CN104977272B - 太赫兹超材料与纳米金颗粒联用的生物样品信号放大方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种太赫兹超材料与纳米金颗粒联用的生物样品信号放大方法。配置不同浓度的多个生物样品溶液和金标亲和素溶液，在超材料表面滴加生物样品溶液后常温下晾干，在超材料表面滴加金标亲和素溶液后常温下晾干，采集超材料表面所有待测样品点与参考样品点的太赫兹时域信号，由太赫兹时域信号计算所有待测样品点与参考样品点的透射率或反射率，并根据透射率或反射率最低点对应的频率值计算得到透射峰或反射峰的频移。本发明联用太赫兹超材料与纳米金颗粒修饰，利用超材料电场局域增强效应放大样品信号；并利用纳米金改变电场分布效应，通过纳米金修饰进一步放大样品信号，检测灵敏度高，操作简便快速，能满足日益增长的快速检测需求。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物样品的太赫兹信号放大方法，尤其涉及一种太赫兹超材料与纳米金颗粒联用的生物样品信号放大方法。
背景技术
随着检测技术的发展，波谱检测技术由于其检测快速简便而逐渐引起了国内外学者的广泛关注。太赫兹波谱技术作为一种新兴的波谱技术已经逐渐引起人们的注意。由于许多大分子的振动、转动能级都落在太赫兹波段，太赫兹波被认为是一种对生物样品检测非常具有潜力的波段。对于太赫兹波谱技术具有较大应用前景的领域，如安全、生物、医药、农业和材料表征等应用方面，存在微量甚至是超微量的无损检测需求。然而，由于太赫兹波源能量低和直接检测灵敏度有限的劣势，导致该技术很难用于微量样品的快速检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足，提供一种太赫兹超材料与纳米金颗粒联用的生物样品信号放大方法，该方法应具有灵敏度性高、检测快速方便的特点。
本发明采用的技术方案包括如下步骤：
1)配置不同浓度的多个生物样品溶液和不同浓度的多个金标亲和素溶液；
2)超材料表面滴加生物样品溶液；
将生物样品溶液滴加在一清洗过的超材料表面，每个浓度滴加至少三次，每次滴加量相同，并任意设置三个参考样品点，如图2所示，参考样品点均与待测样品点位置不同，滴加后常温下晾干；
3)超材料表面滴加金标亲和素溶液；
将金标亲和素溶液滴加在另一清洗过的超材料表面，每个浓度滴加至少三次，每次滴加量相同，并任意设置三个参考样品点，如图2所示，参考样品点均与待测样品点位置不同，滴加后常温下晾干；
4)采集超材料表面所有待测样品点与参考样品点的太赫兹时域信号；在充氮气氛围下，将生物样品放在待测样品点上，在太赫兹时域波谱系统的波谱频宽为0.1-3.5THz区间分别采集同一超材料上待测样品点与参考样品点的太赫兹时域信号；
5)由太赫兹时域信号得到透射峰或反射峰的频移，计算所有待测样品点与参考样品点的透射率或反射率，并根据透射率或反射率最低点对应的频率值计算得到透射峰或反射峰的频移：利用快速傅里叶变换将生物样品的太赫兹波谱时域信号转换到频域信号，由频域信号计算得到待测样品点的透射率或者反射率，将待测样品点与参考样品点的透射率或者反射率最低点对应的频率值相减得到的绝对值作为透射峰或反射峰的频移，实现对亲和素信号的放大。
所述步骤2)和3)中超材料采用以下方式清洗：取一块完整的太赫兹超材料，先后用去离子水、磷酸盐缓冲液清洗后，再用去离子水清洗，并用氮气吹干。
所述步骤1)中金标亲和素溶液采用以下方式配置：
1.1)原料混合保存；
取普通亲和素和纳米金颗粒进行混合，普通亲和素和纳米金颗粒混合的物质的量之比为10:1～2500:1，如图1所示，常温条件下在摇床上进行振荡，并在0～4℃温度下中进行保存；其形成的纳米金溶液为酒红色；
