CN105602840B - 滚环扩增‑太赫兹超材料生物传感器及快速检测多重耐药结核杆菌的方法 - Google Patents
滚环扩增‑太赫兹超材料生物传感器及快速检测多重耐药结核杆菌的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105602840B CN105602840B CN201610060880.0A CN201610060880A CN105602840B CN 105602840 B CN105602840 B CN 105602840B CN 201610060880 A CN201610060880 A CN 201610060880A CN 105602840 B CN105602840 B CN 105602840B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- meta materials
- circle amplification
- rolling circle
- terahertz meta
- terahertz
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 60
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 title claims abstract description 36
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 206010048723 Multiple-drug resistance Diseases 0.000 title claims abstract description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 55
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 44
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 241001484259 Lacuna Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 18
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 11
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 11
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 8
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 5
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims description 5
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 4
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 claims description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 4
- 238000001328 terahertz time-domain spectroscopy Methods 0.000 claims description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 3
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 claims description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 3
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 claims description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- JZLLRGCJEXHGNF-UHFFFAOYSA-M potassium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[K+].NCC(O)=O JZLLRGCJEXHGNF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims 1
- 239000010953 base metal Substances 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 claims 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 claims 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 abstract 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N ethambutol Chemical compound CC[C@@H](CO)NCCN[C@@H](CC)CO AEUTYOVWOVBAKS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 8
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 7
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229960000285 ethambutol Drugs 0.000 description 2
