CN103558178A - 太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法和装置。目的是提供的方法和装置应具有准确性高、检测快速方便的特点。技术方案是：太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法，包括以下步骤：（1）石英玻片清洗；（2）石英玻片表面修饰；（3）石英玻片表面活化；该检测方法还包括以下步骤：（4）抗体固定；（5）石英玻片表面多余位点封闭；（6）固定毒死蜱；（7）采集石英玻片上待测点与参比点的太赫兹时域波谱；（8）比较石英玻片待测点与参比点的太赫兹时域波谱。太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测装置，检测装置包括太赫兹时域波谱系统、电机及石英玻片。

Description

太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法和装置

技术领域

本发明涉及一种毒死蜱检测方法和装置，尤其涉及一种太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法和装置。

背景技术

毒死蜱（Chlorpyrifos）是一种具有中等毒性的有机磷杀虫剂，具有触杀、胃毒和熏蒸作用，能较好地防治多种作物的地上和地下害虫。作为取代高毒有机磷杀虫剂的理想品种之一，毒死蜱大量应用于我国农业生产实践中。虽然毒死蜱对人没有太大的毒性，但对水生生物有极高毒性，可能对水体环境产生长期不良影响，因此有必要对毒死蜱进行检测。传统的毒死蜱检测方法—酶联免疫法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的农药残留检测方法，该方法具有专一性强、灵敏度高等优点。但是，酶联免疫检测在固定抗原后还需要第二次固定抗体，操作相对复杂，速度慢，难以适应日益增长的快速检测需求。因此，寻找新的毒死蜱残留检测方法并设计合理的装置具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足，提供一种太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法和装置，该方法和装置应具有准确性高、检测快速方便的特点。

本发明采用的技术方案如下：

太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法，包括以下步骤：（1）石英玻片清洗；（2）石英玻片表面修饰；（3）石英玻片表面活化；其特征在于：该检测方法还包括以下步骤：

（4）抗体固定；

取Pluronic F-127、海藻糖，并用PBS缓冲液溶解，取溶解后的混合溶液与抗体溶液混匀，在经过表面活化的石英玻片的标记面上抗体点样N次，分别是N-1个待测点与一个参比点，保持湿润环境并过夜；

（5）石英玻片表面多余位点封闭；

配制酪蛋白/PBS溶液，充分溶解，在离心管中加入经过抗体固定的石英玻片和上述酪蛋白/PBS溶液混匀并静置；之后依次取出石英玻片，先后用去离子水、PBS缓冲液清洗石英玻片，最后在NaN₃/PBS缓冲液中保存；

（6）固定毒死蜱；

将毒死蜱溶解在PBS缓冲液中，稀释成不同待测浓度，并将待测毒死蜱溶液滴加在已封闭好的石英玻片上的待测点，湿润环境下孵育，之后清洗并用氮气吹干；

（7）采集石英玻片上待测点与参比点的太赫兹时域波谱；

将石英玻片与电机固定，通过旋转电机，利用太赫兹时域波谱系统分别采集同一石英玻片上待测点与参比点的太赫兹时域波谱；

（8）比较石英玻片待测点与参比点的太赫兹时域波谱；

画出样品上待测点与参比点的太赫兹时域波谱图形，若待测点时域谱的最高峰峰值小于参比点最高峰峰值的X值，表明该石英玻片上待测点上有毒死蜱；若待测点时域谱的最高峰峰值占参比点最高峰峰值的X值及以上，表明该石英玻片不含毒死蜱或毒死蜱浓度过低无法检测出。

所述步骤（1）包括：在石英玻片的一面上做标记，并在石英玻片中心打一个孔，先后使用去离子水、Hellmanex Ⅱ溶液、去离子水、浓盐酸/甲醇溶液、去离子水、浓硫酸和去离子水清洗，并用氮气吹干。

所述步骤（2）包括：取3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷置于经过清洗的石英玻片的标记面上，取另一经过清洗且标记面朝下的石英玻片盖上，在湿润环境下修饰后分开石英玻片，之后用乙醇、甲醇、乙醇超声清洗石英玻片，氮气吹干；在石英玻片加熔融的O,O′-二(2-氨基丙基)聚丙二醇-嵌段-聚乙二醇-嵌段-聚丙二醇，烘箱内过夜后用去离子水清洗并烘干保存。