1.2)金标亲和素提取；
将金标亲和素取出，放入离心管，经离心机离心后，去除离心管上清液中多余的普通亲和素，并用去离子水反复清洗沉淀，最后再加入去离子水并充分振荡得到金标亲和素溶液。
所述步骤1.2)中离心机的离心转速为5000～10000rpm，离心时间为10～20分钟。
所述步骤4)中采集太赫兹时域信号时，待测样品点的检测面积大于1mm2。
所述的生物样品采用普通亲和素、DNA或者大肠杆菌。
所述步骤1)配置得到的金标亲和素溶液和生物样品溶液的浓度范围均在2×10-10～10×10-10mol/L之间。
所述步骤3)中生物样品溶液或者步骤4)中金标亲和素溶液的每次滴加量为5～100ul。
所述的生物样品采用DNA或者大肠杆菌，不同浓度的多个金标亲和素溶液为金标亲和素与生物素标记后生物样品复合物溶液。
复合方式和过程是：金标亲和素与生物素标记后生物样品中的生物素特异性结合，形成金标亲和素与生物素标记后生物样品复合物溶液，金标亲和素与生物素或者生物样品之间的浓度比例关系为大于等于1:1，优选的比例为1:1-4:1。
所述步骤1.1)中普通亲和素的pH为5～9，纳米金颗粒的pH为8～12。
所述步骤4)中本发明的太赫兹时域光谱系统采集太赫兹时域信号时测量环境的湿度为<0.2％。
优选的本发明普通亲和素具体实施中可选用Sigma公司生产的货号为A9275的亲和素，但不限于此。
所述的纳米金颗粒粒径为8-90nm。
本发明金标亲和素可以用于与生物素的结合反应，因此该信号放大方法能在DNA杂交、抗体特异性结合方面有广泛应用。
本发明的纳米金颗粒能够在不激发其表面等离子体的情况下，直接对样品信号进行放大，并且效果显著。
本发明的纳米金可以替换为其他金属纳米粒子，包括纳米银颗粒，纳米金棒，纳米银包金颗粒，纳米金包银颗粒等。
具体是实施中优选的本发明的太赫兹时域波谱系统推荐采用z-omega公司生产的型号为z3的太赫兹时域波谱系统。
本发明采用太赫兹时域波谱技术(Terahertz time-domain spectroscopy，THz-TDS)，其是国际上近年来发展起来的一项新的研究与检测技术。至今，太赫兹时域波谱技术已经在国防、医药、化学、食品、材料等方面有着许多的应用。太赫兹波是一种波长介于微波与红外辐射之间的电磁波，其频率为0.1-10THz。尽管太赫兹辐射的能量很低，但是大量的分子，尤其是许多有机大分子(DNA、蛋白质等)在这一频段内，表现出强烈的吸收和色散。
本发明的超材料是一种人工制作的周期性结构材料，具有许多自然界材料无法表现出的性质。近年来，太赫兹波段下超材料的研究逐渐引起广大学者的关注，目前已经在通讯、吸收器等方面有一定应用。近年来，超材料已经逐渐在太赫兹波段检测应用中发挥优势作用。
由此本发明利用太赫兹超材料技术，其具有的有益效果是：
本发明联用太赫兹超材料技术与纳米金颗粒修饰技术，利用超材料的电场局域增强效应放大样品信号。
本发明同时利用纳米金能改变表面电场分布的效应，通过纳米金修饰的方法进一步放大样品信号，因此该方法检测灵敏度高。
与传统的压片技术相比，本发明方法能大大提高检测灵敏度；并且本方法操作简便快速，能满足日益增长的快速检测需求。
附图说明
图1为本发明超材料检测金标亲和素原理图。
图2为本发明实施例1的超材料表面待测样品点和参考样品点分布图。
图3为本发明实施例1普通亲和素与金标亲和素样品引起的太赫兹超材料谐振峰频移图。
图4为本发明实施例3中纳米金样品引起的太赫兹超材料谐振峰频移图。
其中，A为普通亲和素，B为纳米金，C为超材料，D为太赫兹波，E为待测样品点，F为参考样品点。
具体实施方式
下面结合实施实例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
