CN109324011B - 基于纳米材料检测活细菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供基于纳米材料检测活细菌的方法,属于微生物检测领域,检测方法为:取菌液加至纳米材料表面,烘干后利用太赫兹时域光谱仪在18‑25℃、检测池相对湿度低于2%条件下采用透射模式测量透射光谱;该纳米材料为CuS量子敏化二氧化钛纳米管;其中二氧化钛纳米管采用卧式旋转阳极氧化法制得;CuS量子敏化通过水热反应进行。本发明检测活细菌的方法,不需要标记,能够快速检测,且方法简单;所采用的纳米材料比表面积大、尺寸可控、机械强度高,太赫兹作用具有多个吸收峰,因此能够实现多种细菌鉴别,并且需要的样品量少;利用该纳米材料对细菌检测,具有较高的敏感度、准确度和稳定性。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测领域,具体涉及基于纳米材料检测活细菌的方法。
背景技术
食品中污染的病原菌是引起食源性疾病的主要因素之一,快速检测与鉴定食品中病原菌对及时有效控制病原菌传播、预防食物中毒有着至关重要的作用。目前病原菌的检测主要依靠常规的培养方法,需经富集培养、选择性分离、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定等过程,一般需4-7d,操作繁琐,费时耗力。近年来,随着生物生化、免疫学、分子生物学的不断发展,一些新的方法手段逐步应用于食品微生物检测。
以生物传感器、生物芯片(蛋白芯片、基因芯片、免疫芯片)为代表的新型快速检测技术和方法正迅猛发展,与传统的物理或化学传感器、离线分析技术、基于溶液的分析法相比,这些新型技术具有选择性好、灵敏度高、成本低、可批量生产、可批量筛查、可微型化、便于携带、可以现场检测等优势,正在食品安全监测中发挥越来越重要的作用。
检测中使用荧光标记,不仅可以有效避免背景荧光的干扰,还可以根据实际需求选择高效、特定、廉价的激发光源,方便检测。那么,以纳米半导体荧光量子点作为新型荧光标记,可充分发挥其荧光寿命长、量子产率高、发射波长可调、发射光谱半峰宽窄等一系列优点,甚至还可以使用同一激发光源同时激发多个量子点,进行多通道、多目标物的同时检测。由于量子点荧光标记的光学生物传感器可获得较高的灵敏度和光学稳定性,被广泛应用于食品安全的检测中。
现有技术如授权公告号为CN 103884695 B的中国发明专利,公开了一种快速检测细菌的聚烯烃纳米纤维膜传感器及其制备方法。该发明采用聚烯烃共聚物为基体材料,经表面化学改性、生物活性分子的固相合成工艺,制备出化学改性的聚烯烃纳米纤维膜的生物传感器。采用该发明制备出来的纳米纤维膜生物传感器,在性能方面克服了传统检测细菌存在的细菌培养,数菌落等耗时耗力和准确性差的缺点,利用三磷酸腺苷、荧光素酶、荧光素之间发光原理,快速检测细菌释放出来的ATP,实现了对生物有害物质快速响应的纳米纤维膜传感器。并且由于采用了固相合成,使生物活性酶很好的固定在纳米纤维膜表面,可以起到反复循环地检测细菌。可以广泛地应用在生物技术、医疗卫生、食品药品检测、水处理等领域。然而,该发明方法无法同时实现多种细菌的鉴别,且无法区分活菌和死菌。
发明内容
本发明的目的在于提供基于纳米材料检测活细菌的方法,不需要标记,能够快速检测,且方法简单;所采用的纳米材料比表面积大、尺寸可控、机械强度高,太赫兹作用具有多个吸收峰,因此能够实现多种细菌鉴别,并且需要的样品量少;利用该纳米材料对细菌检测,具有较高的敏感度、准确度和稳定性。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为:
基于纳米材料检测活细菌的方法:取菌液加至纳米材料表面,烘干后利用太赫兹时域光谱仪在18-25℃、检测池相对湿度低于2%条件下采用透射模式测量透射光谱;该纳米材料为CuS量子敏化二氧化钛纳米管。
作为优选,烘干为35-45℃条件下烘干5-10min。
作为优选,菌液添加量为菌体数量为103-108CFU。
