CN105004671B - 基于含水量快速无标记检测致病菌的太赫兹光谱检测池及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于含水量快速无标记检测致病菌的太赫兹光谱检测池及方法，包括聚乙烯样品放置垫片和聚乙烯封闭垫片，聚乙烯样品放置垫片上设置有样品放置区，聚乙烯样品放置垫片与聚乙烯封闭垫片通过粘合连接并将样品放置区封闭，该检测池能够用于太赫兹波快速无标记检测致病菌的种属，判断致病菌的生存状态，对临床疾病诊断具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于检测领域，具体涉及基于含水量快速无标记检测致病菌的太赫兹光谱检测池，还涉及基于含水量的太赫兹波快速无标记检测致病菌的方法。
背景技术
传统的细菌检测技术依赖于平板细菌培养获取纯菌及其代谢产物的生化反应特性，从收集标本到鉴定出细菌种属，往往所需时间过长。不同细菌需要不同培养基，操作繁琐且消耗大量的试剂。尽管其他方法可以更加快速的获悉病原菌的种类，但这些方法各有弊端。如：基于核酸放大技术的荧光PCR由于需要荧光染料的标记，可能导致交叉反应降低特异性。质谱技术在区分大肠杆菌和志贺氏菌方面仍存在相应的缺陷。更为重要的是，荧光PCR和质谱技术是基于细菌核酸和蛋白的检测方法，所以细菌的特异性成分也可以来自死菌，因此不能区分待检细菌的死活，而检测到死菌不仅对疾病诊断意义不大，还容易导致假阳性结果的产生。
太赫兹(Terahertz，THz)辐射是指频率在0.1～10THz，波长在30～3000μm之间的电磁波，由于其波段位于微波和红外之间，早些年也被成为远红外射线(Far-infraredrays)。在过去很长一段时间内，由于缺乏有效辐射源和检测灵敏度较低等技术瓶颈限制，这一波段未能得到充分应用和开发，被称为“THz空隙”。近年来，得益于物理学技术的飞快发展，稳定、可靠的激发光源的出现和检测能力的大幅提高，使得太赫兹技术在生物、航天和通讯等领域广泛应用开来，其中生物医学的研究成为THz技术关注的焦点，包括基因诊断、癌症成像和生物分子检测等。太赫兹时域光谱仪(THz-TDS，Terahertz time-domainspectroscopy)由于其较高的信噪比、可直接获取折射率和吸收系数等优点被广泛运用太赫兹检测中。不同于对应红外波段的分子内化学键振动或转动频率，生物大分子间弱的相互作用包括氢键和范德华力、骨架振动和偶极子旋转等低频振动吸收均位于太赫兹频段内。由于细菌体积小、吸收系数较低，THz辐射可穿透整个菌体，不同细菌具有的其特定结构在THz辐射下具有不同的响应，所以可通过激发细菌内的物质低频振动模式，获得菌体本身的THz振动光谱，最终根据特有的THz振动光谱实现不同细菌的表征。
目前太赫兹用于细菌检测的研究主要集中于粉末状的芽孢杆菌属(休眠状态)，繁殖体状态的细菌仅有大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌透射曲线的差异。未见基于含水量差异的太赫兹波快速无标记检测临床致病菌(繁殖体状态)，并根据含水量改变判断致病菌的生存状态(死菌和活菌)的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供基于含水量快速无标记检测致病菌的太赫兹光谱检测池；由于太赫兹波对水吸收非常敏感，而不同细菌在相同培养条件下含水量不同，可表现为不同的太赫兹光谱特征，而同种细菌在不同生存状态下，由于新陈代谢的改变含水量的变化也可被表征为太赫兹吸收的明显差异，所以本发明的目的之二在于提供太赫兹时域光谱仪快速无标记检测致病菌种属和生存状态的方法。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、基于含水量快速无标记检测致病菌的太赫兹光谱检测池，包括聚乙烯样品放置垫片和聚乙烯封闭垫片，所述聚乙烯样品放置垫片上设置有样品放置区，所述聚乙烯样品放置垫片与聚乙烯封闭垫片通过粘合连接并将样品放置区封闭。
优选的，所述样品放置区为直径15mm的凹陷区域。
优选的，所述检测池还包括固定于聚乙烯样品放置垫片和聚乙烯封闭垫片外侧的中空的金属架，中空位置与样品放置区在同一直线上。更优选的，所述金属架为铝架。