- 201000009671 multidrug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012237 artificial material Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 208000015355 drug-resistant tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011337 individualized treatment Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000001259 photo etching Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
- G01N21/35—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using infrared light
- G01N21/3581—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using infrared light using far infrared light; using Terahertz radiation
- G01N21/3586—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using infrared light using far infrared light; using Terahertz radiation by Terahertz time domain spectroscopy [THz-TDS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
Abstract
本发发明涉及滚环扩增‑太赫兹超材料生物传感器及快速检测多重耐药结核杆菌的方法，所述生物传感器包括太赫兹超材料、包被于太赫兹超材料反应区识别待检测模板序列的捕获探针和聚苯乙烯玻片，所述聚苯乙烯玻片覆盖于太赫兹超材料上层并且形成用于液相扩增反应的液膜腔隙，将滚环扩增‑太赫兹超材料生物传感器包被的捕获探针与滚环扩增的环形模板杂交，实现原位复制扩增，使用本发明的方法结果稳定可靠，可以在3小时之内完成多重耐药结核杆菌五个耐药位点的检测。
Description
技术领域
本发明属于检测领域，具体涉及滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器，还涉及该滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器快速检测多重耐药结核杆菌的方法。
背景技术
近年来，人口流动性的增加等多方面因素，使得结核杆菌感染率居高不下，结核病有正在向全球迅速蔓延的趋势。由于疾病诊断延迟和抗结核药物的滥用，导致多重耐药性结核杆菌发病率的不断增高。普通的结核病只需服用一线抗结核药物(如：异烟肼、利福平等)，采用早期、联合、适量、规律和全程的原则，半年左右即可治愈。而多重耐药性结核病患者感染的结核杆菌体外被证实至少对一线两种药物(异烟肼、利福平等)耐药。快速灵敏的检测出多重耐药结核杆菌，对于控制耐药性结核病和个体化治疗至关重要。目前临床常见的多重耐药结核杆菌的主要检测方法为结核杆菌培养后的药敏实验，这种方法不仅耗时较长通常需要几天到一周不等，且阳性结果较低严重影响疾病的诊治。近年来出现的新的分子学技术手段，例如直接测序法可以更加快速检测多重耐药结核杆菌，但是受限于仪器价格昂贵操作繁琐，无法在实际临床工作中运用开来。因此，建立一种快速、简便的检测多重耐药结核杆菌的新方法具有重大的现实意义。
太赫兹(Terahertz，THz)辐射是指频率为0.1～10THz的电磁波，由于其波段位于微波和红外之间，相比于紫外可见吸收光谱、X射线成像分析等传统技术，THz光谱有其独特的优势。太赫兹超材料是指与其相互作用为THz波段电磁波的新型人工材料，可对THz波的振幅和相位等进行灵活的控制。金属开口谐振环(SRR)是目前最常见的超材料结构类型，如果把SRR看作为一个电感电容电路元件，超材料的共振频率即可表示为其中L和C分别是电感和电容。电感主要是所制备超材料的几何参数所决定，而电容与电容器的有效介电常数密切相关。当超材料表面覆盖物质后或者物质改变后，其局域有效介电常数的改变会引起电容的改变，从而导致其共振频率的改变。因此，可通过检测太赫兹超材料共振频率的位移来实现微量标本的检测。
滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)是一种恒温的DNA扩增过程，避免了传统PCR的复杂热循环带来的非特异性扩增和不兼容性等技术缺陷。RCA可在固相载体上实现捕获探针的固定，同靶序列杂交后，建立生物传感器芯片表面的滚环扩增系统。但是，目前RCA主要通过琼脂糖凝胶电泳检测，周期长，结果稳定性差。
因此，急需一种结果稳定可靠，能够在较短周期内完成多重耐药结核杆菌检测的生物传感器及相应的检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器；本发明的目的之二在于提供利用滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器快速检测多重耐药结核杆菌的方法。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
1、滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器，所述生物传感器包括太赫兹超材料、包被于太赫兹超材料反应区识别待检测模板序列的捕获探针和聚苯乙烯玻片，所述聚苯乙烯玻片覆盖于太赫兹超材料上层并且形成用于液相扩增反应的液膜腔隙。
本发明中，太赫兹超材料由硅基底上周期性排列的金属开口谐振环组成，硅片为470μm厚，硅片上的金膜为200nm厚，每个周期由五个金属开口谐振环所组成。优选的，将太赫兹超材料分为为5个独立反应区域。
本发明中所述液膜腔隙的高度优选为50μm。
优选的，所述捕获探针为5’端经巯基化修饰的核苷酸序列如SEQ ID NO.6～10所示的序列。
本发明中，还包括滚环扩增的环形模板，所述滚环扩增的环形模板由待检测模板序列与相匹配的锁式探针通过连接酶连接形成的环形DNA分子。
