CN104215776B - 一种基于太赫兹时域光谱的无标记血凝素蛋白检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于太赫兹时域光谱的无标记血凝素蛋白检测方法，其中，包括步骤：a、将样本溶于PBS缓冲液中配制成不同浓度的抗原溶液H9，将单克隆抗体F10与抗原溶液H9等体积比反应得到反应物；b、将反应物置于室温孵育一段时间，然后震荡，并在低温条件下过夜，使抗原抗体复合物结构成型；c、将复合物置于检测盒中，并在太赫兹光束焦斑处垂直置入检测盒中，记录与浓度有关的太赫兹强度吸收光谱；d、根据与浓度有关的太赫兹强度吸收光谱判断是否有吸收峰，当没有时，则检测到样本中含有血凝素蛋白。

Description

一种基于太赫兹时域光谱的无标记血凝素蛋白检测方法

技术领域

本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种基于太赫兹时域光谱的无标记血凝素蛋白检测方法。

背景技术

流感病毒是一种可致哺乳类及禽类急性上呼吸道感染的RNA病毒。目前，对于该病毒及其各种亚型的检测和防控已成为全世界面临解决的医学问题。流感病毒表面抗原主要分为两种：血凝素蛋白和唾液酸苷酶。其中血凝素蛋白的分布占了病毒表面的80%，因此对血凝素蛋白的检测可提高流感病毒识别的敏感度。现有技术中对血凝素蛋白的检测绝大多数采用生化免疫学方法，例如荧光免疫发光、免疫印迹法以及酶联免疫吸附法等。这些方法在广泛被利用的同时，也突现出其不便之处：在检测抗原-抗体反应过程中，需要引入荧光探针或蛋白酶作为标记物，由于探针标记物的存在，一定程度上复杂了样品制备及检测过程，增加了检测时间，降低了检测效率。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于太赫兹时域光谱的无标记血凝素蛋白检测方法，旨在解决现有的检测方法检测时间长、检测效率低的问题。

本发明的技术方案如下：

一种基于太赫兹时域光谱的无标记血凝素蛋白检测方法，其中，包括步骤：

a、将样本溶于PBS缓冲液中配制成不同浓度的抗原溶液H9，将单克隆抗体F10与抗原溶液H9等体积比反应得到反应物；

b、将反应物置于室温孵育一段时间，然后震荡，并在低温条件下过夜，使抗原抗体复合物结构成型；

c、将复合物置于检测盒中，并在太赫兹光束焦斑处垂直置入检测盒，记录与浓度有关的太赫兹强度吸收光谱；

d、根据与浓度相关的太赫兹强度吸收光谱判断是否有吸收峰，当没有时，则检测到样本中含有血凝素蛋白。

所述的基于太赫兹时域光谱的无标记血凝素蛋白检测方法，其中，所述步骤a中，单克隆抗体F10以固定浓度230µg/ml与抗原溶液等体积比反应。

所述的基于太赫兹时域光谱的无标记血凝素蛋白检测方法，其中，所述步骤c中，检测盒中的复合物厚度为0.3cm。

所述的基于太赫兹时域光谱的无标记血凝素蛋白检测方法，其中，所述步骤c中，所述太赫兹光束的频率范围为0.1~1.5THz。

所述的基于太赫兹时域光谱的无标记血凝素蛋白检测方法，其中，所述步骤b中，在室温条件下孵育30分钟。

所述的基于太赫兹时域光谱的无标记血凝素蛋白检测方法，其中，所述步骤a中，将样本溶于PBS缓冲液中配制成7.5、15、29、56、113、225以及430µg/ml的浓度梯度。

有益效果：本发明的方法对血凝素蛋白的检测灵敏度大大提高，优于ELISA等传统检测技术，并且无需引入标记物，节省了大量的检测时间，减少了操作步骤，提高了检测效率。

附图说明

图1为本发明实施例中太赫兹强度吸收光谱图。

图2为本发明实施例中太赫兹介电损耗角与抗原-抗体结合位点比关系图。

图3为现有技术中采用ELISA方法检测的浓度关系图。

图4为本发明实施例中太赫兹介电损耗角与太赫兹强度吸收光谱的关系图。

具体实施方式

本发明提供一种基于太赫兹时域光谱的无标记血凝素蛋白检测方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的基于太赫兹时域光谱的无标记血凝素蛋白检测方法包括步骤：

a、将样本溶于PBS缓冲液中配制成不同浓度的抗原溶液H9，将单克隆抗体F10与抗原溶液H9等体积比反应得到反应物；

b、将反应物置于室温孵育一段时间，然后震荡，并在低温条件下过夜，使抗原抗体复合物结构成型；

c、将复合物置于检测盒中，并在太赫兹光束焦斑处垂直置入检测盒，记录与浓度有关的太赫兹强度吸收光谱；

d、根据与浓度有关太赫兹强度吸收光谱判断是否有吸收峰，当没有时，则检测到样本中含有血凝素蛋白。

其中的步骤a中，先将样本溶于PBS缓冲液中配制成不同浓度的抗原溶液H9，以形成浓度梯度，具体是将样本溶于pH7.4的PBS缓冲液中，配制成7.5、15、29、56、113、225以及430µg/ml的浓度梯度的抗原溶液H9（即血凝素蛋白溶液）。

