CN1438485A

CN1438485A - 适用于毒死蜱残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒

Info

Publication number: CN1438485A
Application number: CN 03114892
Authority: CN
Inventors: 朱国念; 吴刚; 杨挺; 魏方林; 程敬丽; 吴慧明
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2003-01-13
Filing date: 2003-01-13
Publication date: 2003-08-27

Abstract

本发明公开了一种适用于毒死蜱残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，它包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔酶标板/试管及设在盒体内的试剂。其特征在于，在酶标板的每孔内，由包被液包被能与抗毒死蜱抗体特异性结合反应的包被抗原，并用1.0～3.0％脱脂奶粉进行封闭，盒内试剂包含洗涤液、底物稀释液、毒死蜱标准溶液、抗毒死蜱抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体或者辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱兔抗体、底物、显色物质和反应终止液。本发明的优点是能用于水样、土壤、蔬菜等食品中及中毒样品中毒死蜱残留的快速检测，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测批量的样品，样品检测成本远低于传统的检测方法。

Description

适用于毒死蜱残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒

技术领域

本发明涉及一种适用于毒死蜱残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，主要适用于用该试剂盒快速测定批量的水样、土壤等环境样品和中毒样品及蔬菜等食品样品中的毒死蜱残留。

背景技术

农药及其代谢物传统的残留分析方法主要是依靠气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)等物理化学分析手段，但由于农药使用规模不断扩大，农药残留造成环境影响和人类健康的慢性和长期效应日益受到人们关注和担忧，对农药残留的限制也越来越严格，对分析测定对象、种类、数量、范围、指标等诸方面都提出了新的要求和更高的标准，但传统的理化分析方法通常繁琐复杂，样品前处理过程复杂，工作量大，仪器昂贵，并要求有熟练的技术人员及较长的分析周期。因此人们迫切希望有一种简单，快速，灵敏及廉价的检测技术能在野外和实验室内进行大批量的筛选试验。免疫分析法正具备这些优点，所以尽管免疫分析用于农药残留分析的时间很短，但已很快用于环境样品和食品中农药残留的分析。

毒死蜱[chlorpyrifos，O，O-二乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫逐磷酸酯]，商品名为毒死蜱，乐斯本等，1965年由Dow Chemical Company推广使用的一种高效杀虫剂，在世界范围内应用于粮食、蔬菜、水果及经济作物的害虫防治。它对哺乳动物毒性中等，但对非靶标水生生物毒性较高。由于毒死蜱广泛地应用于农业生产上，在粮食等作物上引起的残留问题已有所报道。而且，环境样品中发现毒死蜱残留的情况也日趋严重，对人们的健康构成了潜在的威胁。因此，随着人们对毒死蜱残留的毒性与环境风险的日益关注，急需更科学、快捷和高效的检测手段。开发一种简单快速，适用于农药残留现场监控的痕量分析方法具有重要的现实意义。

检测毒死蜱残留量常规方法为气相色谱法等。然而该方法的灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响很大，再者该方法需要昂贵的仪器，且过程繁琐，不适合批量样品的检测与分析。免疫分析为毒死蜱的残留检测提供了一个新的分析检测途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单快速，并能用于大批量样品快速检测的酶联免疫吸附测定试剂盒。它包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔酶标板和设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每孔内，由包被液包被能与抗毒死蜱抗体特异性结合反应的包被抗原，并用1.0～3.0％脱脂奶粉进行封闭，盒内试剂包含洗涤液、底物稀释液、毒死蜱标准溶液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体或者辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱兔抗体、底物、显色物质和反应终止液。

本发明的优点是能用于水样、土壤、中毒样品、蔬菜等食品中毒死蜱残留的检测，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测批量的样品，样品检测成本远低于传统的检测方法。试剂盒采用强特异性、高效价的抗体，提高检测的灵敏度、准确度、精密度。试剂盒的保存期超过6个月。本发明简单快速，适用于农药残留现场监控的痕量分析方法具有重要的现实意义。

