，保证样品溶液中的有效成分与胶体金结合垫上的金标抗体顺利发生反应。

胶体金结合垫上包被有抗孔雀石绿单克隆抗体与胶体金的结合物；硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有孔雀石绿-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。偶联孔雀石绿的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或者血蓝蛋白(KLH)。

本实用新型所描述的试剂板的各部分组成成分与功能如下：

塑料模板，起固定试纸条及标示功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用

背衬为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。

样品垫由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液与缓冲样品溶液pH值的作用。

胶体金结合垫由聚酯膜制成，其上标记有抗孔雀石绿单克隆抗体与胶体金的结合物，是样品溶液中的有效成分与金标抗体发生反应的场所。

硝酸纤维素膜部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。

吸水垫为滤纸，作为吸水部分其作用是将移动上来的多余的溶液吸收。

本实用新型试剂板具有如下有益效果：

(1)特异性好。本实用新型试剂板的抗孔雀石绿单克隆抗体对孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫的交叉反应率均为100％，与其他种类的抗生素包括氟喹诺酮类、氯霉素、硝基呋喃类、磺胺类药物的交叉反应率＜0.1％。

(2)灵敏度高。2002年12月农业部发布第235号公告《动物性食品中兽药残留最高限量》将孔雀石绿列为禁止使用药物，在动物性食品中不得检出。目前市面上的胶体金快速检测试剂的灵敏度普遍为2ppb。本实用新型试剂板的灵敏度可达到孔雀石绿1ppb、隐性孔雀石绿1ppb、结晶紫1ppb、隐性结晶紫1ppb。

(3)操作简便快速。本实用新型试剂板将免疫层析反应所需的大部分原料已整合到试剂条中，滴样后抗原抗体反应在固相膜上快速进行，大大缩短了检样时间，滴样后5～8分钟内即可读取结果。本实用新型试剂板的操作不需任何专业培训，普通人员均可操作，只需按说明滴样后用肉眼判读即可。

(4)不依赖于实验设备。本实用新型试剂板在直接滴样跑板后，通过肉眼判断硝酸纤维素膜上检测线和控制线的颜色深浅对比来判读结果，整个检测过程无需用到任何实验设备，真正做到了对实验设备零要求，尤其适合于野外及现场操作，易于推广。

(5)成本低，效益好。本实用新型试剂板生产工艺简单，可实现单个样本检测，生产成本低，大大降低了检测费用。

附图说明

图1为孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板结构示意图，其中1为样品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为检测线，5为控制线，6为吸水垫，7为不干胶，8为PVC板。

图2为孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板操作示意图，其中S为加样孔，C为控制区，T为检测区。

图3为孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板结果判定示意图，其中C为控制区，T为检测区。

具体实施方法

本实用新型试剂板的制备包括孔雀石绿载体蛋白偶联物的制备、抗孔雀石绿单克隆抗体的制备、胶体金溶液、胶体金标记抗孔雀石绿单克隆抗体的制备和孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板的组装。

1.孔雀石绿与载体蛋白的偶联

采用碳二亚胺法(EDC法)将孔雀石绿与载体蛋白(牛血清蛋白)偶联制备免疫抗原和包被抗原。以N、N-二甲基苯胺为原料，加入对硝基甲醛和稀盐酸，再将该溶液滴加到碱溶液中，析出的沉淀，按每100mg沉淀溶解于6mL 0.3mol/mL HCl的比例溶解，缓慢加入1％NaNO₃，冰浴搅拌。10mLPB缓冲液(0.2mol/L，pH 6.0)溶解50mg牛血清白蛋白，加入到上述溶液中，再缓慢加入2mL 0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸缓冲液，2mL二甲基甲酰胺溶剂，26mgN-羟基琥珀酰亚胺保护剂和44mg二氯乙烷溶剂，室温下反应3h。双蒸水透析5天，滤膜过滤后，收集，-20℃下冻存备用。

用卵清蛋白替代牛血清蛋白，采用同样方法制备孔雀石绿-卵清蛋白偶联物。

2.抗孔雀石绿单克隆抗体的制备

取6～8周龄雌性Balb/c小鼠，将作为免疫原的孔雀石绿-BSA偶联物与等体积的弗氏完全佐剂乳化，按100μg/只剂量皮下注射，之后每隔3周加强免疫1次，用不完全佐剂腹腔注射。融合前3d强化免疫1次，不用佐剂，剂量加倍。细胞融合按常规方法进行：将Sp2/0多发性骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1∶10的比例混合，在50％聚乙二醇作用下融合，HAT培养基悬浮，分种于96孔培养板中，37℃，5％CO₂培养箱中培养。

融合后，待细胞生长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤细胞。初筛选

7.孔雀石绿免疫胶体金快速检测试剂板检测实施操作方法

7.1样品制备

称取2g剪碎水产样本于15mL离心管中，依次加入混合提取剂和乙腈，振荡30s，加入中性氧化铝，剧烈振荡2min，室温下4000rpm离心5min，取3mL上清于新的5mL离心管中，用刻度滴管移取2mL正己烷加入到离心管中，振荡1min，室温下4000rpm离心1min，弃去上清，取2mL下层于5mL离心管中，用刻度滴管移取1mL二氯甲烷加入到离心管中，振荡1min，室温下4000rpm离心1min，弃去上层液体，取1mL下层液体于玻璃试管中，60℃下空气吹干；向吹干的试管中0.3mL磷酸缓冲液，冲洗溶解试管内壁上残留物，吸取至少100μL溶液，待检。

7.2检测步骤

在进行测试前先完整阅读使用说明书，使用前将试剂板和待检样本溶液恢复至室温(20℃～30℃)。从原包装袋中取出试剂板，水平放置于观察者正面，吸取待检样品溶液100μL于标金微孔中，用小滴管吹打完全溶解孔内红色物质，等待反应5min；吸取孔内所有溶液滴加到加样孔中，加样后开始计时；结果应在5～8min读取，其他时间判读无效。

7.3结果判断

读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面。

阴性(-)：T线显色(检测线，靠近加样孔一端)比C线(对照线)深或一样深，表示样品中孔雀石绿残留含量低于检测限或不含孔雀石绿残留。

阳性(+)：T线显色比C线浅，或T线无显色，表示样品中孔雀石绿残留含量高于检测限，T线显色比C线越浅，表示样品中孔雀石绿含量越高。

无效：未出现C线，可能是操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。

Claims (3)

1.一种检测水产中孔雀石绿的免疫胶体金试剂板，由上下两块塑料模板、背衬及粘附在背衬上依次紧密相连的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成，其特征在于样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫各部分之间有1-2mm的重叠，胶体金结合垫上包被有抗孔雀石绿单克隆抗体与胶体金的结合物，硝酸纤维素膜上从样品垫到吸水垫方向依次包被有孔雀石绿载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和质控线。

2.根据权利要求1所述的试剂板，其特征在于偶联孔雀石绿的载体蛋白可为牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)。

3.根据权利要求1所述的试剂板，其特征在于背衬为一面涂有不干胶的PVC板，样品垫由玻璃纤维制成，胶体金结合垫由聚酯膜制成，吸水垫为滤纸。

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