所述步骤（3）包括：称取N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、二甲氨基吡啶，量取三乙基胺及无水二甲基甲酰胺，配置上述物质的混合液；取上述混合液置于经过表面修饰的石英玻片的标记面上，取另一经过表面修饰且标记面朝下的石英玻片盖上，活化后分开石英玻片，用甲醇超声清洗并用氮气吹干。

所述步骤（1）、（2）、（3）、（5）中石英玻片的清洗均在染色缸和染色架中进行；所述步骤（3）中混合液为粉红色。

所述X值为90%。

所述步骤（4）中Pluronic F-127质量与PBS缓冲液质量的比值为0.01%，海藻糖质量与PBS缓冲液质量的比值为20%，混合液与抗体溶液的混合比例均为1:1。

所述太赫兹时域波谱系统，在充氮气的情况下采集样本的太赫兹时域波谱；测量环境湿度要求<0.2%。

太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测装置，其特征在于：所述检测装置包括太赫兹时域波谱系统、安装在该太赫兹时域波谱系统的检测内腔中的电机以及水平固定在电机转轴上的石英玻片；石英玻片上通过抗体点样形成至少一个待测点以及至少一个参比点，石英玻片的一侧为太赫兹时域波谱系统的太赫兹波发生器，石英玻片的另一侧为太赫兹时域波谱系统的检测器。

所述电机配有电机控制器，电机的转轴设置在石英玻片的中心位置并与石英玻片垂直，各待测点与转轴之间的距离等于参比点与转轴之间的距离。

本发明具有的有益效果是：本发明基于太赫兹波谱结合生物传感技术，利用已固定毒死蜱与未固定毒死蜱的检测点的太赫兹时域波谱差异来检测毒死蜱；因太赫兹波对大分子（DNA、蛋白质）敏感，故该方法准确性高；与酶联免疫法相比，该方法能避免后续的荧光显色步骤，节约时间，并且能做到免标记；本发明能够同时检测多点，检测效率高；由于固定毒死蜱之前的所有步骤均能事先完成，仅固定毒死蜱与获取相应太赫兹波谱占用时间很短。因此该检测方法能满足日益增长的快速检测需求。

附图说明

图1为石英玻片俯视示意图。

图2为获取太赫兹波谱的原理图。

图中，石英玻片A、待测点B、参比点C、孔D、电机E、太赫兹波发生器F、检测器G、数字标记面H。

具体实施方式

太赫兹波一般认为是频率在0.1-10THz的电磁波，其波长介于微波与红外辐射之间。太赫兹波能量非常低，不会引起对人体或检测材料有害的电离反应。一般情况下，有机分子内化学键的振动吸收频率主要表现在普通红外波段。但是对于分子与分子之间的相对弱的相互作用（如氢键等）以及偶极子的旋转与振动跃迁、大分子的骨架振动、晶体中晶格的低频振动吸收频率等，一般表现在太赫兹红外波段。因此，尽管太赫兹辐射的能量很低，但是大量的分子，尤其是许多有机大分子（DNA、蛋白质等）在这一频段内，表现出强烈的吸收和色散。太赫兹时域波谱技术（Terahertz time-domain spectroscopy，THz-TDS）是国际上近年来发展起来的一项新的研究与检测技术。至今，太赫兹时域波谱技术已经在爆炸物检测、药物检测、医学诊断，国防以及安检等方面有着许多的应用。由于毒死蜱抗体属于蛋白质，并且毒死蜱抗体与毒死蜱结合后会影响分子间的键，而太赫兹波对分子间的作用较为敏感，因此使用太赫兹时域波谱手段检测毒死蜱蛋白具有非常大的潜力。

所述太赫兹时域波谱系统推荐采用Z-omega公司生产的型号为Z3的太赫兹时域波谱系统。

所述的毒死蜱购自Sigma公司，产品编号为45395，但不限于此。

所述的毒死蜱抗体来源于浙江大学农药与环境毒理研究所，但不限于此。

下面结合实施实例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法和装置，包括如下步骤：

（1）石英玻片清洗；

在若干片石英玻片A（1-100个）的一面用钻头做好数字标记（1、2、3……），并在石英玻片中心钻孔；将钻好孔的石英玻片依次放在染色架中，再把染色架放入配套的染色缸中；首先使用去离子水清洗5遍，然后在200ml体积分数为2%的Hellmanex Ⅱ溶液（Müllheim，德国）中超声清洗1小时，置于摇床上振荡过夜；过夜后再次使用去离子水清洗5遍，并在通风橱中加入200ml的浓盐酸/甲醇溶液（浓盐酸与甲醇体积比为1:1），摇床振荡1小时；振荡结束后使用去离子水清洗5遍，再在通风橱中加入200ml质量分数为98%浓硫酸，摇床振荡1小时；最后使用去离子水清洗石英玻片5遍，氮气吹干；

