CN105891167A - Dna修饰的光子晶体薄膜荧光传感器检测金属离子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测金属离子的DNA修饰的光子晶体薄膜荧光传感器的制备，具体方法为：在光子晶体薄膜表面修饰含有特定碱基的荧光标记的DNA分子，把光子晶体对特定波长光的强反射性能与DNA碱基与金属离子选择性配位的性质相结合，提高检测的灵敏度、选择性；同时，选取合适物种洗脱被检测离子，实现荧光传感器的可再生性，最终制备得到高灵敏、高选择性、可再生性光子晶体薄膜荧光传感器，这对重金属离子的高效检测具有重要的意义，也为未来设计和开发功能更复杂的其它金属离子高灵敏传感器提供一种全新的设计思路和方法。

Description

DNA修饰的光子晶体薄膜荧光传感器检测金属离子

技术领域

本发明涉及金属离子检测领域，具体的说，是涉及一种荧光传感器的制备方法。该传感材料是一种DNA修饰的光子晶体薄膜材料，利用光子晶体布拉格镜面反射提高荧光检测灵敏度，可用于提高金属离子的检测线，更加有效的检测环境污染中的金属离子。

背景技术

长期以来，重金属污染受到人们的广泛关注，工业活动导致的汞、镉、铅、铬、铜等重金属污染的生物毒性非常显著，给人类健康和环境造成极大危害。以汞为例，无机汞离子进入人体后可转换为毒性更大的有机汞，尤其是甲基汞，经食物链进入人体后很容易被吸收并输送到全身各器官，特别是肝、肾和脑组织，造成永久性损伤。研究表明，人体中汞的安全浓度是0.1μg·mL^-1，当浓度达到0.5-1.0μg·mL^-1时人体就会出现明显的中毒症状，从而引发一系列神经、精神等方面的疾病。因此，建立一种能准确快速测定痕量重金属离子的方法具有重要的意义。

常规的重金属离子检测通常采用原子吸收光谱、原子发射光谱和冷原子荧光光谱法、等离子体电感耦合质谱法(ICP-MS)、比色法、电化学方法等。这些方法或者依赖大型仪器，需要较长的分析周期，或者预处理过程繁琐耗时，不能满足实际环境监测中高效低成本的需要。

荧光分析法是根据物质的分子荧光进行定性和定量分析的一种强有力的检测低浓度物质的光学分析技术，具有很高的灵敏性和选择性，检测下限通常比吸收光度法低2-4个数量级，所以在分析化学中有着广泛的应用和巨大的前景。目前，基于荧光分析法检测重金属离子的研究，主要是利用荧光基团与重金属离子之间的相互作用使荧光强度发生变化，常用检测物有：有机小分子[Domaille D.W.，Que E.L.，Chang C.J.，Nat.Chem.Biol.，2008，4，168；Kim H.J.，Park J.E.，Choi M.G.，Ahn S.，Chang S.，DyesPigm.，2010，84，54.]，聚合物[Lu H.，Tang Y.，Xu W.，Zhang D.，Wang S.，Zhu D.，Macromol.RapidCommun.，2008，29，1467；XHuang.，Xu Y.，Zheng L.，Meng J.，Cheng Y.，Polymer，2009，50，5996.]、蛋白质[Wegner S.V.，Okesli A.，ChenP.，He C.，J.Am.Chem.Soc.，2007，129，3474；Bozkurt S.S.，Cavas L.，Appl.Biochem.Biotechnol.，2009，158，51.]、DNA[Ono A.，Togashi H.，Angew.Chem.Int.Ed.，2004，43，4300；Xu J.，Song Z.，Fang Y.，Mei J.，Jia L.，Qin A.J.，Sun J.Z.，Ji J.，Tang B.Z.，Analyst，2010，135，3002.]等。尤其是，DNA的碱基与重金属离子之间可以发生高度专一的配位作用[X Huang.，Xu Y.，Zheng L.，Meng J.，Cheng Y.，Polymer，2009，50，5996.]，类似于碱基对之间形成的Watson-Crick碱基配对，对重金属离子具有比其它探针分子更为优越的高选择性识别；此外，有机小分子等检测剂与重金属离子主要发生不可逆化学反应，只能进行一次性检测，而DNA碱基与重金属离子之间的配位结构可以通过其它与重金属离子结合作用更强的物质打开，且不影响DNA分子的结构，所以该配位作用的发现对重金属离子检测技术的研究及进一步的实际应用有着很大帮助。如Ono[Ono A.，Togashi H.，Angew.Chem.Int.Ed.，2004，43，4300.]、Chang[Chiang C.，Huang C.，Liu C.，Chang H.，Anal.Chem.，2008，80，3716.]等人设计合适的DNA分子，通过胸腺嘧啶T与Hg²⁺(T-Hg²⁺-T配位结构)、胞嘧啶C与Ag⁺(C-Ag⁺-C配位结构)等碱基与重金属离子之间的配位作用，改变DNA分子的构象，从而改变荧光性质，实现了对Hg²⁺、Ag⁺的高灵敏检测。利用碱基与重金属离子的配位作用，同样实现了对Cu^2+[19，20]、Pb^2+[21]等重金属离子的检测。