作为优选,二氧化钛纳米管的制备方法为:采用卧式旋转阳极氧化法制备二氧化钛纳米管阵列,然后在马弗炉中400-450℃煅烧1.5-2h制得定型二氧化钛纳米管。
作为优选,阳极氧化法电解液组成为:80-120ml乙二醇,1-2ml去离子水,0.05-0.5gNH4F,1-10ml三乙醇胺和0.1-1ml对甲基苯甲酸乙酯的电解液溶液;三乙醇胺和对甲基苯甲酸乙酯的特殊存在,一方面能够提高电解液的电导传输性能,有利于电子从中心向四周传导进行阳极氧化,既提高了氧化速度,同时可加强阳极氧化层的均匀性:从四周向中心递进氧化形成氧化膜,避免造成局部未氧化或氧化过度;另一方面,能够造成氧化物形成和Ti4+溶剂化之间的竞争不平衡,即提高F-腐蚀二氧化钛氧化层的速度,从而削弱F-与Ti4+络合的速度,最终有利于所需孔径二氧化钛纳米管的形成与生长,同时纳米管的机械强度也得到提升。
作为优选,二氧化钛纳米管的孔径分布在300-500nm。
作为优选,CuS量子敏化二氧化钛纳米管的制备方法为:将定型二氧化钛纳米管,CuCl2溶液以及Na2S2O3溶液进行水热反应;水热反应的条件为:CuCl2溶液浓度为0.001-0.005mol/L,Na2S2O3溶液浓度为0.01-0.03mol/L;水热反应温度为110-150℃、时间为1-5h。
作为优选,CuS粒子的直径分布为15-40nm。
更优选地,对CuS量子敏化二氧化钛纳米管进行聚乙烯掺杂:将CuS量子敏化二氧化钛纳米管、聚乙烯粉末以及乙酰胺和苯乙醇,水热反应1-2h;聚乙烯粉末的加入量为CuS的1-3倍;乙酰胺的加入量为聚乙烯粉末的0.1-0.6倍,苯乙醇的加入量为混合溶液体积的1-3%;乙酰胺和苯乙醇具有协同效果,一是降低聚乙烯粉末在反应过程中的粘度,抑制其聚集或堵塞二氧化钛纳米管管口,从而使其均匀地分散到二氧化钛纳米管表面的CuS粒子间形成相互掺杂;二是有利于加强反应过程所产生热量的流动,使得整个反应空间内部热量均匀,这对于二氧化钛纳米管结构的稳定性有一定的保护作用。
本发明通过采用阳极氧化法制备二氧化钛纳米管阵列,其形貌和尺寸可控,所制得的纳米管具有高度规整有序的结构,可作为优良的光电功能材料载体;本发明制备的是孔径分布在300-500nm的二氧化钛纳米管阵列,且纳米管为一端开口,这样的结构有利于载流子的传输,且具有较大的比表面积,能够为细菌检测提供更多的位点,可同时实现多种细菌的鉴别;对二氧化钛纳米管表面进行CuS量子敏化,一方面可提高材料的光吸收响应程度,另一方面有利于载流子中电子和空穴的分离,降低了二者复合几率,有利于纳米材料对太赫兹信号的吸收和响应;因此利用该材料进行细菌检测,具有较高的敏感度和准确度。
对CuS进行聚乙烯掺杂,是因为CuS具有高的电导率,显示出较强的金属传导性,用聚乙烯进行掺杂可以改善载流子的传输;由于CuS纳米粒子对太赫兹的高吸收率,而聚乙烯材料对太赫兹信号的吸收很小,对CuS进行聚乙烯掺杂不但稀释了CuS粉末的高吸收率,提高了信噪比,同时可提高测量的稳定性。
本发明采用太赫兹时域光谱系统测量THz波通过纳米样品的透射特性,即太赫兹电磁脉冲透过样品介质时,通过样品信号的脉冲形状和振幅的变化来判断样品表面的变化;当细菌覆盖于纳米材料表面时,纳米材料的介电常数和电导率以及纳米结构中电介质的色散性质和载流子的导电性质均发生改变,将会引起共振频率位移数值上的差异,从而可用于细菌种属间的鉴别。
本发明的有益效果为:
1)本发明利用纳米材料检测活细菌的方法,不需要标记,能够快速检测,且方法简单;
2)本发明纳米材料为CuS量子敏化二氧化钛纳米管,通过将二氧化钛与CuS复合,能够提高材料的光吸收响应程度,同时有利于载流子中电子和空穴的分离,降低了电子和空穴复合的几率,有利于纳米材料对太赫兹信号的吸收和响应,提高了检测的敏感度和准确度;载体二氧化钛纳米管具有较大的比表面积,太赫兹作用具有多个吸收峰,因此能够实现多种细菌鉴别;纳米管表面负载聚乙烯粉末掺杂的CuS,可有效提高材料对太赫兹吸收的信噪比,可提高测量的稳定性。
本发明采用了上述技术方案提供范文,弥补了现有技术的不足,设计合理,操作方便。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述:
实施例1:
纳米材料的制备方法具体如下:
(1)二氧化钛纳米管制备:采用卧式旋转阳极氧化法制备:将购买的厚度为0.05mm的钛片裁剪成长、宽为40mm×20mm的规格,用7000目砂纸打磨至表面光滑平整,在丙酮和无水乙醇中分别超声清洗30min,去除表面油污;然后在组成为10ml蒸馏水,5ml硝酸,1ml18wt%的NH4F和1ml18%wt的氨水的抛光液中去除表面的氧化膜,最后用蒸馏水清洗3-5次;
配制组成为80ml乙二醇,1ml去离子水,0.05gNH4F,1ml三乙醇胺和0.1ml对甲基苯甲酸乙酯的电解液溶液;将预处理的钛片和钛基底平整叠加放入自制模具中,将其整体夹持在阳极,铂电极作为阴极,调整两电极使其正对,然后在直流电压50V、温度45℃条件下进行阳极氧化反应,反应过程中保持适当速率的磁力搅拌,反应3h后,关闭电源停止反应,从电解液中取出电极,将二氧化钛纳米管在乙醇中超声清洗3min;
将二氧化钛纳米管在马弗炉中400℃煅烧1.5h制得定型二氧化钛纳米管;
(2)对二氧化钛纳米管进行表面CuS量子敏化,分为两个阶段:
第一阶段:将定型二氧化钛纳米管,CuCl2溶液以及Na2S2O3溶液进行水热反应;水热反应的条件为:CuCl2溶液浓度为0.001mol/L,Na2S2O3溶液浓度为0.01mol/L;水热反应温度为110℃、时间为1h;
第二阶段:加入聚乙烯粉末以及乙酰胺和苯乙醇,继续水热反应1h;聚乙烯粉末的加入量为CuS的1倍;乙酰胺的加入量为聚乙烯粉末的0.1倍,苯乙醇的加入量为混合溶液体积的1%。
利用该纳米材料检测活细菌的方法,具体步骤如下:
(1)细菌培养:将冻存的标准菌株大肠杆菌接种于哥伦比亚血琼脂平板,在温度为37℃、CO2体积分数为5%的恒温孵箱中培养过夜,培养后挑选无污染、形态典型的单菌落,利用灭菌生理盐水充分润洗去除培养基成分,随后离心富集,重悬于灭菌生理盐水中,根据吸光度(OD600)和菌液中每毫升的菌落形成单位数值(cfu/mL)的标准曲线,测量吸光度,配置成105CFU/ml的浓度;
(2)样品测量:取10μL菌液加至纳米材料中心,放置于热板上在42℃条件下烘干10min,然后用太赫兹时域光谱仪(THz-TDS,Terahertz time-domain spectroscopy)在20℃下采用透射模式进行测量,为了避免水蒸气的强烈吸收影响检测结果,在光路中配置有密闭装置并冲入高浓度氮气,使检测池相对湿度降至2%以下;并以测量未加样本的纳米材料作对比。
按照上述相同的方法检测大肠杆菌活菌和死菌,大肠杆菌死菌制备方法为在100℃下煮沸1h;由于活菌与死菌的含水量不同,分别覆盖于纳米材料表面时,有效介电常数的改变量不同导致共振频率位移数值上的差异。因此,可以采用本发明的方法检测微量死菌和活菌,不需要标记。
实施例2:
纳米材料的制备方法具体如下:
(1)二氧化钛纳米管制备:电解液配比为:100ml乙二醇,1ml去离子水,0.2gNH4F,3ml三乙醇胺和0.6ml对甲基苯甲酸乙酯的电解液溶液;其余部分同实施例1一致;
(2)对二氧化钛纳米管进行表面CuS量子敏化,分为两个阶段:
第一阶段:将定型二氧化钛纳米管,CuCl2溶液以及Na2S2O3溶液进行水热反应;水热反应的条件为:CuCl2溶液浓度为0.003mol/L,Na2S2O3溶液浓度为0.02mol/L;水热反应温度为130℃、时间为3h;
第二阶段:加入聚乙烯粉末以及乙酰胺和苯乙醇,继续水热反应1h;聚乙烯粉末的加入量为CuS的2倍;乙酰胺的加入量为聚乙烯粉末的0.3倍,苯乙醇的加入量为混合溶液体积的2%。
利用该纳米材料检测活细菌的方法,同实施例1一致。
实施例3:
纳米材料的制备方法具体如下:
(1)二氧化钛纳米管制备:电解液配比为:120ml乙二醇,2ml去离子水,0.5gNH4F,10ml三乙醇胺和1ml对甲基苯甲酸乙酯的电解液溶液;其余部分同实施例1一致;