更优选的，所述待检测模板序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～15所示，所述锁式探针为5’端经磷酸基修饰的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的序列。
2、利用所述滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器快速检测多重耐药结核杆菌的方法，包括如下步骤：
(1)根据结核杆菌耐药位点Kat G315(AGC→ACC)，inh A-15(ACG→ATG)，rpo B526(CAC→TAC)，531(TCG→TTG)，emb B306(ATG→GTG)和rps L43(AAG→AGG)设计与锁式探针和特异识别耐药位点的捕获探针，所述锁式探针能够与结核杆菌基因组DNA耐药位点区域连接形成滚环扩增的环形模板；
(2)将待测结核杆菌培养后进行灭活，然后离心收集菌体，提取基因组DNA，备用；
(3)将锁式探针分别加入到含待测结核杆菌基因组DNA的连接反应体系中使结核杆菌基因组DNA耐药位点区域与锁式探针形成滚环扩增的环形模板；
(4)向步骤(3)所得滚环扩增的环形模板中分别加入Phi29DNA聚合酶，dNTPs混合液以及BSA；然后分别加入包被识别相应耐药位点的捕获探针的太赫兹超材料反应区进行滚环扩增反应；
(5)将滚环扩增反应的生物传感器采用太赫兹时域光谱仪在18～25℃采用透射模式进行测量，光路中配置有密闭装置并冲入高浓度氮气使检测池相对湿度降至2％以下；并以高阻硅的透射光谱作为样本的参考信号；在RCA反应前后分别测量太赫兹超材料反应区的透射光谱，根据共振频率位移判断待检测结核杆菌是否含有耐药位点，然后判断是为多重耐药结核杆菌。
优选的，步骤(1)中，所述捕获探针为5’端经巯基化修饰的核苷酸序列如SEQ IDNO.6～10所示的序列，所述耐药位点区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～15所示，所述锁式探针为5’端经磷酸基修饰的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～5所示的序列。
优选的，所述步骤(3)为将锁式探针分别加入到含待测结核杆菌基因组DNA的连接反应体系中至锁式探针终浓度为100nM，95℃变性5min后冰浴1min，然后置于45℃水浴箱中杂交反应20min；随后加入DNA连接酶和质量分数为0.05％的BSA，37℃条件下连接45min，在连接产物中加入核酸外切酶反应体系再加入10U的exonuclease I和exonuclease III，37℃反应15min后，95℃，5min灭活外切酶。
优选的，所述连接反应体系为pH7.8、含30mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，4mMMgCl2，0.1mM NAD和1.2mM EDTA的水溶液；所述核酸外切酶反应体系为含67mM glycine-KOH pH 9.5，6.7mM MgCl2和10mM DTT的水溶液。
更优选的，所述滚环扩增反应条件为在温度为37℃条件下反应1h。
发明的有益效果：本发明公开了滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器，通过将将太赫兹超材料和RCA有机结合，用于多重耐药结核杆菌的快速检测，检测中以四种一线抗结核药物的五个突变位点为检测对象：异烟肼(INH)耐药Kat G315(AGC→ACC)，inh A-15(ACG→ATG)；利福平(RFP)耐药rpo B526(CAC→TAC)，531(TCG→TTG)；乙胺丁醇(EMB)耐药embB306(ATG→GTG)；链霉素(SM)耐药rps L43(AAG→AGG)。设计出相应的锁式探针(PadlockProbe，PLP)，耐药位点区域和捕获探针，锁式探针和耐药位点区域通过连接酶连接成环形DNA分子，作为滚环扩增的环形模板，其靶序列与固定在超材料上的捕获探针杂交，实现了原位复制扩增。由于DNA分子的有效扩增、分子链延长，导致超材料表面的有效介电常数发生改变，使得太赫兹超材料的共振频率发生位移。当在超材料表面不同区域中分别不同突变位点的捕获探针后，从而可以通过监测太赫兹超材料特定区域的反应前后的共振频率的改变检测特定突变位点的存在与否。由于不同位点的扩增反应在同一片超材料的不同区域进行，从而可以通过监测不同区域反应前后共振频率的改变实现同时五个位点的平行检测。本发明结果稳定可靠，可以在三小时之内完成多重耐药结核杆菌五个耐药位点的检测，能够用于临床检测多重耐药结核杆菌耐药位点。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为太赫兹超材料结构的光镜示意图。
图2为滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器的侧面结构示意图。
图3为滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器的原理示意图。
图4为RCA反应前后太赫兹超材料共振频率的变化。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器，包括太赫兹超材料、包被于太赫兹超材料反应区识别待检测模板序列的捕获探针和聚苯乙烯玻片，所述聚苯乙烯玻片覆盖于太赫兹超材料上层并且形成用于液相扩增反应的液膜腔隙，液膜腔隙高度约为50μm；其中太赫兹超材料结构如图1所示，由硅基底上周期性排列的金属开口谐振环组成，硅片为470μm厚，硅片上的金膜为200nm厚，每个周期由五个金属开口谐振环所组成，其中超材料由现有光刻技术制备(图1)。为检测不同的模板，将超材料分隔多个独立地反应区域，如本实施例分为五个独立的反应区域，分别包被不同的捕获探针(图2)。
滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器快速检测多重耐药结核杆菌的方法，具体步骤如下：
(1)探针及模板设计：以结核杆菌四种一线抗结核药物的五个突变位点为检测对象：异烟肼(INH)耐药Kat G315(AGC→ACC)，inh A-15(ACG→ATG)；利福平(RFP)耐药rpoB526(CAC→TAC)，531(TCG→TTG)；乙胺丁醇(EMB)耐药emb B306(ATG→GTG)；链霉素(SM)耐药rps L43(AAG→AGG)，然后根据NCBI核酸数据库和基因分析软件，采用Primerpremier5.0软件对五个靶序列设计出相应的锁式探针、捕获探针和耐药位点区域，具体见表1所示；
