CN1687781A - 一种2，4－d残留的酶联免疫吸附分析试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种2，4－D残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，属于酶免疫分析技术领域。本发明克服了2，4－D理化分析方法操作复杂、检测成本高及速度慢等缺点，能准确快速地检测水和土壤等样品中2，4－D残留。检测过程中，酶标板孔壁上吸附的包被抗原和待测2，4－D相互竞争与溶液中的抗体反应，竞争结果通过酶催化反应显色显示出来。通过检测已知浓度的2，4－D并绘制标准曲线，可以推算出待测2，4－D的浓度。试剂盒的保存期超过6个月。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种2，4-D残留的酶联免疫吸附分析(ELISA)试剂盒，主要适用于大批量水和土壤等样品中2，4-D残留的快速测定。属于酶免疫分析技术领域。
二、背景技术
2，4-D是一种有机氯除草剂，过去主要用于禾谷类作物，特别是麦田和玉米中防除一年生及多年生莎草和双子叶杂草。2，4-D在环境中的残留期长，据报道，2，4-D是一种潜在的致癌物，并且由于它的广泛使用，已造成了我国地下水和饮用水的污染。
除草剂2，4-D残留常规的分析主要是应用气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)等仪器在实验室进行。应用这些理化分析技术对环境、生物、食品等样品中痕量2，4-D残留进行分析，不仪仪器化程度要求较高，并且需要经过繁复的分离、提取、净化、衍生等前处理过程，分析速度慢、成本高，前处理过程需要使用大量的有机溶剂，又造成了二次污染。随着待检样品、特别是要求现场快速检测样品量的迅速增加，传统的农药残留分析手段难以适应要求，因此，迫切需要开发和应用高效率农药残留快速分析技术。
酶联免疫吸附分析方法特异性强、灵敏度高而且简便快速，可以弥补色谱分析方法的缺陷，本发明对解决大批量样品的2，4-D残留现场监控技术具有重要的现实意义。
三、发明内容
为了解决目前农药残留仪器分析方法成本高、操作复杂、特异性差、灵敏度低和检测结果不稳定等缺点，本发明提供了一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单，并能用于大批量样品快速检测的2，4-D残留的酶联免疫吸附分析试剂盒。
2，4-D残留的酶联免疫吸附分析试剂盒包括盒体、设在盒体内的96孔酶标板、海绵支架和支架内包含有浓缩洗涤液(PBST)、不同浓度的2，4-D标准液、抗2，4-D多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、A液、B液和反应终止液。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：首先利用活性酯法将2，4-D与牛血清白蛋白偶联后制备人工免疫原，用该免疫原免疫新西兰大耳白兔制备出2，4-D多克隆抗体。再用混合酸酐法将2，4-D与卵清蛋白偶联，它们的复合物作为包被抗原被固定于酶标板孔壁上。预先将待测2，4-D样品和多克隆抗体混合反应30分钟，再将反应后的抗原抗体加入到酶标板孔中，固相包被抗原和待测2，4-D相互竞争与抗体反应，由于每个孔中的固相抗原含量和加入的抗体含量均一致，所以当待测的2，4-D浓度高时，被结合在固相抗原上的抗体(一抗)量就少，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体(二抗)后，二抗与一抗的结合量少，最后加入底物液(A液)和显色液(B液)，显色反应浅(OD值低)，表明抑制率高；反之，当待测2，4-D浓度低时，则所测的OD值高，抑制率低。用已知的2，4-D浓度检测并绘制标准曲线，可以推算出待测2，4-D的浓度。
本发明的优点是能准确灵敏地检测水和土壤中2，4-D残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。试剂盒的保存期至少6个月。
四、附图说明
附图为2，4-D的标准抑制曲线，曲线的回归方程为y＝-0.2015x+0.4676(R2＝0.9757，IO＝0＝0.69μg/mL，IC20＝0.02μg/mL。
五、具体实施方式