本发明的实施例如下：
实施例1
(1)超材料清洗；
用镊子夹取一块完整的超材料，先后用去离子水，磷酸盐缓冲液(Sigma公司)，去离子水清洗3次，并用氮气吹干；
(2)金标亲和素配置；
换上干净手套，用移液枪移取浓度为1mg/mL的普通亲和素(pH约为7)300μL于一支干净的离心管中，再用移液枪移取浓度为20nmol/L的纳米金溶液(pH约为10)0.5mL，将两者进行混合(普通亲和素与纳米金的物质的量之比约2500:1)，常温条件下在摇床上振荡15分钟，并在冰箱中进行保存，保存温度为4℃，保存时间大于等于0.5小时；
(3)金标亲和素提取；
将装有金标亲和素的离心管从冰箱中取出，另取一支同型号的离心管注入等量去离子水，配平后经离心机离心，转速为10000rpm，离心时间为15分钟。离心后多余的普通亲和素悬浮在上层，金标亲和素则在离心管下层，去除离心管中上清液，并用去离子水反复清洗沉淀，清洗并取走多余的普通亲和素；
(4)获得金标亲和素溶液；
清洗金标亲和素后，往离心管中加入500μL去离子水，通过振荡将金标亲和素溶于去离子水中；
(5)超材料表面滴加普通亲和素溶液；
分别配置五个浓度梯度的普通亲和素溶液(本实施实例中为2×10-10mol/L，4×10-10mol/L，6×10-10mol/L，8×10-10mol/L和10×10-10mol/L)，取10μL溶液，滴加在清洗过的超材料表面，每个浓度滴加三次，并设置三个参考样品点(没有任何样品)，常温下晾干(相应的普通亲和素的物质的量为2fmol，4fmol，6fmol，8fmol，10fmol)，待测样品点的检测面积约为4mm2；
(6)超材料表面滴加金标亲和素溶液；
分别配置五个浓度梯度的金标亲和素溶液(本实施实例中为2×10-10mol/L，4×10-10mol/L，6×10-10mol/L，8×10-10mol/L和10×10-10mol/L)，取10μL溶液，滴加在清洗过的超材料表面，每个浓度滴加三次，并设置三个参考样品点(没有任何样品)，常温下晾干(相应的金标亲和素的物质的量为2fmol，4fmol，6fmol，8fmol，10fmol)，待测样品点的检测面积约为4mm2；
(7)采集超材料表面所有待测样品点与参考样品点的太赫兹时域波谱；
打开激光，电脑，控制器以及氮气阀门，此时太赫兹时域波谱系统内开始充进氮气，湿度下降，激光预热半小时后方可进行测量；打开太赫兹时域波谱系统测量用的盖子，并将超材料放进检测光路中，用夹具固定；在充氮气的情况下，在太赫兹时域波谱系统的波谱频宽为0.1-3.5THz区间分别采集同一超材料上待测样品点与参考样品点的太赫兹时域波谱。其中测量环境湿度要求<0.2％，温度为常温；用以上方法逐个测量样本的太赫兹时域波谱并保存，获得所有待测样品点与参考样品点的太赫兹时域波谱数据组。
(8)计算所有待测样品点的透射率或反射率，并寻找透射率或反射率最低点对应的频率值；利用快速傅里叶变换将样品的太赫兹波谱时域信号转换到频域信号，利用频域信号得到待测样品点的透射率或者反射率。
其中，透过率或反射率可以由以下公式得到：
T＝(E(sample-T)/E(reference-T))2
R＝(E(sample-R)/E(reference-R))2
上述公式中，T表示透过率，E(sample-T)表示透射模式下待测样品点的电场强度，E(reference-T)表示透射模式下参考样品点的电场强度，R表示反射率，E(sample-R)表示反射模式下待测样品点的电场强度，E(reference-R)表示反射模式下参考样品点的电场强度。
寻找透射率或者反射率最低点对应的频率值，并将待测样品点的该频率值与参考样品点的该频率值相减，得到透射峰或反射峰的频移，如图3所示。