(2)标本准备：临床多重耐药结核杆菌标本采用改良Roch液体培养基进行标准化培养后，在85℃条件下1h进行灭活，取5ml细菌培养液在10000rmp转速下离心1分钟，取沉淀后采用商品化试剂盒提取基因组DNA；
(3)RCA反应准备：把线性锁式探针(终浓度为100nM)与耐药位点区域加入到20μL的连接反应体系(pH7.8，30mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，4mM MgCl2，0.1mM NAD，1.2mMEDTA)中，95℃变性5min后冰浴1min，然后置于45℃水浴箱中杂交反应20min；随后加入3U的E.coli DNA ligase和0.05％BSA，37℃条件下连接45min，在连接产物中加入核酸外切酶反应体系(67mM glycine-KOH pH 9.5，6.7mM MgCl2，10mM DTT)再加入10U的exonuclease I和exonuclease III，37℃反应15min后，95℃，5min灭活外切酶，获得滚环扩增的环形模板；
(4)RCA反应：将上述含有滚环扩增的环形模板的反应体系中加入0.5U/μLPhi29DNA聚合酶，1mM dNTPs混合液以及0.2μg/μL BSA；然后加在包被识别相应耐药位点的捕获探针的太赫兹超材料反应区域，在温度为37℃条件下RCA反应1h，由于锁式探针和耐药位点区域互补杂交成环形DNA分子，在Phi29DNA聚合酶作用下启动了RCA反应，将dNTPs转变成一条长的单链DNA片段不断延长(图3)。
(5)太赫兹光谱检测：实验采用太赫兹时域光谱仪(THz-TDS，Terahertz time-domain spectroscopy)在室温(18～25℃)下采用透射模式进行测量，为了避免水蒸气的强烈吸收影响检测结果，在光路中配置有密闭装置并冲入高浓度氮气，使检测池相对湿度降至2％以下；并测量高阻硅的透射光谱作为样本的参考信号，以消除硅片本身带来F-P驻波的影响；在RCA反应前分别测量太赫兹超材料五个不同区域的透射光谱，反应1h后再次测量，分别除以高阻硅的透射光谱后进行比较，结果如图4所示。结果显示，太赫兹超材料各区域中由于捕获探针与反应产物结合导致超材料表面微环境有效介电常数的改变，导致反应前后超材料的共振频率发生位移。
表1、探针及模板序列设计
结果分析：按照上述方法提取出基因组DNA标本后，分别和五种锁式探针混合成五个反应体系，分别加入太赫兹超材料对应的五个不同区域，检测反应前后太赫兹超材料的共振频率的改变，结果如表2。第一个区域和第三个区域，由于耐药位点区的存在，并能与锁式探针结合后进行环形DNA分子，启动RCA反应，导致共振频率蓝移(右移)，而在另外三个区域对应的锁式探针未能成环，无法启动RCA反应，共振频率无明显改变。说明样本中具有katG315(G→C)和rpoB526(C→T)两个突变位点，提示该结核杆菌对异烟肼和利福平具有耐药基因。表明利用滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器能够快速检测多重耐药结核杆菌。
表2、检测混合菌液反应前后太赫兹超材料的共振频率的改变
上述实施例中RCA反应模板也可以以线性锁式探针(终浓度为100nM)与基因组DNA在连接反应体系中形成滚环扩增的环形模板。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (5)
1.利用滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器快速检测多重耐药结核杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）根据结核杆菌耐药位点Kat G315（AGC→ACC），inh A-15（ACG→ATG），rpo B526（CAC→TAC），531（TCG→TTG），emb B306（ATG→GTG）和rps L43（AAG→AGG）设计与锁式探针和特异识别耐药位点的捕获探针，所述锁式探针能够与结核杆菌基因组DNA耐药位点区域连接形成滚环扩增的环形模板；所述捕获探针为5’端经巯基化修饰的核苷酸序列如SEQ IDNO.6~10所示的序列，所述耐药位点区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.11~15所示，所述模板序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.11~15所示；所述锁式探针为5’端经磷酸基修饰的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~5所示的序列；
（2）将待测结核杆菌培养后进行灭活，然后离心收集菌体，提取基因组DNA，备用；
（3）将锁式探针分别加入到含待测结核杆菌基因组DNA的连接反应体系中使结核杆菌基因组DNA耐药位点区域与锁式探针形成滚环扩增的环形模板；
（4）向步骤（3）所得滚环扩增的环形模板中分别加入Phi29 DNA 聚合酶，dNTPs混合液以及BSA；然后分别加入包被识别相应耐药位点的捕获探针的太赫兹超材料反应区进行滚环扩增反应；