试剂盒操作及结果计算：待测样品经前处理后，用PBST定容备用。拆开真空包装袋并取出酶际板，在室温下平衡5分钟备用。将相同浓度的抗体分别与不同浓度(0μg/mL，0.01μg/mL，0.05μg/mL，0.1μg/mL，1μg/mL，10μg/mL，100μg/mL)的2，4-D标准液或待测2，4-D液混合，37℃孵育30分钟；然后将100μL此反应混合溶液移入酶标板中，37℃孵育30分钟；倒出孔中的液体，用稀释好的PBST洗2～6次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入按1∶1000稀释好的酶标羊抗兔二抗100μL，37℃孵育30分钟；倒出孔中的液体，用PBST洗板2～6次，拍干；取A液和B液等体积混匀，每孔加100μL，在暗处显色10～15分钟，每孔加入50μl的终止液终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为450nm处的OD值。
将含0μg/mL标准品孔的OD值减去含最大浓度标准品孔的OD值定为B0，其余孔经同样方法校正后的OD值定为B；以B/B0值为纵坐标，相应标准品浓度的对数值(logC)为横坐标，绘制2，4-D标准抑制曲线。根据曲线的回归方程可以推算出对应样品的浓度，也可以推算出IC50(B/B0＝50％)及最小检测限IC20(B/B0＝80％)，其中IC50为抑制50％抗原抗体反应所需2，4-D浓度，IC20为抑制20％抗原抗体反应所需2，4-D浓度。
实施例1
2，4-D与载体蛋白偶联：
(1)活性酯法偶联2，4-D与牛血清白蛋白(BSA)
称42mg 0.19mmol)2，4-D和22mg(0.19mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于2mL无水二氧杂环己烷，缓慢滴加N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)溶液(39mg溶于0.5mL二氧杂环己烷)，室温搅拌反应18小时，离心，取上清液。将30mgBSA溶于2mL 0.1mol/L pH9.1的硼酸缓冲溶液中，逐滴加入200μL上清液，室温搅拌反应4小时。反应液装入透析袋对0.01mol/L pH7.4的PB透析。每6小时换液一次，总共换液5～6次。透析后离心，上清液冷冻干燥，4℃保存。
(2)混合酸酐法偶联2，4-D与卵清白蛋白(OVA)
称30mg 2，4-D(约18μmol)溶于200μL无水二甲基甲酰胺(DMF)中，然后按顺序加入4.27μL(约18μmol)三正丁胺、2.34μL(约18μmol)氯甲酸异丁酯，室温搅拌反应1小时。称30mg OVA溶于2mL0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲溶液中，返滴加入100μL上一步反应液，室温搅拌反应3小时，然后将反应液透析、离心、冷冻干燥，4℃保存。
实施例2
2，4-D多克隆抗体制备：
将2，4-D与BSA的偶联物作免疫原，称2mg免疫原溶于1mL无菌生理盐水中，与1mL完全弗氏佐剂混合，充分乳化后注射新西兰大耳白兔大腿，以后每隔两周加强免疫一次，换用不完全弗氏佐剂与免疫原混合，免疫部位为颈背部皮下，从第三次免疫开始，每次免疫后一周从兔耳静脉采血检测血清效价。总共免疫5次，最后一次免疫后一周从兔颈动脉采全血，先用35％的饱和硫酸铵盐析法粗提兔抗血清，再用DE-52阴离子交换层析法进一步纯化，获得较纯的2，4-D多克隆抗体。
实施例3
保存期实验：
将试剂盒放置于4℃保存，分别取0、10、20、30、60、90、120、150和180d的试剂盒，以最佳抗体抗原工作浓度为测定浓度，进行标准样品检测以测定其检测效果。保存期测定结果如下表：
表1 试剂盒保存实验结果
| 时间(d) | 0 | 10 | 20 | 30 | 60 | 90 | 120 | 150 | 180 |
| B0(450nm) | 0.94 | 1.02 | 1.03 | 0.95 | 0.92 | 1.04 | 0.94 | 0.98 | 0.91 |
| IC50(μg/mL) | 0.68 | 0.71 | 0.72 | 0.68 | 0.70 | 0.67 | 0.70 | 0.69 | 0.67 |
从以上结果可以看出，IC50变化不大，试剂盒在4℃下至少可保存6个月以上。
实施例4
试剂盒特异性实验
选择2，4-D的结构类似物作为待测物，测得各物质的抑制中浓度(IC50)，再用下式计算抗体对这些物质的交叉反应性；交叉反应率愈小，则抗体对2，4-D的特异性愈强，反之则抗体的特异性差。
交叉反应(CR％)＝IC50(2，4-D)/IC50(供试物)×100％。
实验测定结果见表2，采用间接ELISA法，多克隆抗体与2甲4氯的交叉反应是8.5％。与2，4-滴丁酯、2，4-二氯苯甲醛和2，4-二氯苯甲酸的交叉反应均小于1％。2甲4氯也是一种除草剂，它和2，4-D一般不会同时存在于样品中，所以不会影响该试剂盒对2，4-D的检测。
表2 交叉反应
| 化合物名称 | IC50(μg/mL) | 交叉反应(％) |