附图说明

图1是直接竞争ELISA法毒死蜱标准曲线；

图2是间接竞争ELISA法毒死蜱标准曲线。

具体实施方式

本发明是一种适用于毒死蜱残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，它基于免疫反应和酶促反应，能够检测水、土壤、蔬菜、中毒样品中毒死蜱的残留。一种适用于毒死蜱残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，它包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔酶标板/试管和设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每孔内，由包被液包被能与抗毒死蜱抗体特异性结合反应的包被抗原，并用1.0～3.0％脱脂奶粉进行封闭，盒内试剂包含洗涤液(稀释液)、底物稀释液、毒死蜱标准溶液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(适用于间接竞争ELISA法)、辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱兔抗体(适用于直接竞争ELISA法)、30％过氧化氢或0.75％的过氧化氢尿素、显色物质和反应终止液，其中：(1)包被抗原(AR-OVA或PO-OVA)用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(含1～2g碳酸钠和2～4g碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成0.5～4μg/mL，(2)洗涤液(稀释液)一瓶，40～80mL/瓶，内含有氯化钠7～9g、磷酸二氢钾0.1～0.3g、磷酸氢二钠2～4g、氯化钾0.1～0.3g、吐温-20 0.5～3mL、双蒸水，为正常使用的15～30倍浓缩液；(3)底物稀释液一瓶，30～50mL/瓶，配制如下：柠檬酸3～6g，磷酸氢二钠1～3g，双蒸水，为正常使用的5～10倍浓缩液；(4)酶底物为30％过氧化氢或0.75％的过氧化氢尿素，10～15mL/瓶；(5)显色物质为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液，10～15mL/瓶或者邻苯二胺固体粉末4～6瓶，10～20mg/瓶；(6)辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱兔抗体或者辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体各一瓶，200～400μL/瓶，为正常使用800～1500倍浓缩液；(7)反应终止液一瓶，30～50mL/瓶，为2mol/L硫酸；(8)毒死蜱不同浓度系列(0.1、0.5、2、10、50、100mg/L)标准液6瓶，1～4mL/瓶，甲醇定容，使用时用PBST稀释。该试剂盒的特异性好，抗AR-BSA抗体对各类似物的交叉反应率均小于10.00％(甲基毒死蜱除外)，可知该抗体的特异性较好。该抗体对硫代磷酸酯类有机磷农药交叉反应率：甲基毒死蜱为18.3％，皮蝇磷为3.8％，溴硫磷为1.4％，毒壤磷为1.3％，除线磷为0.67％对硫磷为0.16％，三氯吡啶醇为1.5％。抗PO-BSA抗体对硫代磷酸酯类有机磷农药交叉反应率：甲基毒死蜱为6.52％，皮蝇磷为4.6％，溴硫磷为4.4％，毒壤磷为5.3％，三氯吡啶醇＜0.01％。

直接竞争ELISA法的最低检测限为3ug/L，线性检测范围为3～60ug/L，样品检测的批内、批间、整体变异系数均低于8.00％之间，回收率均高于89.62％；间接竞争ELISA法的最低检测限为0.1ug/L，线性检测范围为0.1～50ug/L，样品检测的批内、批间、整体变异系数均低于8.0％，水、土壤、蔬菜回收率均高于90％，中毒样品(定性分析)的回收率高于60.25％。试剂盒在4℃或20℃下至少可保存6个月以上。

实施例1

其测定原理是，首先将农药分子与大分子载体(如蛋白质)偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体上，然后加入待测农药和酶标抗体，固相抗原上的农药，待测农药与酶标抗体进行竞争反应，待测农药含量多，则被结合在固相抗原上的酶标抗体少，反之结合在固相抗原的酶标抗体多，反应后加入底物进行显色加以测定，当酶标抗体量一定时，加入的待测农药量越多，与固相抗原结合的酶标抗体就越少，发色反应减弱，抑制率增高，反之，则发色反应增强，抑制率减低，因而根据已知量农药的标准线和待检样品的抑制率，再根据抑制率与农药浓度之间的半对数关系作图即得标准曲线，并推算出待测农药的浓度。

实施例2

酶标抗体的制备(采用改良过碘酸钠法)

具体操作如下：称5～10mgHRP溶解于1mL蒸馏水中，于上液中加入0.2～0.4mL新配的0.1mol/L NaIO₄溶液，室温下避光搅拌15～30分钟。将上述溶液装入透析袋中，用1mmol/L pH4.4的醋酸盐缓冲液透析，4℃过夜。加20～40μl0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入1～2ml含有10～20mg纯化抗体的0.01mol/L碳酸盐缓冲液，室温避光轻轻搅拌2～3小时。加0.1～0.2mL新配的4mg/mLNaBH₄液，混匀，再置4℃2～3小时。将反应液装入透析袋中，用0.15mol/LpH7.4 PBS透析，4℃过夜。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃1～2小时。3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵溶液洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mol/L pH7.4的PBS中。将上述溶液装入透析袋中，对0.15～0.2mol/L pH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000～12,000rpm离心30分钟，上清液即为酶结合物，用等量甘油分装后，分别于-4℃、-20℃保存。经直接ELISA法(E-Ab法)测定，效价为4000。