优选的，所述检测池还包括设置在金属架与聚乙烯样品放置垫片和聚乙烯封闭垫片之间的与样品放置区孔径相同的中空缓冲垫片，所述缓冲垫片的中空位置与样品放置区在同一直线上。
进一步优选的，所述缓冲垫片的材质分别为聚四氟乙烯或氯丁橡胶。
2、利用所述的检测池太赫兹时域光谱仪检测致病菌种属和生存状态的方法，包括如下步骤：将待测致细菌放置于样品放置区，然后将检测池固定在检测池位置，在监测区域冲氮气，相对湿度降至2％以下，记录包含了相位和振幅的时域光谱信号，计算待测细菌的光谱参数，根据光谱参数判断致病菌的种属和生存状态。
优选的，所述光谱参数包括吸收系数、折射率、介电常数实部和介电常数虚部，
折射率n(f)由标准化公式计算而来：
和分别是样本和参考信号的透射功率傅利叶变换的相位角，C和f是光速和频率；
消光系数κ(f)由以下公式计算而来：
ρ(f)是样本和参考的透射功率傅利叶变换振幅的比例，所以，吸收系数和推导为：
复合介电常数为：
ε1和ε2分别是介电常数实部和介电常数虚部。
本发明的有益效果在于：本发明公开了基于含水量快速无标记检测致病菌的太赫兹光谱检测池，结构简单，能够在太赫兹时域光谱仪检测致病菌种属，并根据致病菌的含水量判断致病菌生存状态，对临床疾病诊断具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为太赫兹快速无标记检测致病菌的检测池结构图。
图2为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的光谱特征参数(A：吸收系数；B：折射率；C：介电常数(实部)；D：介电常数(虚部)。
图3为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌四种菌粉的吸收系数。
图4为同种细菌不同生存状态下吸收系数的比较(A为金黄色葡萄球菌的活菌、死菌和菌粉的吸收系数的比较。B为四种细菌不同生存状态下(活菌、死菌和菌粉)1THz处吸收系数值的比较)。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、基于含水量快速无标记检测致病菌的太赫兹光谱检测池
基于含水量快速无标记检测致病菌的太赫兹光谱检测池，结构如图1所示，包括聚乙烯样品放置垫片(1)、聚乙烯样品封闭垫片(2)，其中聚乙烯样品放置垫片(1)上设置有直径为15mm凹陷的样品放置区(3)，用于放置待测细菌，将放置垫片和封闭垫片通过双面胶粘合将样品放置区封闭。为了方便检测池的固定，在聚乙烯样品放置垫片(1)和聚乙烯样品封闭垫片(2)外侧用金属中空的金属架(4)进行固定，中空位置与样品放置区在同一直线上，形成检测通道，金属架可以为铝架，也可以为其他金属材质；更优选的，在金属架与封闭垫片之间设置与样品放置区孔径相同的中空缓冲垫片(5)，中空位置也与样品放置区在同一直线上，形成检测通道。优选的，缓冲垫片的材质分别为聚四氟乙烯和氯丁橡胶，金属架与样品放置垫片之间的缓冲垫片为氯丁橡胶，金属架与封闭垫片之间的缓冲垫片为聚四氟乙烯。
检测时将待测细菌放置于样品放置区，然后将检测池固定在太赫兹时域光谱仪检测池位置，在监测区域冲氮气，将相对湿度降至2％以下，通过记录包含了相位和振幅的时域光谱信号后，可以获得待测细菌的光谱参数。空白垫片(不加任何样本)作为空白对照。
实施例2、基于含水量的太赫兹波快速无标记检测致病菌的方法
一、样品制备
将冻存的标准菌株接种于哥伦比亚血琼脂平板培养过夜后获得活菌，死菌由活菌在金属浴100℃，热处理60min后制备获得。菌粉由将活菌放置于冷冻抽干机中，在-110℃的真空环境下抽干胞内水份获得，随后采用0.03g菌粉和0.10g聚乙烯粉末充分混合后使用压片机在4吨/cm2的压力下制作成压片。
二、样品检测
将制得的样品(活菌和死菌)放置于样品放置区，然后将检测池固定在太赫兹时域光谱仪检测池位置，在监测区域冲氮气，将相对湿度降至2％以下。菌粉由压片后普通支架进行固定后测量。通过记录包含了相位和振幅的时域光谱信号后，可以获得待测细菌的光谱参数。
光谱参数的计算过程如下：
细菌的折射率n(f)由标准化公式计算而来：
和分别是样本和参考信号的透射功率傅利叶变换的相位角，C和f是光速和频率。