| 2，4-D2甲4氯2，4-滴丁酯2，4-二氯苯甲醛2，4-二氯苯甲酸 | 0.698.12＞100＞100＞100 | 1008.5＜1＜1＜1 |
实施例5
添加回收实验
取适量2，4-D标样添加到样品中，设置0.5mg/kg，1mg/kg和5mg/kg三个浓度，每个浓度设6个重复，进行测定。
ELISA检测样品的前处理：
水样：加入EDTA过滤后即可取样进行ELISA分析。
土样：取10g土壤用20～40mL甲醇提取三次，合并提取液，浓缩，然后用PBST稀释定容至10mL，进行ELISA分析。
试剂盒的检测结果见表3，水样回收率为82～106％，变异系数5.6～11.2％，土壤样品回收率为94～104％，变异系数6.6～7.8％。试剂盒的回收率在允许范围内，符合农药残留分析对精确度的要求。
表3 试剂盒添加回收测定结果
| 样品 | 添加2，4-D浓度(ppm) | ELISA测定平均值(ppm)n＝6 | 回收率(％) | 变异系数(％) |
| 水样 | 0.515 | 0.41±0.0460.93±0.0885.28±0.296 | 8293106 | 11.29.55.6 |
| 土壤 | 0.515 | 0.52±0.0400.94±0.0624.82±0.348 | 1049496.4 | 7.86.67.2 |
Claims (9)
1.一种2，4-D残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于由盒体、可拆卸96孔酶标板、海绵支架和支架内包含有浓缩洗涤液(PBST)、不同浓度的2，4-D标准液、抗2，4-D多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、A液、B液和反应终止液的试剂瓶组成。
2.根据权利要求1所述的一种2，4-D残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于所述的海绵支架上有装试剂瓶的孔槽。
3.根据权利要求1所述的一种2，4-D残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于所述的可拆卸96孔酶标板用铝箔袋真空包装，酶标板的板条可拆卸下来，每个孔内均吸附有相同量的包被抗原。
4.根据权利要求3所述的包被抗原，其特征在于为2，4-D与卵清蛋白(OVA)的偶联复合物。
5.根据权利要求1所述的一种2，4-D残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于所述的抗2，4-D多克隆抗体制备方法如下：将2，4-D与牛血清白蛋白(BSA)偶联的复合物作为免疫原，免疫新西兰大耳白兔，获得2，4-D的多克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的一种2，4-D残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于所述的不同浓度的2，4-D标准液用甲醇和蒸馏水配制，溶液中甲醇的含量小于1％。浓度分别为0μg/mL，0.01μg/mL，0.05μg/mL，0.1μg/mL，1μg/mL，10μg/mL，100μg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种2，4-D残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于所述的浓缩洗涤液(PBST)内含有氯化钠7～9g、磷酸二氢钾0.1～0.3g、磷酸氢二钠2～4g、氯化钾3～6g、吐温-20 1mL、双蒸水50mL。
8.根据权利要求1所述的一种2，4-D残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于所述的A液：过氧化尿10mg，103mg柠檬酸，358mg Na2HPO4·12 H2O，吐温-20 1μL，蒸馏水10mL，pH5；B液：四甲基联苯胺(TMB)4mg(用500μL二甲亚砜溶解)，103mg柠檬酸，蒸馏水9.5mL，pH2.4。
9.根据权利要求1所述的一种2，4-D残留的酶联免疫吸附分析试剂盒，其特征在于所述的反应终止液为2mol/L的硫酸液。
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|---|---|---|---|---|
| CN101988921A (zh) * | 2009-07-29 | 2011-03-23 | 丹耐克斯技术有限公司 | 样品板 |
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