（2）石英玻片表面修饰；

换上干净手套，取若干个培养皿，每个培养皿中放置两个离心管的盖子作为支架，再将清洗后的石英玻片放置在离心管盖上，数字标记面H朝上，与培养皿底面保持一定距离；再用移液枪取600μl的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷（GOPTS，Sigma，德国）置于石英玻片上，取另一清洗后的石英玻片（数字标记面朝下）覆盖在该石英玻片上；在培养皿中加几滴水保持湿润环境，盖上培养皿盖，静置1小时进行修饰；修饰完成后将石英玻片分开，依次放置于染色架上；加入200ml乙醇超声清洗1小时，再在200ml甲醇中超声清洗1小时，最后在200ml乙醇中超声清洗1小时；通风橱内氮气吹干石英玻片，并将石英玻片装入培养皿中；

取10g（可以用在20个石英玻片上）O,O′-二(2-氨基丙基)聚丙二醇-嵌段-聚乙二醇-嵌段-聚丙二醇（JEFFAMINE ED-2003，Sigma，德国），在98℃环境下融化；取600μl融化的JEFFAMINE ED-2003加在石英玻片上，再取另一块玻片将已经修饰好的一面朝下覆盖在该石英玻片上；在培养皿中滴加几滴水保持湿润环境，盖上培养皿盖，在98℃的烘箱内过夜；

将过夜的石英玻片取出放入染色缸中，用200ml去离子水超声清洗15分钟，再用去离子水清洗5次，氮气吹干；此时石英玻片可以室温下保存在充好氮气的干燥器中；

（3）石英玻片表面活化；

用电子天平在放有磁力搅拌子的干净的称量瓶中称取160mg的N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC），清零天平，再称取8mg二甲氨基吡啶（DMAP）；用移液枪先后量取250μl的三乙基胺及3.2ml无水二甲基甲酰胺（DMF）并加在称量瓶中；迅速将瓶口用封口膜封好，置于磁力搅拌器上，磁力搅拌10分钟，至溶液显示粉红色即可；取若干个培养皿，每个培养皿中放置两个支架，再将经表面修饰后的石英玻片放置在支架上面，有数字标记的一面朝上，用移液枪取600μl上述粉红色溶液置于石英玻片上，并取另一经表面修饰后的石英玻片（有数字标记的一面朝下）覆盖在该石英玻片上，盖上培养皿盖静置4小时进行活化；活化过程完毕后将玻片分开，加入200ml甲醇超声清洗15分钟，清洗两次，最后在通风橱内用氮气吹干；

所述DSC、DMAP、三乙基胺及DMF的混合液不能含水，混合液呈粉红色则证明无水，符合要求，否则该混合液需重新配制；

（4）抗体固定；

取出毒死蜱抗体20μl，解冻30分钟；将离心管盖子放入分析天平中，称取0.001g的Pluronic F-127，并倒入离心管中；再称取2g海藻糖（Trehalose）置于称量纸上，将称量好的粉末倒入上述离心管中；向离心管中加入10ml的pH值为7.6的PBS缓冲液，充分混匀；取以上混合液20μl与20μl抗体溶液混匀；再取若干个培养皿，每个培养皿中放置两个支架，再将石英玻片放置在支架上面，有数字标记的一面朝上，用移液枪进行抗体点样，以图1、图2为例，每个石英玻片上分开点4次（N=4），每次2μl，其中远离标记的点作为参比点C，其余三个点作为待测点B；四个点距中心的孔D的距离相等；在培养皿中滴加1滴水保持湿润环境，盖上培养皿盖，过夜；；

所述的Pluronic F-127其作用为防止抗体间相互吸附；

所述的Trehalose其作用为防止液体蒸发，保持抗体活性；

所述的Pluronic F-127质量与PBS缓冲液质量的比值为0.01%，Trehalose质量与PBS缓冲液质量的比值为20%，PBS缓冲液的密度可记为1g/ml；