然后将单克隆抗体F10与抗原溶液H9等体积比反应得到反应物。

再将反应物置于室温下孵育30分钟，轻轻震荡，然后在低温条件下过夜，即放置12小时，保证反应充分以及抗原抗体形成的复合物结构成型。

结构成型的复合物（溶液）置于检测盒中，厚度为0.3cm，在太赫兹光束焦斑处垂直置入检测盒，并确保检测盒中无气泡、盒外无挂珠、液体无溢出。

然后记录每一组复合物的太赫兹强度吸收光谱，太赫兹光束的频率范围为0.1~1.5THz，本发明实施例中，记录的太赫兹强度吸收光谱是与浓度相关的，即横坐标为抗原与抗体的结合位点比，纵坐标为吸收系数。根据太赫兹强度吸收光谱判断是否有吸收峰，此处的吸收峰是并非传统意义上的横坐标为频率情况下的概念，其是指由水合层效应产生的非线性变化形成的，具体在后文中有详细分析，当没有时，则检测到样本中含有血凝素蛋白。

下面结合具体实施例来对本发明进行具体说明。

a、将血凝素蛋白溶于pH值7.4的PBS缓冲液中配制成7.5、15、29、56、113、225以及430ug/ml的浓度梯度的抗原溶液H9（即血凝素蛋白溶液）；

b、将单克隆抗体F10以固定浓度230ug/ml与抗原溶液H9等体积比反应得反应物溶液；

其反应条件是在室温下进行混合并震荡得反应物溶液。

c、将反应物溶液置于室温孵育30分钟，轻微震荡，随后在4度冰箱过夜，保证反应充分以及抗原抗体的复合物结构成型；

过夜时间为12小时。

d、将充分反应后得到的复合物溶液滴置于检测盒中，复合物溶液厚度保持在（光程）0.3cm；

该检测盒的材料选用TOPAS^TM 5013L-10，该材料对太赫兹光具有较好的透过率特性，可确保不引入干扰信号。

e、在太赫兹光束焦斑处垂直置入检测盒，并确保检测盒中无气泡、盒外无挂珠以及液体无溢出；

太赫兹光束经过准直后，垂直入射在检测盒中的样品中，并使样品放置在太赫兹的焦点光斑处。

本发明中采用的太赫兹时域光谱系统为z-omega公司生产的型号为z3的太赫兹透射型时域光谱系统。

f、分别多次记录每一组浓度梯度的太赫兹强度吸收光谱，频率范围为0.1~1.5THz，确定太赫兹强度吸收光谱与抗原-抗体摩尔比的关系；

g、经过透射光强测量，计算折射率n(ω)及吸收系数n(ω)，并取多次平均；

h、由折射率n(ω)与吸收系数n(ω)，根据下述公式（1）（2），计算介电常数ε(ω)（ε=ε’ +iε”）的实部ε’与虚部ε”；

(1)

（2）

i、由公式tanδ = ε”/ε’计算得到太赫兹介电损耗角δ，由此可知太赫兹介电损耗角与抗原-抗体摩尔比的关系。

同时，对无抗体加入的血凝素蛋白溶液浓度梯度参考组H9（A）及与血凝素蛋白无特异性反应的阴性对照组H9/irmAb（B）进行同样的检测步骤如上。

即对于无抗体加入的血凝素蛋白溶液浓度梯度参考组H9（A），从步骤c开始，执行同样的检测步骤。对于与血凝素蛋白无特异性反应的阴性对照组H9/irmAb（B），从步骤c开始，执行同样的检测步骤。

如图1所示，从太赫兹强度吸收光谱图中可以看到，无抗体加入的血凝素蛋白溶液浓度梯度参考组H9(A)在浓度为113µg/ml时，出现吸收峰。此吸收峰是由于蛋白外周水合层迭加而引起，据此可计算蛋白外周水合层厚度，水合层现象是由x射线晶体衍射法确定之后，由太赫兹时域光谱技术首次实现可测及可量化。