消光系数κ(f)由以下公式计算而来：
ρ(f)是样本和参考的透射功率傅利叶变换振幅的比例，所以，吸收系数和推导为：
复合介电常数为：
ε1和ε2分别是介电常数(实部)和介电常数(虚部)。
利用上述方法检测临床常见的四种致病菌，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，光谱特征参数如图2所示。结果显示，不同细菌的吸收系数、折射率、介电常数(实部)和介电常数(虚部)均不相同。因此，吸收系数和介电常数(虚部)均可把细菌区分开来，由于介电常数是由系数吸收和折射率推到而来，可直接选用吸收系数作为细菌区分的指标，用于细菌的快速、无标记检测。
然后检测大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌四种菌粉的吸收系数，结果如图3所示。结果显示，水分抽干后吸收差异变小，且数值变小，在1THz处由300cm-1降至13cm-1，说明水分在细胞整体吸收中占有很高的比例。
然后检测大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌四种菌在不同生存状态下吸收系数，结果如图4所示。结果显示，四种细菌不同生存状态下(活菌、死菌和菌粉)1THz处吸收系数值的比较。*P<0.05说明组间差异有统计学意义。
为了验证吸收系数与细菌含水量的相关性，检测大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌四种冷冻抽干机抽干水分前后(活菌与死菌)水含量变化，结果如表1所示。
表1、不同生存状态下细菌的含水量
注：含水量由记录冷冻抽干机抽干胞内水分前后重量差值所获得，描述为：均值±标准差(10次测量结果)
从表1和图4中可看出活菌含水量的高低和活菌吸收系数的高度顺序一致，说明太赫兹波可通过吸收系数对细菌进行无标记快速检测。此外，同种细菌活菌和死菌含水量的差异可表现为吸收系数的差异，说明太赫兹波还可用于待测细菌生存状态的判断。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (4)
1.利用太赫兹时域光谱仪检测致病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：将待测致病菌放置于样品放置区，然后将检测池固定在检测池位置，在监测区域冲氮气，相对湿度降至2％以下，记录包含了相位和振幅的时域光谱信号，计算待测致病菌的光谱参数，根据光谱参数判断致病菌的种属和生存状态；所述光谱参数包括吸收系数、折射率、介电常数实部和介电常数虚部，折射率n(f)由标准化公式计算而来：
和分别是样本和参考信号的透射功率傅利叶变换的相位角，C和f是光速和频率；
消光系数κ(f)由以下公式计算而来：
ρ(f)是样本和参考的透射功率傅利叶变换振幅的比例，所以，吸收系数推导为：
复合介电常数为：
ε1和ε2分别是介电常数实部和介电常数虚部；
所述太赫兹时域光谱仪的检测池包括聚乙烯样品放置垫片和聚乙烯封闭垫片，所述聚乙烯样品放置垫片上设置有样品放置区，所述聚乙烯样品放置垫片与聚乙烯封闭垫片通过粘合连接并将样品放置区封闭；所述样品放置区为直径15mm的凹陷区域。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测池还包括固定于聚乙烯样品放置垫片和聚乙烯封闭垫片外侧的中空的金属架，中空位置与样品放置区在同一直线上。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测池还包括设置于金属架与样品放置垫片之间孔径与样品放置区孔径相同的中空缓冲垫片，以及设置于金属架与封闭垫片之间孔径与样品放置区孔径相同的中空缓冲垫片，所述缓冲垫片的中空位置与样品放置区在同一直线上。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：金属架与样品放置垫片之间的中空缓冲垫片 材质为氯丁橡胶，金属架与封闭垫片之间的中空缓冲垫片材质为聚四氟乙烯。
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