（5）将滚环扩增反应的生物传感器采用太赫兹时域光谱仪在18~25℃采用透射模式进行测量，光路中配置有密闭装置并冲入高浓度氮气使检测池相对湿度降至2%以下；并以高阻硅的透射光谱作为样本的参考信号；在RCA反应前后分别测量太赫兹超材料反应区的透射光谱，根据共振频率位移判断待检测结核杆菌是否含有耐药位点，然后判断是为多重耐药结核杆菌；所述生物传感器包括太赫兹超材料、包被于太赫兹超材料反应区识别待检测模板序列的捕获探针和聚苯乙烯玻片，所述聚苯乙烯玻片覆盖于太赫兹超材料上层并且形成用于液相扩增反应的液膜腔隙；太赫兹超材料由硅基底上周期性排列的金属开口谐振环组成，硅片为470μm厚，硅片上的金膜为200nm厚，每个周期由五个金属开口谐振环所组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述液膜腔隙的高度为50μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）为将锁式探针分别加入到含待测结核杆菌基因组DNA的连接反应体系中至锁式探针终浓度为100nM，95℃变性5 min后冰浴1 min，然后置于45℃水浴箱中杂交反应20min；随后加入DNA 连接酶和质量分数为0.05%的BSA，37℃条件下连接45min，在连接产物中加入核酸外切酶反应体系再加入10U的exonuclease I和exonuclease III，37℃反应15min后，95℃，5min灭活外切酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述连接反应体系为pH7.8、含30 mMTris-HCl，10mM (NH4)2SO4，4mM MgCl2，0.1 mM NAD 和 1.2mM EDTA的水溶液；所述核酸外切酶反应体系为含67 mM glycine-KOH pH 9.5，6.7mM MgCl2 和10 mM DTT的水溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述滚环扩增反应条件为在温度为37℃条件下反应1h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610060880.0A CN105602840B (zh) | 2016-01-28 | 2016-01-28 | 滚环扩增‑太赫兹超材料生物传感器及快速检测多重耐药结核杆菌的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610060880.0A CN105602840B (zh) | 2016-01-28 | 2016-01-28 | 滚环扩增‑太赫兹超材料生物传感器及快速检测多重耐药结核杆菌的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105602840A CN105602840A (zh) | 2016-05-25 |
| CN105602840B true CN105602840B (zh) | 2017-11-24 |
Family
ID=55983190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610060880.0A Active CN105602840B (zh) | 2016-01-28 | 2016-01-28 | 滚环扩增‑太赫兹超材料生物传感器及快速检测多重耐药结核杆菌的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105602840B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109211833A (zh) * | 2018-08-30 | 2019-01-15 | 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 | 一种可再生的通用型太赫兹超材料传感器 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108732138A (zh) * | 2017-04-15 | 2018-11-02 | 大连理工大学 | 一种光子超颖表面生物传感器 |
| CN109576147B (zh) * | 2018-12-12 | 2019-08-23 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | 基于磁流变液技术的恒温扩增型太赫兹多通道微流控芯片及其用于病原菌检测的方法 |
| US11041802B2 (en) | 2019-05-20 | 2021-06-22 | Imam Abdulrahman Bin Faisal University | Amplitude difference referencing technique with terahertz metasurfaces for sub-micron biomolecules detection |
| CN114279998B (zh) * | 2021-12-29 | 2024-01-09 | 福州大学 | 基于类回字型太赫兹超材料的液体增强传感系统及方法 |
| NL2035042B1 (en) * | 2023-06-08 | 2024-02-05 | Univ Zhejiang | Multi-dimensional terahertz metamaterial signal-based pathogen rapid identification method |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103499534A (zh) * | 2013-07-25 | 2014-01-08 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 高灵敏太赫兹微流通道传感器及其制备方法 |
| CN104764711A (zh) * | 2015-04-17 | 2015-07-08 | 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 | 太赫兹超材料生物传感芯片及其测试方法 |
| CN105004671A (zh) * | 2015-07-07 | 2015-10-28 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 基于含水量快速无标记检测致病菌的太赫兹光谱检测池及方法 |
| CN105505759A (zh) * | 2016-01-28 | 2016-04-20 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 多种病原菌平行检测的滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器及其检测方法 |
| CN106645016A (zh) * | 2016-11-23 | 2017-05-10 | 电子科技大学 | 基于l形结构超材料的透射型太赫兹微流通道传感器 |