而在与血凝素蛋白特异性反应的H9-F10中，由于带电位点减少致水合层现象消失，即未出现吸收峰。

与血凝素蛋白无特异性反应的阴性对照组H9/irmAb（B）保留水合层吸收峰特征，但由于体系中溶液密度增大，吸收峰的峰值左移，但是还是存在吸收峰。

如图2所示，从太赫兹介电损耗角与抗原-抗体结合位点比关系图中可知，无抗体加入的血凝素蛋白溶液浓度梯度参考组H9（A）和与血凝素蛋白无特异性反应的阴性对照组H9/irmAb（B）随反应浓度不同，表现为较一致的损耗角值，即未出现明显起伏。而在与血凝素蛋白特异性反应的H9-F10中，反应过程被明显分为3个步骤，第一的转折点发生在15 µg/ml，且可与阴性对照组进行明显区分，该值即为本发明的最小检测值；第二个转折点在113µg/ml，其表明抗原与抗体的最佳反应位点比为1.38:1。

而如图3所示，采用传统的ELISA方法进行检测，其检测最小值为113µg/ml，所以本发明的检测灵敏度大大提高。

如图4所示，从该图的太赫兹介电损耗角与太赫兹强度吸收光谱关系可知，无抗体加入的血凝素蛋白溶液浓度梯度参考组H9（A）和与血凝素蛋白无特异性反应的阴性对照组H9/irmAb（B）均可将其关系由线性拟合特征加以说明，而血凝素蛋白特异性反应的H9-F10由二次多项式可以较好的拟合，最低点可用于估计抗原-抗体最佳反应比时体系的能量损失。随太赫兹介电损耗角数值减少，表明体系中能量的损失减少，由此可知2种损耗机制存在与该过程，从该图可知，最佳抗原浓度为113µg/ml，抗原与抗体的最佳反应位点比为1.38:1。

本发明的方法对血凝素蛋白的检测灵敏度大大提高，优于ELISA等传统检测技术，并且无需引入标记物，节省了大量的检测时间，减少了操作步骤，提高了检测效率。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种基于太赫兹时域光谱的无标记血凝素蛋白检测方法，其特征在于，包括步骤：

a、将样本溶于PBS缓冲液中配制成不同浓度的抗原溶液H9，将单克隆抗体F10与抗原溶液H9等体积比反应得到反应物；

b、将反应物置于室温孵育一段时间，然后震荡，并在低温条件下过夜，使抗原抗体复合物结构成型；

c、将复合物置于检测盒中，并在太赫兹光束焦斑处垂直置入检测盒，记录与浓度有关的太赫兹强度吸收光谱；

d、根据与浓度有关的太赫兹强度吸收光谱判断是否有吸收峰，当没有时，则检测到样本中含有血凝素蛋白；

所述步骤a中，将样本溶于PBS缓冲液中配制成7.5、15、29、56、113、225以及430μg/ml的浓度梯度；

所述过夜时间为12小时；

所述步骤c中的检测盒的材料选用TOPAS^TM5013L-10；

所述步骤a中，单克隆抗体F10以固定浓度230μg/ml与抗原溶液等体积比反应；

所述步骤c中，检测盒中的复合物厚度为0.3cm；所述太赫兹光束的频率范围为0.1～1.5THz；

所述步骤b中，在室温条件下孵育30分钟；

所述步骤c中在记录与浓度有关的太赫兹吸收光谱具体包括：分别多次记录每一组浓度梯度的太赫兹强度吸收光谱，确定太赫兹强度吸收光谱与抗原-抗体摩尔比的关系，通过透射光强测量，计算折射率n(ω)及吸收系数a(ω)，并取多次平均，由折射率n(ω)与吸收系数a(ω)，根据下述公式(1)(2)，计算介电常数ε(ω)＝ε’+iε”的实部ε’与虚部ε”；

${\mathrm{\ϵ}}^{\′}=n{\left(\mathrm{\ω}\right)}^2-\frac{c\mathrm{\α}{\left(\mathrm{\ω}\right)}^2}{2\mathrm{\ω}}---\left(1\right)$

${\mathrm{\ϵ}}^{\′\′}=2n\left(\mathrm{\ω}\right)\left(\frac{c\mathrm{\α}\left(\mathrm{\ω}\right)}{2\mathrm{\ω}}\right)---\left(2\right)$

由公式tanδ＝ε”/ε’计算得到太赫兹介电损耗角δ，获取太赫兹介电损耗角与抗原-抗体摩尔比的关系；

单克隆抗体F10与抗原溶液H9的最佳反应位点比为1.38:1，最佳抗原浓度为113μg/ml。