实施例2
(1)超材料清洗；
用镊子夹取一块完整的超材料，先后用去离子水，磷酸盐缓冲液(Sigma公司)，去离子水清洗3次，并用氮气吹干；
(2)金标亲和素配置；
换上干净手套，用移液枪移取浓度为0.8mg/mL的普通亲和素(pH约为5)300μL于一支干净的离心管中，再用移液枪移取浓度为20nmol/L的纳米金溶液(pH约为9)0.5mL，将两者进行混合(普通亲和素与纳米金的物质的量之比约2000:1)，常温条件下在摇床上振荡15分钟，并在冰箱中进行保存，保存温度为0℃，保存时间大于等于0.5小时；
(3)金标亲和素提取；
将金标亲和素从冰箱中取出，另取一支同型号的离心管注入等量去离子水，配平后经离心机离心，转速为15000rpm，离心时间为10分钟。离心后多余的普通亲和素悬浮在上层，金标亲和素则在离心管下层，去除离心管中上清液，并用去离子水反复清洗沉淀，清洗并取走多余的普通亲和素；
(4)获得金标亲和素溶液；
清洗金标亲和素后，往离心管中加入500μL去离子水，通过振荡将金标亲和素溶于去离子水中；
(5)金标亲和素与生物素(biotin)标记的目标DNA结合；
取一支装有DNA的离心管，加入PBS缓冲液配置成6μmol/L的DNA溶液。本实施实例中生物素标记的目标DNA序列为：
5’-TATCCTGAGACCGCGTTTTTTTTTT-C6-Biotin-3’。可以通过生工公司合成。移取500μLDNA溶液，加入到金标亲和素中，充分反应3小时，另取一支同型号的离心管注入等量去离子水，配平后经离心机离心，转速为5000rpm，离心时间为20分钟。离心后多余的生物素标记的目标DNA悬浮在上层，生物素标记的目标DNA-金标亲和素复合物则在离心管下层，去除离心管中上清液，并用去离子水反复清洗沉淀，清洗并取走多余的生物素标记的目标DNA，加入0.5mL去离子水，振荡溶解得到生物素标记的目标DNA-金标亲和素复合物；
本实施实例中生物素标记的目标DNA序列为：
5’-TATCCTGAGACCGCGTTTTTTTTTT-C6-Biotin-3’，实际操作中生物素标记的目标DNA序列不限于此。
(6)超材料表面滴加目标DNA溶液；
本实施实例目标DNA为：5’-TATCCTGAGACCGCGTTTTTTTTTT-C6-3’。
分别配置一定浓度梯度的目标DNA溶液(本实施实例中为2×10-10mol/L，4×10- 10mol/L，6×10-10mol/L，8×10-10mol/L和10×10-10mol/L)，取5μL溶液，滴加在清洗过的超材料表面，每个浓度滴加三次，并设置三个参考样品点(没有任何样品)，常温下晾干，待测样品点的检测面积约为1mm2；
(7)超材料表面滴加金标亲和素与生物素标记的目标DNA复合物；
分别配置五个浓度梯度的金标亲和素与生物素标记的目标DNA复合物(本实施实例中为2×10-10mol/L，4×10-10mol/L，6×10-10mol/L，8×10-10mol/L和10×10-10mol/L)，取5μL溶液，滴加在清洗过的超材料表面，每个浓度滴加三次，并设置三个参考样品点(没有任何样品)，常温下晾干，待测样品点的检测面积约为1mm2；
(8)采集超材料表面所有待测样品点与参考样品点的太赫兹时域波谱；
打开激光，电脑，控制器以及氮气阀门，此时太赫兹时域波谱系统内开始充进氮气，湿度下降，激光预热半小时后方可进行测量；打开太赫兹时域波谱系统测量用的盖子，并将超材料放进检测光路中，用夹具固定；在充氮气的情况下，在太赫兹时域波谱系统的波谱频宽为0.1-3.5THz区间分别采集同一超材料上待测样品点与参考样品点的太赫兹时域波谱。其中测量环境湿度要求<0.2％，温度为常温；用以上方法逐个测量样本的太赫兹时域波谱并保存，获得所有待测样品点与参考样品点的太赫兹时域波谱数据组。