-
2016
- 2016-01-28 CN CN201610060880.0A patent/CN105602840B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103499534A (zh) * | 2013-07-25 | 2014-01-08 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 高灵敏太赫兹微流通道传感器及其制备方法 |
| CN104764711A (zh) * | 2015-04-17 | 2015-07-08 | 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 | 太赫兹超材料生物传感芯片及其测试方法 |
| CN105004671A (zh) * | 2015-07-07 | 2015-10-28 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 基于含水量快速无标记检测致病菌的太赫兹光谱检测池及方法 |
| CN105505759A (zh) * | 2016-01-28 | 2016-04-20 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 多种病原菌平行检测的滚环扩增-太赫兹超材料生物传感器及其检测方法 |
| CN106645016A (zh) * | 2016-11-23 | 2017-05-10 | 电子科技大学 | 基于l形结构超材料的透射型太赫兹微流通道传感器 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109211833A (zh) * | 2018-08-30 | 2019-01-15 | 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 | 一种可再生的通用型太赫兹超材料传感器 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105602840A (zh) | 2016-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105602840B (zh) | 滚环扩增‑太赫兹超材料生物传感器及快速检测多重耐药结核杆菌的方法 | |
| CN105505759B (zh) | 多种病原菌平行检测的滚环扩增‑太赫兹超材料生物传感器及其检测方法 | |
| EP2182077B1 (en) | A method for single nucleotide polymorphism and mutation detection using real time polymerase chain reaction microarray | |
| CN1995380B (zh) | 一种检测和鉴定分枝杆菌菌种的方法及其专用试剂盒 | |
| EP2180066B1 (en) | Single nucleotide polymorphism genotyping detection via the real-time invader assay microarray platform | |
| CN106086192A (zh) | 他克莫司个性化用药相关基因的分型检测试剂盒 | |
| CN106834519A (zh) | 一种TaqMan‑MGB探针法检测人类ALDH2基因多态性的引物及其应用 | |
| CN101619346A (zh) | 人冠心病易感基因-脂蛋白a基因拷贝数变异检测方法和试剂盒 | |
| CN106257989B (zh) | Ngs系统对照和涉及所述ngs系统对照的方法 | |
| CN101157954A (zh) | 基于环介导等温扩增技术的结核分枝杆菌核酸筛查方法 | |
| CN109097448A (zh) | 一种基于解旋酶和切刻酶的等温扩增核酸检测方法及试剂盒 | |
| Xiang et al. | Highly sensitive and specific real-time PCR by employing serial invasive reaction as a sequence identifier for quantifying EGFR mutation abundance in cfDNA | |
| CN104928355A (zh) | 检测braf基因突变的方法及其试剂盒 | |
| CN108531627A (zh) | 一种用于检测b族链球菌的rpa荧光定量引物对、探针、试剂盒及检测方法 | |
| Searle et al. | Third‐generation sequencing of epigenetic DNA | |
| CN110643722A (zh) | 一种淋病奈瑟菌耐药位点多重检测方法及试剂盒 | |
| CN102286616A (zh) | 一种检测结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变的方法及试剂盒 | |
| CN108998534A (zh) | 一种kras基因突变检测的新方法 | |
| US11332780B2 (en) | Simplified polynucleotide sequence detection method | |
| CN116769939A (zh) | 检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的引物组合 | |
| CN106350595A (zh) | 检测人类cyp2c9基因分型的引物及探针、试剂盒、方法 | |
| CN107385089A (zh) | 一种检测隐孢子虫卵囊的核酸组合、试剂盒以及方法 | |
| CN104611420A (zh) | 一种结核菌检测试剂盒 | |
| CN112029910B (zh) | SARS-CoV-2病毒核酸检测方法 | |
| CN103173543A (zh) | 一种预测放射不良反应相关基因突变检测芯片 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |