CN103018467B - 双酚a的胶体金检测卡及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明双酚A的胶体金检测卡及其制备方法,涉及工业化合物类环境激素检测技术领域。本发明的检测卡外壳中的试纸条,由PVC胶板、样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水棉组成;胶体金膜为含双酚A单克隆抗体的玻璃纤维素膜,包被膜是硝酸纤维素膜,其上设有T线和C线,T线包被有双酚A蛋白偶联物,C线包被有兔抗鼠IgG抗体。本发明有效用于快速检测双酚A,简单方便、快捷、结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及工业化合物类环境激素检测技术领域,特别是涉及双酚A的免疫胶体金检测卡及其制备方法。
背景技术
双酚A(Bisphenol A,缩写BPA)是已知的内分泌干扰素(环境荷尔蒙),一种重要的化工原料,工业上又叫作聚碳酸酯,主要用于生产环氧树脂、聚碳酸酯、聚砜树脂的单体;又可用作酚醛树脂、可塑性树脂的生产原料和橡胶、塑料、农药、油漆、油墨等的抗氧化剂及稳定剂;在食具、食品包装材料、塑料制品、防腐涂料、输配水及贮水材料等方面应用广泛。每年,全世界生产2700万吨含有双酚A的塑料。
双酚A会导致内分泌失调,威胁胎儿和儿童的健康,癌症和新陈代谢紊乱导致的肥胖也被认为与此有关。欧盟认为双酚A奶瓶会诱发性早熟,从2011年3月2日起,禁止生产含化学物质双酚A的婴儿奶瓶。中国也于2011年5月30日,禁止双酚A(BPA)用于婴幼儿奶瓶的生产。
双酚A与雌激素受体具有一定的亲和力,会诱导人体乳癌细胞的孕酮受体表达并刺激其增生,可能存在着抗雄激素毒性。在一定条件下会因溶出、迁移、排放及事故等原因进入水体,可影响人或动物的中枢神经系统和生殖免疫系统,降低人或动物的生殖繁衍能力,并被怀疑诱发生殖系统和心血管系统的癌变等。因此,水样中双酚A的检测技术研究具有十分重要的意义。
目前,水样中双酚A的常规检测方法主要有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱法(LC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)以及液相色谱-多级质谱联用法(LC-MS-MS)等。但这些方法所用仪器昂贵、操作复杂,样品前处理耗时长,且对操作人员的专业技能提出很高的要求。因此,建立一种具有较高灵敏度,又简便、经济、易于操作、便于现场使用的技术与方法,是极其必要的。本发明的目的是研发一种快捷简便、成本低廉、结果准确的检测方法。
发明内容
针对以上情况,为克服现有技术缺陷,本发明之目的就是提供一种双酚A的免疫胶体金检测卡及其制备方法,可有效解决、快速简便地检测出工业化合物类环境激素双酚A的问题。
本发明的双酚A胶体金检测卡,由包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了双酚A-BSA和兔抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水棉、PVC胶板(及塑料模具)等组成,在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫,中间黏贴硝酸纤维素膜,另一端粘附吸水棉。
本发明的双酚A胶体金检测卡的制备方法,是由以下步骤实现:
(1)单克隆抗体:取杂交瘤细胞株在体外常规培养、传代后,用双酚A-BSA注射BALB/C小鼠腹腔,收取腹水,以亲和层析法提纯单克隆抗体;
(2)胶体金溶液制备:取1 L 三角烧瓶1个,加入超纯水495 mL,而后加入1%氯金酸(HAuCl4·3H2O)5 mL,配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液,加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7 mL,继续搅拌加热,当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时,维持5 min后停止加热,补水至原体积,冷却至室温,2-8℃保存备用;
(3)抗体的预处理:将要标记的双酚A抗体在1000 r/min, 4℃条件下,离心20min,取上清,用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL;或者用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL,过0.22 µm滤膜;
(4)胶体金标记物的制备:取步骤(2)中的胶体金溶液40 mL,用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至 8.5,电磁搅拌器250 r/min搅拌,逐滴加入4 mL 含0.3 mg抗体蛋白的蛋白溶液,反应10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,继续搅拌反应10 min;金标抗体溶液常温低速(1500 r/min)离心20 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀;红色上清溶液4℃,12000 r/min 离心20 min,弃上清,收集沉淀,将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL,制备成双酚A单克隆抗体胶体金标记物;
(5)胶体金膜的制备:将步骤(4)双酚A单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 µL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上,室温自然晾干或者37℃烘干3 h,制成含双酚A单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜;