(9)计算所有待测样品点的透射率或反射率，并寻找透射率或反射率最低点对应的频率值；
利用快速傅里叶变换将样品的太赫兹波谱时域信号转换到频域信号，利用频域信号得到待测样品点的透射率或者反射率。寻找透射率或者反射率最低点对应的频率值，并将待测样品点的该频率值与参考样品点的该频率值相减，得到透射峰或反射峰的频移。
实施例3
(1)超材料清洗；
用镊子夹取一块完整的超材料，先后用去离子水，磷酸盐缓冲液(Sigma公司)，去离子水清洗3次，并用氮气吹干；
(2)大肠杆菌抗体偶联纳米金；
换上干净手套，用移液枪移取浓度为1mg/mL的大肠杆菌抗体(pH约为9)2μL于一支干净的离心管中，再用移液枪移取浓度为20nmol/L的纳米金溶液(pH约为8)0.5mL，将两者进行混合(大肠杆菌抗体与纳米金的物质的量之比约10:1)，常温条件下在摇床上振荡15分钟；
(3)大肠杆菌抗体偶联纳米金的提取；
将大肠杆菌抗体偶联纳米金从冰箱中取出，另取一支同型号的离心管注入等量去离子水，配平后经离心机离心，转速为5000rpm，离心时间为20分钟。去除离心管中上清液，并用去离子水反复清洗沉淀；
(4)获得大肠杆菌抗体偶联纳米金溶液；
清洗大肠杆菌抗体偶联纳米金后，往离心管中加入500μL去离子水，通过振荡将大肠杆菌抗体偶联纳米金溶于去离子水中；
(5)大肠杆菌抗体偶联纳米金捕获大肠杆菌；
取浓度为108CFU/mL的大肠杆菌溶液0.1mL，加入到上述的大肠杆菌抗体偶联纳米金溶液，静置反应2小时，得到大肠杆菌抗体偶联纳米金与大肠杆菌的复合物；
(6)超材料表面滴加目标大肠杆菌溶液；
分别配置五个浓度梯度的目标大肠杆菌溶液(本实施实例中为2*1064*CFU/mL，6*106CFU/mL，8*106CFU/mL和107CFU/mL)，取100μL溶液，滴加在清洗过的超材料表面，每个浓度滴加三次，并设置三个参考样品点(没有任何样品)，常温下晾干，待测样品点的检测面积大于10mm2；
(7)超材料表面滴加步骤(5)中得到的大肠杆菌抗体偶联纳米金与大肠杆菌的复合物；
分别配置五个浓度梯度的大肠杆菌抗体偶联纳米金与大肠杆菌的复合物(本实施实例中为2*1064*CFU/mL，6*106CFU/mL，8*106CFU/mL和107CFU/mL)，取100μL溶液，滴加在清洗过的超材料表面，每个浓度滴加三次，并设置三个参考样品点(没有任何样品)，常温下晾干，待测样品点的检测面积大于10mm2；
需要保证此处大肠杆菌抗体偶联纳米金与大肠杆菌的复合物中纳米金的浓度至少在10-10mol/L的量级。
(8)采集超材料表面所有待测样品点与参考样品点的太赫兹时域波谱；
打开激光，电脑，控制器以及氮气阀门，此时太赫兹时域波谱系统内开始充进氮气，湿度下降，激光预热半小时后方可进行测量；打开太赫兹时域波谱系统测量用的盖子，并将超材料放进检测光路中，用夹具固定；在充氮气的情况下，在太赫兹时域波谱系统的波谱频宽为0.1-3.5THz区间分别采集同一超材料上待测样品点与参考样品点的太赫兹时域波谱。其中测量环境湿度要求<0.2％，温度为常温；用以上方法逐个测量样本的太赫兹时域波谱并保存，获得所有待测样品点与参考样品点的太赫兹时域波谱数据组。
(9)计算所有待测样品点的透射率或反射率，并寻找透射率或反射率最低点对应的频率值；
利用快速傅里叶变换将样品的太赫兹波谱时域信号转换到频域信号，利用频域信号得到待测样品点的透射率或者反射率。寻找透射率或者反射率最低点对应的频率值，并将待测样品点的该频率值与参考样品点的该频率值相减，得到透射峰或反射峰的频移。