(2)对二氧化钛纳米管进行表面CuS量子敏化,分为两个阶段:
第一阶段:将定型二氧化钛纳米管,CuCl2溶液以及Na2S2O3溶液进行水热反应;水热反应的条件为:CuCl2溶液浓度为0.005mol/L,Na2S2O3溶液浓度为0.03mol/L;水热反应温度为150℃、时间为5h;
第二阶段:加入聚乙烯粉末以及乙酰胺和苯乙醇,继续水热反应2h;聚乙烯粉末的加入量为CuS的3倍;乙酰胺的加入量为聚乙烯粉末的0.6倍,苯乙醇的加入量为混合溶液体积的3%。
利用该纳米材料检测活细菌的方法,同实施例1一致。
对比例1:
二氧化钛纳米管阳极氧化电解液组成未添加三乙醇胺和对甲基苯甲酸乙酯,其余部分和实施例2完全一致。
对比例2:
对二氧化钛纳米管进行表面CuS量子敏化的第二阶段过程未添加乙酰胺和苯乙醇,其余部分和实施例2完全一致。
实施例4:
对本发明制备的纳米材料的结构理化性质进行检测和表征,得到表1所示;对钛片进行阳极氧化3h得一定尺寸的二氧化钛纳米管;很明显,当阳极氧化电解液组成不含有三乙醇胺和对甲基苯甲酸乙酯时,对比例1制得的二氧化钛纳米管的长度和孔径均减小,表明三乙醇胺和对甲基苯甲酸乙酯的特殊存在能够加快氧化速度,且有利于大孔径二氧化钛纳米管的形成与生长;对比例2中得到的二氧化钛纳米管表面敏化不理想,表明乙酰胺和苯乙醇具有协同效果,能够抑制聚乙烯粉末聚集或堵塞二氧化钛纳米管管口,从而提高与CuS粒子间相互掺杂的均匀性。
表1 纳米材料性质
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术,故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明,而并非对本发明的限制,本领域的普通技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,还可以做出各种变化和变型。因此,所有等同的技术方案也属于本发明的范畴,本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
Claims (4)
1.基于纳米材料检测活细菌的方法,其特征在于:取菌液加至纳米材料表面,烘干后利用太赫兹时域光谱仪测量透射光谱;所述纳米材料为CuS量子敏化二氧化钛纳米管;
所述二氧化钛纳米管的制备方法为:采用卧式旋转阳极氧化法制备二氧化钛纳米管阵列,然后于400-450℃煅烧1.5-2h制得定型二氧化钛纳米管;
所述阳极氧化电解液组成为:80-120ml乙二醇,1-2ml去离子水,0.05-0.5gNH4F,1-10ml三乙醇胺和0.1-1ml对甲基苯甲酸乙酯;
所述CuS量子敏化二氧化钛纳米管的制备方法为:将定型二氧化钛纳米管,CuCl2溶液以及Na2S2O3溶液进行水热反应;
所述水热反应条件:CuCl2溶液浓度为0.001-0.005mol/L,Na2S2O3溶液浓度为0.01-0.03mol/L;水热反应温度为110-150℃、时间为1-5h;
对所述CuS量子敏化二氧化钛纳米管进行聚乙烯掺杂的步骤为:将CuS量子敏化二氧化钛纳米管、聚乙烯粉末以及乙酰胺和苯乙醇,水热反应1-2h;
所述聚乙烯粉末的加入量为CuS的1-3倍,所述乙酰胺的加入量为聚乙烯粉末的0.1-0.6倍,所述苯乙醇的加入量为混合溶液体积的1-3%;
所述二氧化钛纳米管的孔径分布在300-500nm。
2.根据权利要求1所述的基于纳米材料检测活细菌的方法,其特征在于:所述测量透射光谱的具体操作条件为:在18-25℃、检测池相对湿度低于2%的条件下采用透射模式测量。
3.根据权利要求1所述的基于纳米材料检测活细菌的方法,其特征在于:所述烘干的操作条件为:35-45℃的条件下烘干5-10min。
4.根据权利要求1所述的基于纳米材料检测活细菌的方法,其特征在于:所述菌液添加量为菌体数量为103-108CFU。
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