近年来，光子晶体(photonic crystals)技术的发展，光子晶体对特定波长光的调控和增强自发辐射作用，为提高荧光检测灵敏度提供了新的途径，为金属离子的快速灵敏检测带来了新的契机。光子晶体是一种介电常数不同的材料周期性排列，使特定频率的光无法穿越此晶体而会被强烈的反射，即具有光子禁带的特性。光子晶体制备方法简单、成本低廉，其独特的光学特性使它们在化学和生物传感器、环境监测等方面具有巨大的科学价值和应用潜力，从而格外受到关注。当光的频率落在光子晶体的光子禁带范围内时，即特定频率的光与光子禁带相匹配时，就会被光子晶体强烈的反射。我们已利用此特性，选择激发波长或发射波长与光子禁带相匹配的荧光物种，实现了物质固态荧光的极大增强[Zhang Y.，Wang J.，Ji Z.，Hu W.，Jiang L.，Song Y.，Zhu D.，J.Mater.Chem.，2007，17，90]。Cunningham研究组[Mathias P.C.，Ganesh N.，Cunningham B.T.，Anal.Chem.，2008，80，9013.]发展了以光子晶体增强荧光信号为基础的生物传感器，如对蛋白质等生物分子的检测以及细胞免疫测定等。Li等人[Li M.，He F.，Liao Q.，Liu J.，Xu L.，Jiang L.，SongY.，Wang S.，Zhu D.，Angew.Chem.Int.Ed.，2008，47，7258.]在光子晶体表面利用荧光共振能量转移原理，通过光子晶体对荧光信号的放大作用，实现了对DNA的高灵敏检测。

而对于光子晶体检测金属离子，Asher研究组[Reese C.E.，Asher S.A.，Anal.Chem.，2003，75，3915.]制备了“聚合晶体胶体阵列”(PCCA)离子传感材料，可选择性地结合金属离子如：Pb²⁺、Ba²⁺、K⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺和Zn²⁺等，通过PCCA中的晶格间距增大导致布拉格衍射峰红移实现了对金属离子的检测，但这种方法选择性差，灵敏度不高。Cui等人[Cui L.，Shi W.，Wang J.，Song Y.，Ma H.，Jiang L.，Anal.Methods，2010，2，448.]把蛋白石型光子晶体浸入罗丹明B硫内酯化合物作为探针分子的Hg²⁺检测液中，研究发现光子晶体光子禁带的蓝带边匹配荧光波长时能够增强检测荧光4.3倍，Hg²⁺最低检测限10nM，但这种方法是检测物填充在光子晶体缝隙中，并没有利用光子晶体优越的布拉格反射特性，故荧光增强有限，检测的灵敏度并没有得到显著的提高；此外，检测液与重金属离子发生不可逆反应，只能使用一次，检测成本较高。

上述文献中报道的检测重金属离子都是在溶液中完成的均相检测，这种均相荧光传感器易污染待测体系，且只能一次性使用。将均相荧光传感器固定于基质表面制备成薄膜荧光传感器则基本可以克服上述缺点，实现传感器的重复使用，减少污染。目前，已有薄膜荧光传感器用于溶液中重金属离子检测的报道[GuoZ.，Zhu W.，Tian H.，Macromolecules，2010，43，739.]，但存在部分荧光物种在固态时由于聚集而荧光减弱从而导致检测灵敏度降低、检测剂与待测物发生不可逆化学反应等问题，这必然会导致传感器件识别能力降低，从而影响传感器的灵敏度及可重复使用性。