实施例3

包被酶标板的制备

包被抗原(AR-OVA或PO-OVA)用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液(含1～2g碳酸钠和2～4g碳酸氢钠，双蒸水1L)稀释成0.1～4μg/mL，在酶标板的每孔加100μL，4℃下包被过夜或37℃包被2h，倾去包被液，用PBST洗涤3次，拍干，然后在每孔中加入150μL1.0～3.0％脱脂奶粉，放入37℃温箱中0.4～1小时后用PBST洗涤3次，拍干后干燥保存。

实施例4

检测样品的前处理：

水样：过滤后即可取样进行ELISA分析。

土样：取10g土壤用20～40mL丙酮提取三次，合并提取液，浓缩，然后用PBST稀释定容至10mL，进行ELISA分析。

蔬菜样品：取蔬菜样品用粉碎机绞碎后称取10g，20～40mL丙酮提取三次，合并提取液，浓缩，用PBST定容至10mL，取样进行ELISA分析。

血液：取人体血液，加抗凝素后直接用ELISA法进行分析。

洗胃液(2％碳酸氢钠溶液)：取10mL洗胃液，用稀HCl调pH值到中性后即可用ELISA法进行分析。

呕吐物：取样品研碎，离心取上清用ELISA法进行分析。

实施例5

试剂盒操作过程如下：

1)直接竞争ELISA法：取出一块包被有毒死蜱包被抗原酶标板，恢复到室温后备用；加入50μL标样或处理好的样品到各自孔中，标样和样品做2～4个重复；加入50μL稀释的酶标抗体，37℃孵育1～2小时；倒出孔中的液体，将微孔板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，用200μL稀释好的PBST洗2～6次，拍干；然后每孔加入100μL底物液与显色物质的混和液，轻微振匀，并在37℃暗处孵育15～25分钟；加入50μL反应终止液，混合好后，测定OD_450nm值或者OD_490nm值。

2)间接竞争ELISA法：取出一块包被有毒死蜱包被抗原酶标板，恢复到室温后备用；加入50μL标样或处理好的样品到各自孔中，标样和样品做2～4个重复；加入50μL稀释的抗体，37℃孵育1～2小时；倒出孔中的液体，将微孔板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，用200μL稀释好的PBST洗2～6次；加入100μL稀释好酶标二抗，37℃孵育1～2小时；倒出孔中的液体，将微孔板倒置在吸水纸上拍打，以保证完全除去孔中的液体，用200μL稀释好的PBST洗2～6次；然后每孔加入100μL底物液与显色物质的混和液，轻微振匀，并在37℃暗处孵育15～25分钟；加入50μL反应终止液，混合好后，测定OD_450nm值或者OD_490nm值。

以所获得的标样和样品吸光值的平均值计算各孔的吸光值的结合率

OD_max为不加药时的吸光值，OD_x为农药x时的吸光值，OD_min为空白对照孔的吸光值。

计算的标样值绘成为一个对应毒死蜱浓度(ug/L)的半对数坐标系统曲线图，直接竞争ELISA法的校正曲线在3～60ug/L范围内为线性；间接竞争ELISA法的校正曲线在0.1～50ug/L范围内为线性，对应样品浓度可从校正曲线读出，也可根据标样的浓度与结合率求出线性方程，然后求出对应样品的浓度。

实施例6保存期试验

将试剂盒放置于4℃和-20℃保存，分别取0，10，20，30，60，90，120，150和180d的试剂盒，以最佳抗体抗原工作浓度为测定浓度，进行标准样品检测以测定其检测效果。保存期测定结果如下表：

表1.直接竞争ELISA法试剂盒保存期试验结果

Table 1.The Validity of the Direct ELISA kits

时间(d)	0	10	20	30	60	90	120	150	180
时间(d)	0	10	20	30	60	90	120	150	180	OD_450nm(4℃)	1.076	1.074	1.075	1.072	1.071	1.069	1.065	1.056	1.045
OD_450nm(20℃)	1.076	1.075	1.074	1.077	1.075	1.073	1.075	1.072	1.070	OD_450nm(4℃)	1.076	1.074	1.075	1.072	1.071	1.069	1.065	1.056	1.045

表2.间接竞争ELISA法试剂盒保存期试验结果

Table 2.The Validity of the Indirect ELISA kits

时间(d)	0	10	20	30	60	90	120	150	180
时间(d)	0	10	20	30	60	90	120	150	180	OD_450nm(4℃)	1.141	1.141	1.139	1.138	1.139	1.136	1.133	1.126	1.121
OD_450nm(20℃)	1.140	1.142	1.140	1.140	1.140	1.141	1.139	1.140	1.138	OD_450nm(4℃)	1.141	1.141	1.139	1.138	1.139	1.136	1.133	1.126	1.121