(6)兔抗鼠IgG抗体:用双酚A-BSA多次免疫小鼠,提取抗血清免疫兔子,纯化后得兔抗鼠IgG抗体;
(7)包被膜制备:将兔抗鼠IgG抗体、双酚A抗原稀释成1 mg/mL,用划膜仪依次以1µL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上,制备成包被膜,37℃包被2 h后,室温自然晾干或者37℃烘干;
(8)样品垫前处理:将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上,在空气湿度低于60%的条件下,室温自然晾干;
(9)检测卡的组装:PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉,组装成试纸条,切割成一定宽度的长条,再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。
所述步骤(7)中所包被的检测线T设在质控线C的下方;
所述步骤(8)中的样品垫处理液是由1 g小牛血清蛋白(BSA)和0.8 g氯化钠(NaCl),用含有0.5%TRITON-100的0.01 mol/L PBS定容至100 mL;
所述步骤(9)中的试纸条大小为3.2 mm × 60 mm 。
本发明的试纸条进行定性检测操作简单,可分批或单个样品及时检测;检测速度快,检测时间为5~10 min;易于推广使用,按说明书即可完成操作。
附图说明
图1为本发明双酚A的免疫胶体金检测卡的结构图:图中1.加样孔 2.检测线 3.质控线 4.检测孔 5.试纸条 6.检测卡外壳;
图2为本发明双酚A的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图,图中7.样品垫8.胶体金结合垫 9.PVC胶板 10.包被膜 11.吸水棉 。
具体实施方式
实施例1
图1为本发明双酚A的免疫胶体金检测卡的结构图,图2为本发明双酚A的免疫胶体金检测卡内的试纸条的剖视结构图:图中9为PVC胶板;7为样品垫;8为胶体金结合垫,该胶体金结合垫上包被了双酚A单克隆抗体胶体金标记物;10为包被膜,即硝酸纤维素膜,该硝酸纤维素膜上包被了双酚A-BSA和兔抗鼠IgG;11为吸水棉,由吸水材料如滤纸制成。
在PVC胶板9的一端上(样品端)粘附样品垫7、胶体金结合垫8,样品垫7搭接在胶体金结合垫8上。
在PVC胶板9的中间粘附包被膜10。在包被膜10上设置有兔抗鼠IgG质控线3和双酚A-BSA检测线2。
在PVC胶板9的另一端粘附吸水棉11。包被膜10的一端与胶体金结合垫8略交叉,另一端与吸水棉11略交叉。该试纸条5可装入有塑料模具制成的检测卡外壳6中,制成检测卡,在检测卡外壳6的上盖上设有加样孔1和检测孔4,样品垫7正对加样孔1,包被膜10正对检测孔4。
实施例2
双酚A胶体金检测卡制备,是由以下步骤具体实现:
1、单克隆抗体:取杂交瘤细胞株在体外常规培养、传代后,用双酚A-BSA注射BALB/C小鼠腹腔,收取腹水,以亲和层析法提纯单克隆抗体;
2、胶体金溶液制备:取1 L 三角烧瓶1个,加入超纯水495 mL,而后加入1%氯金酸(HAuCl4·3H2O)5 mL,配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液,加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液5-7 mL,继续搅拌加热,当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时,维持5 min后停止加热,补水至原体积,冷却至室温,2-8℃保存备用;
3、抗体的预处理:将要标记的双酚A抗体在1000 r/min, 4℃条件下,离心20 min,取上清,用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL;或者用0.01 mol/L PBS 稀释成1 mg/ml,过0.22 µm滤膜;
4、胶体金标记物的制备:取步骤(2)中的胶体金溶液40 mL,用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至 8.5,电磁搅拌器250 r/min搅拌,逐滴加入4 mL含0.3 mg抗体蛋白的蛋白溶液,反应10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,继续搅拌反应10 min;金标抗体溶液常温低速(1500 r/min)离心20 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀;红色上清溶液4℃,12000r/min 离心20 min,弃上清,收集沉淀,将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL,制备成双酚A单克隆抗体胶体金标记物;
5、胶体金膜的制备:将步骤(4)双酚A单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 µL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上,室温自然晾干或者37℃烘干3 h,制成含双酚A蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜;
6、兔抗鼠IgG抗体:用双酚A-BSA多次免疫小鼠,提取抗血清免疫兔子,纯化后得兔抗鼠IgG抗体;
7、包被膜制备:将兔抗鼠IgG抗体、双酚A抗原稀释成1 mg/mL,用划膜仪依次以1 µL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上,制备成包被膜,37℃包被2 h后,室温自然晾干或者37℃烘干;