所述的混合液与抗体溶液，无论抗体有没有稀释过，混合比例均为1:1；

（5）石英玻片表面多余位点封闭；

称取3g酪蛋白（Casein），量取150ml PBS溶液配制2%的Casein/PBS溶液，加热混匀至完全溶解（温度可以选择为50℃），恢复至室温；取若干50ml规格离心管，依次将石英玻片放入其中，每个离心管内一片，加入50ml以上Casein/PBS溶液，振荡混匀1.5分钟，取出放置在染色缸中；染色缸中加入2%的Casein/PBS溶液，振荡4小时；然后加入200ml去离子水，清洗2次，加入200ml PBS溶液清洗1次，并在含1%NaN₃的PBS溶液中保存（温度为4℃）；

（6）固定毒死蜱；

取出已封闭好的石英玻片，有数字标记的一面朝上放置于培养皿中；取已解冻的1mg毒死蜱标样，溶解在PBS缓冲液中，稀释成不同待测浓度，将不同浓度的待测溶液分别放置在不同石英玻片的待测点上，在培养皿中滴加1滴水保持湿润环境，盖上培养皿盖，孵育1小时后清洗用氮气吹干；

（7）采集石英玻片上待测点与参比点的太赫兹时域波谱；

将石英玻片的上的孔与电机E相连并固定；打开太赫兹时域波谱系统的太赫兹波发生器、电脑、锁相放大器以及氮气阀门（太赫兹时域波谱系统自带有氮气的供气管路），此时太赫兹时域波谱系统的检测内腔开始充进氮气，湿度下降，预热半小时后方可进行测量；

随后打开太赫兹时域波谱系统的检测内腔的盖子，并将石英玻片及电机放入检测内腔中，其中石英玻片在太赫兹波光路中；在充氮气的情况下，电机带动石英玻片旋转，在太赫兹时域波谱系统的波谱频宽为0.1-3.5THz区间分别采集同一石英玻片待测点与参比点的太赫兹时域波谱；其中测量环境湿度要求<0.2%，温度为室温；用以上方法逐个测量样本的太赫兹透射时域波谱并保存，获得所有石英玻样片本各自独立的波谱数据组；

电机配备有电机控制器，能够对电机进行控制，进而控制石英玻片进行精确地旋转；通过旋转电机，不同的与中心相同距离的检测点可以接受检测；在太赫兹波谱检测中，每次样品测完后开启时域波谱系统会导致部分氮气逃逸，并且更换样品也需要一定的时间；使用电机可以减少开启太赫兹时域波谱系统的次数，实现多位点检测的同时节约了时间，提高了检测效率；

（8）比较石英玻片待测点与参比点的太赫兹时域波谱；

用绘图软件在同一图中逐个画出各个样品上待测点与参比点太赫兹时域波谱图形，若待测点的最高峰峰值小于参比点脉冲峰峰值的X值（X值根据需要确定，优选90%），表明该石英玻片上待测点上有毒死蜱；若待测点的最高峰峰值占参比点脉冲峰峰值的X值及以上（X值根据需要确定，优选90%），表明该石英玻片不含毒死蜱或毒死蜱浓度过低无法检测出；

所述的绘图软件可选择origin，但不限于此。

所述的N值为2～12，但N的值可以是无穷多个。

所述步骤（8）中待测点时域谱的最高峰峰值与参比点最高峰峰值的90%相比较，这仅为一个参考的标准，具体实施过程中可以变动。

本发明还提供一种太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测装置，包括太赫兹时域波谱系统、安装在该太赫兹时域波谱系统的检测内腔中的电机E以及水平固定在电机转轴上的石英玻片A；石英玻片上通过抗体点样形成至少一个待测点B以及至少一个参比点C，石英玻片的上侧为太赫兹时域波谱系统的太赫兹波发生器F，石英玻片的下侧为太赫兹时域波谱系统的检测器G。

所述电机配有电机控制器（外购获得），电机的转轴设置在石英玻片中心位置的孔D内，并与石英玻片垂直，各待测点B与转轴之间的距离等于参比点C与转轴之间的距离。在安装过程中，可以先确定石英玻片的初始位置，然后电机控制器控制电机每隔一段时间转动一定角度，将石英玻片上的待测点和参比点依次送到太赫兹波发生器和检测器之间等待检测，当待测点或参比点到达准确的位置后，可以启动太赫兹时域波谱系统进行检测。检测完成后，打开检测内腔的盖子，取出电机和石英玻片，在电机上更换新的石英玻片后，再将电机和新的石英玻片整体装入检测内腔中，进行下一次的检测。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法，包括以下步骤：（1）石英玻片（A）清洗；（2）石英玻片表面修饰；（3）石英玻片表面活化；其特征在于：该检测方法还包括以下步骤：