如附图4所示，物质的量在fmol量级的纳米金颗粒能使得太赫兹超材料出现明显的峰的偏移。因此，将纳米金与亲和素、DNA或者大肠杆菌相连，只要纳米金颗粒的物质的量在fmol量级，亲和素、DNA或者大肠杆菌就能被检测到。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种太赫兹超材料与纳米金颗粒联用的生物样品信号放大方法，其特征在于包括如下步骤：
1）配置不同浓度的多个生物样品溶液和不同浓度的多个金标亲和素溶液；
所述步骤1）中金标亲和素溶液采用以下方式配置：
1.1）原料混合保存；
取普通亲和素和纳米金颗粒进行混合，常温条件下在摇床上进行振荡，并在0~4 ℃温度下中进行保存；
1.2）金标亲和素提取；
将金标亲和素取出，放入离心管，经离心机离心后，去除离心管上清液中多余的普通亲和素，并用去离子水反复清洗沉淀，最后再加入去离子水并充分振荡得到金标亲和素溶液；
2）超材料表面滴加生物样品溶液：将生物样品溶液滴加在一清洗过的超材料表面，每个浓度滴加至少三次，每次滴加量相同，并任意设置三个参考样品点，参考样品点均与待测样品点位置不同，滴加后常温下晾干；
3）超材料表面滴加金标亲和素溶液：将金标亲和素溶液滴加在另一清洗过的超材料表面，每个浓度滴加至少三次，每次滴加量相同，并任意设置三个参考样品点，参考样品点均与待测样品点位置不同，滴加后常温下晾干；
4）采集超材料表面所有待测样品点与参考样品点的太赫兹时域信号：在充氮气氛围下，将生物样品放在待测样品点上，在波谱频宽为0.1-3.5THz区间分别采集同一超材料上待测样品点与参考样品点的太赫兹时域信号；
5）由太赫兹时域信号得到透射峰或反射峰的频移：利用快速傅里叶变换将生物样品的太赫兹波谱时域信号转换到频域信号，由频域信号计算得到待测样品点的透射率或者反射率，将待测样品点与参考样品点的透射率或者反射率最低点对应的频率值相减得到的绝对值作为透射峰或反射峰的频移，实现对亲和素信号的放大。
2.根据权利要求1所述的一种太赫兹超材料与纳米金颗粒联用的生物样品信号放大方法，其特征在于：所述步骤2）和3）中超材料采用以下方式清洗：取一块完整的太赫兹超材料，先后用去离子水、磷酸盐缓冲液清洗后，再用去离子水清洗，并用氮气吹干。
3.根据权利要求1所述的一种太赫兹超材料与纳米金颗粒联用的生物样品信号放大方法，其特征在于：所述的普通亲和素和纳米金颗粒混合的物质的量之比为10:1~2500:1。
4.根据权利要求1所述的一种太赫兹超材料与纳米金颗粒联用的生物样品信号放大方法，其特征在于：所述步骤1.2）中离心机的离心转速为5000~15000 rpm，离心时间为10~20分钟。
5.根据权利要求1所述的一种太赫兹超材料与纳米金颗粒联用的生物样品信号放大方法，其特征在于：所述步骤4）中采集太赫兹时域信号时，待测样品点的检测面积大于1mm2，测量环境的湿度为<0.2%。
6.根据权利要求1所述的一种太赫兹超材料与纳米金颗粒联用的生物样品信号放大方法，其特征在于：所述的生物样品采用普通亲和素、DNA或者大肠杆菌。
7.根据权利要求1所述的一种太赫兹超材料与纳米金颗粒联用的生物样品信号放大方法，其特征在于：所述步骤1）配置得到的金标亲和素溶液和生物样品溶液的浓度范围均在2×10-10~10×10-10mol/L之间。
8.根据权利要求1所述的一种太赫兹超材料与纳米金颗粒联用的生物样品信号放大方法，其特征在于：所述步骤3）中生物样品溶液或者步骤4）中金标亲和素溶液的每次滴加量为5~100 μL。
9.根据权利要求1所述的一种太赫兹超材料与纳米金颗粒联用的生物样品信号放大方法，其特征在于：所述步骤1.1）中普通亲和素的pH为5~9，纳米金颗粒的pH为8~10。
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