8、样品垫前处理:将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上,在空气湿度低于60%的条件下,室温自然晾干;
9、检测卡的组装:PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉,组装成试纸条,切割成一定宽度的长条,再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。
实施例3
最低检出限量试验
双酚A最低检出限量试验
准确称量0.500 g双酚A标准品溶于超纯水并定容至100 mL,标为A1溶液,取A1溶液1 mL于容量瓶加超纯水并定容至1000 mL,形成A2溶液,取A2溶液1 mL于容量瓶加超纯水并定容至1000 mL,形成A3溶液,则A3溶液的浓度为5 ng/mL(5ppb)。取A3溶液1 mL于4支试管中,并分别标号1~4,往试管中分别加入9 mL、4 mL、1 mL、0 mL超纯水,配成双酚A标准品溶液浓度分别是:0.5 ng/mL、1 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL;另取一支空试管,加入5 mL超纯水,标为5号试管。取上述1~5号试管中液体作为样品滴加到双酚A检测卡上,加样后5 min观察结果,检测线2和质控线3的显色结果见表1。
表1 双酚A最低检出限量试验
经多次检验,双酚A的检出率达99%,最低检出限量为5 ng/mL。
Claims (1)
1.双酚A胶体金检测卡的制备方法,其特征在于由包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了双酚A-BSA和兔抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水棉、PVC胶板及塑料模具组成,在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫,中间黏贴硝酸纤维素膜,另一端粘附吸水棉;由以下步骤实现:
(1)单克隆抗体:取杂交瘤细胞株在体外常规培养、传代后,用双酚A-BSA注射BALB/C小鼠腹腔,收取腹水,以亲和层析法提纯单克隆抗体;
(2)胶体金溶液制备:取1 L 三角烧瓶1个,加入超纯水495 mL,而后加入质量浓度1%氯金酸5 mL,配制成500 mL质量浓度0.01%氯金酸水溶液,加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入质量浓度1%柠檬酸三钠溶液5-7 mL,继续搅拌加热,当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时,维持5 min后停止加热,补水至原体积,冷却至室温,2-8℃保存备用;
(3)抗体的预处理:将要标记的双酚A抗体在1000 r/min, 4℃条件下,离心20 min,取上清,用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL,过0.22 µm滤膜;
(4)胶体金标记物的制备:取步骤(2)中的胶体金溶液40 mL,用0.25 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH至 8.5,电磁搅拌器250 r/min搅拌,逐滴加入4 mL含0.3 mg 抗体蛋白的蛋白溶液,反应10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA,继续搅拌反应10 min;金标抗体溶液常温1500 r/min离心20 min,弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀;红色上清溶液4℃,12000 r/min离心20 min,弃上清,收集沉淀,将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL,制备成双酚A单克隆抗体胶体金标记物;
(5)胶体金膜的制备:将步骤(4)双酚A单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 µL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上,室温自然晾干或者37℃烘干3 h,制成含双酚A单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜;
(6)兔抗鼠IgG抗体:用双酚A-BSA多次免疫小鼠,提取抗血清免疫兔子,纯化后得兔抗鼠IgG抗体;
(7)包被膜制备:将兔抗鼠IgG抗体、双酚A抗原稀释成1 mg/mL,用划膜仪依次以1 µL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上,制备成包被膜,37℃包被2 h后,室温自然晾干或者37℃烘干;
(8)样品垫前处理:将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上,在空气湿度低于60%的条件下,室温自然晾干;
(9)检测卡的组装:PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水棉,组装成试纸条,切割成一定宽度的长条,再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中;
所述步骤(7)中所包被的检测线T设在质控线C的下方;
所述步骤(8)中的样品垫处理液是由1 g小牛血清蛋白和0.8 g氯化钠,用含有质量浓度0.5%TRITON-100的0.01 mol/L PBS定容至100 mL;所述步骤(9)中的试纸条大小为3.2mm × 60 mm 。
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