以上结果可以看出，试剂盒在4℃下至少可保存6个月以上。

实施例7

试剂盒灵敏度测定

将毒死蜱标准溶液稀释成系列浓度，用直接ELISA法分析分别得到以下曲线(图1)，由图可得，直接ELISA法为：y＝-0.8867x+77.486，毒死蜱在3～60ug/L范围内，Logit(B/B0)与毒死蜱浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r²＝0.8758，检出限为3ug/L。用间接ELISA法分析分别得到以下曲线(图2)，由图可得，间接ELISA法为：y＝-0.738x+56.472，毒死蜱在0.1～50ug/L范围内，Logit(B/B₀)与毒死蜱浓度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r²＝0.7852，检出限为0.1ug/L。

实施例8

准确度试验精密度试验

取三个浓度的毒死蜱标样，添加到样品中，每个浓度设6个重复，进行测定。试剂盒回收率的结果如下，水为97.30％～112.24％，土壤为90.97％～97.92％，蔬菜为90.24％～96.24％，中毒样品(定性检验)为57.78％～95.14％。水样的变异系数均低于8％，土壤的变异系数均低于7％，蔬菜的变异系数均低于8％，中毒样品的变异系数均低于为8％。

实施例9

试剂盒特异性试验

选择毒死蜱的类似物如甲基毒死蜱、二嗪农、甲基对硫磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、对硫磷，反应步骤同试剂盒操作，得到各种农药抑制中浓度。再用下式计算农药对甲胺磷的交叉反应性。交叉反应率愈小，反应的特异性愈强。交叉反应率愈大，交叉反应率可按下式计算，

本试验测定结果见表3。从表3可以知道，直接ELISA法抑制率达50％时，毒死蜱所需浓度为15ug/L，其它几种有机磷类农药所需浓度为36ug/L。说明该试剂盒的特异性好，可保证对样品中甲胺磷残留测定结果的可靠性。

表3.试剂盒特异性试验

Table3.Recognition of Several Compounds by ELISA kits

化合物名称	抑制中浓度(ug/L)	交叉反应百分率(％)
化合物名称	抑制中浓度(ug/L)	交叉反应百分率(％)	毒死蜱	15	/
甲基毒死蜱	230	6.52	毒死蜱	15	/
甲基毒死蜱	230	6.52	三氯吡啶醇	＜150000	＜0.01
甲基对硫磷	10000	0.15	三氯吡啶醇	＜150000	＜0.01
甲基对硫磷	10000	0.15	杀螟硫磷	4410	0.34
马拉硫磷	＞10000	＜0.15	杀螟硫磷	4410	0.34
马拉硫磷	＞10000	＜0.15	对硫磷	1430	1.05

Claims

1.一种适用于毒死蜱残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，它包括盒体、设在盒体内的96孔/40孔酶标板/试管和设在盒体内的试剂，其特征在于，在酶标板的每孔内，由包被液包被能与抗毒死蜱抗体特异性结合反应的包被抗原，并用1.0～3.0％脱脂奶粉进行封闭，盒内试剂包含洗涤液、底物稀释液、毒死蜱标准溶液、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体或者辣根过氧化物酶标记抗毒死蜱兔抗体、底物、显色物质和反应终止液。

2.根据权利要求1所述的一种适用于毒死蜱残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的包被抗原为O，O-二乙基-O-[3，5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯或者O-乙基-O-[3，5，6-三氯-(2-吡啶基)]-O-(3-羧丙基)硫逐磷酸酯与卵清蛋白的复合物。

3.根据权利要求1所述的一种适用于毒死蜱残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的洗涤液内含有氯化钠7～9g、磷酸二氢钾0.1～0.3g、磷酸氢二钠2～4g、氯化钾0.1～0.3g、吐温-20 0.5～3mL、双蒸水。

4.根据权利要求1所述的一种适用于毒死蜱残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的底物稀释液内含有柠檬酸3～6g，磷酸氢二钠1～3g，双蒸水。

5.根据权利要求1所述的一种适用于毒死蜱残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的底物为过氧化氢或者过氧化尿素。

6.根据权利要求1所述的一种适用于毒死蜱残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的显色物质为四甲基联苯胺或者邻苯二胺。

7.根据权利要求1所述的一种适用于毒死蜱残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的反应终止液为硫酸或盐酸。

8.根据权利要求1所述的一种适用于毒死蜱残留分析的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于所说的碳酸盐缓冲溶液，含1～2g碳酸钠和2～4g碳酸氢钠，双蒸水1L。