（4）抗体固定；

取Pluronic F-127、海藻糖，并用PBS缓冲液溶解，取溶解后的混合溶液与抗体溶液混匀，在经过表面活化的石英玻片的标记面（H）上抗体点样N次，分别是N-1个待测点（B）与一个参比点（C），保持湿润环境并过夜；

（5）石英玻片表面多余位点封闭；

配制酪蛋白/PBS溶液，充分溶解，在离心管中加入经过抗体固定的石英玻片和上述酪蛋白/PBS溶液混匀并静置；之后依次取出石英玻片，先后用去离子水、PBS缓冲液清洗石英玻片，最后在NaN₃/PBS缓冲液中保存；

（6）固定毒死蜱；

将毒死蜱溶解在PBS缓冲液中，稀释成不同待测浓度，并将待测毒死蜱溶液滴加在已封闭好的石英玻片上的待测点，湿润环境下孵育，之后清洗并用氮气吹干；

（7）采集石英玻片上待测点与参比点的太赫兹时域波谱；

将石英玻片与电机（E）固定，通过旋转电机，利用太赫兹时域波谱系统分别采集同一石英玻片上待测点与参比点的太赫兹时域波谱；

（8）比较石英玻片待测点与参比点的太赫兹时域波谱；

画出样品上待测点与参比点的太赫兹时域波谱图形，若待测点时域谱的最高峰峰值小于参比点最高峰峰值的X值，表明该石英玻片上待测点上有毒死蜱；若待测点时域谱的最高峰峰值占参比点最高峰峰值的X值及以上，表明该石英玻片不含毒死蜱或毒死蜱浓度过低无法检测出。

2.根据权利要求1所述的太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法，其特征在于所述步骤（1）包括：在石英玻片的一面上做标记，并在石英玻片中心打一个孔（D），先后使用去离子水、Hellmanex Ⅱ溶液、去离子水、浓盐酸/甲醇溶液、去离子水、浓硫酸和去离子水清洗，并用氮气吹干。

3.根据权利要求1所述的太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法，其特征在于所述步骤（2）包括：取3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷置于经过清洗的石英玻片的标记面上，取另一经过清洗且标记面朝下的石英玻片盖上，在湿润环境下修饰后分开石英玻片，之后用乙醇、甲醇、乙醇超声清洗石英玻片，氮气吹干；在石英玻片加熔融的O,O′-二(2-氨基丙基)聚丙二醇-嵌段-聚乙二醇-嵌段-聚丙二醇，烘箱内过夜后用去离子水清洗并烘干保存。

4.根据权利要求1所述的太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法，其特征在于所述步骤（3）包括：称取N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、二甲氨基吡啶，量取三乙基胺及无水二甲基甲酰胺，配置上述物质的混合液；取上述混合液置于经过表面修饰的石英玻片的标记面上，取另一经过表面修饰且标记面朝下的石英玻片盖上，活化后分开石英玻片，用甲醇超声清洗并用氮气吹干。

5.根据权利要求1～4任一项所述的太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法，其特征在于所述步骤（1）、（2）、（3）、（5）中石英玻片的清洗均在染色缸和染色架中进行；所述步骤（3）中混合液为粉红色。

6.根据权利要求1所述的太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法，其特征在于所述X值为90%。

7.根据权利要求1所述的太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法，其特征在于所述步骤（4）中Pluronic F-127质量与PBS缓冲液质量的比值为0.01%，海藻糖质量与PBS缓冲液质量的比值为20%，混合液与抗体溶液的混合比例均为1:1。

8.根据权利要求1所述的太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测方法，其特征在于所述太赫兹时域波谱系统，在充氮气的情况下采集样本的太赫兹时域波谱；测量环境湿度要求<0.2%。

9.太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测装置，其特征在于：所述检测装置包括太赫兹时域波谱系统、安装在该太赫兹时域波谱系统的检测内腔中的电机以及水平固定在电机转轴上的石英玻片；石英玻片上通过抗体点样形成至少一个待测点（B）以及至少一个参比点（C），石英玻片的一侧为太赫兹时域波谱系统的太赫兹波发生器（F），石英玻片的另一侧为太赫兹时域波谱系统的检测器（G）。

10.根据权利要求9所述的太赫兹波谱结合生物传感技术的毒死蜱检测装置，其特征在于：所述电机配有电机控制器，电机的转轴设置在石英玻片的中心位置并与石英玻片垂直，各待测点与转轴之间的距离等于参比点与转轴之间的距离。

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