发明内容

本发明把光子晶体对特定波长光的强反射性能与DNA碱基与金属离子配位的性质相结合，利用光子晶体可以极大地增强与光子禁带相匹配的荧光的强度，放大荧光信号，在光子晶体薄膜表面修饰含有特定碱基的DNA分子，在其与金属离子选择性配位后分子的构象发生变化，能够引起荧光信号的变化，提高检测的灵敏度，制备高灵敏、高选择性检测金属离子的薄膜荧光传感器；此外，以巯基丙氨酸等试剂为洗脱剂，夺取与DNA碱基配位的金属离子，使DNA分子的构象恢复，使所制薄膜荧光传感器的可重复使用。这对重金属离子的高效检测具有重要的意义，也为未来设计和开发功能更复杂的其它金属离子高灵敏传感器提供一种全新的设计思路和方法。

本发明的DNA修饰的光子晶体薄膜荧光传感器检测金属离子的方法步骤包括：

(1)设计含有特定碱基的荧光标记的DNA单链分子，研究其与相匹配重金属离子作用的荧光性质。利用荧光光谱表征DNA分子与重金属离子配位前后的荧光性质。

(2)制备具有不同光子禁带的光子晶体，选择禁带与荧光波长相匹配的光子晶体。合成不同粒径的单分散聚合物微球，在恒温恒湿条件下竖直沉积制备具有不同光子禁带的光子晶体。通过透射电子显微镜、扫描电子显微镜对相应的结构、形貌进行表征，通过反射和透射光谱对光子禁带进行表征，选择光子禁带与荧光波长相匹配的光子晶体。

(3)禁带匹配的光子晶体薄膜表面修饰特定的DNA分子。在光子禁带与荧光波长相匹配的光子晶体表面组装特定的DNA分子。所设计的DNA分子，一端带有特定官能团，能与光子晶体表面的活性基团或引入的活性基团如-COOH、-CONH₂、Au等通过化学键进行自组装。如，采用离子溅射技术在光子晶体表面制备金膜，选用一端带有巯基(-SH)一端带有荧光基团的含有胸腺嘧啶T的DNA分子，通过Au与-SH自组装的方法在光子晶体表面修饰DNA分子。

(4)重金属离子与DNA修饰的光子晶体薄膜荧光传感器的作用。通过荧光强度变化研究重金属离子与修饰了DNA分子的光子晶体薄膜之间的灵敏度、选择性等性质，找出变化规律，得到高灵敏、高选择性的光子晶体薄膜荧光传感器。通过荧光显微镜观察作用前后光子晶体的荧光图像，研究光子禁带、响应时间、金属离子浓度等参数对荧光的影响；计算荧光淬灭效率、最低检测限等。

(5)光子晶体薄膜荧光传感器的可再生性研究。研究修饰了DNA分子的光子晶体薄膜荧光传感器检测重金属离子的可重复使用性，即可再生性。如研究光子晶体薄膜荧光传感器与Hg²⁺响应、随后与巯基丙氨酸作用的荧光变化过程，研究薄膜荧光变化的可逆性。

(6)制备高灵敏、高选择性、可再生性光子晶体薄膜荧光传感器。选择和优化材料体系，采用光子晶体薄膜表面修饰特殊DNA分子的方法，通过调控制备参数和条件，制备出高灵敏度、高选择性、可再生性的检测重金属离子(如Hg²⁺，Ag⁺，Cu²⁺、Pb²⁺等)的光子晶体薄膜荧光传感器。如设计合适的含有胞嘧啶C或T的DNA分子，根据C与Ag⁺之间特殊的专一配位作用形成C-Ag⁺-C结构或T与Hg²⁺，实现对Ag⁺、Hg²⁺的高效检测。

本发明的制备方法中，对DNA和光子晶体的选择的基本要求是：光子晶体的光子禁带位置与DNA荧光的发射峰位相匹配，即光子晶体的反射峰位与荧光的发射峰位相接近，这样光子晶体才能对DNA发出的荧光具有反射的作用从而达到增强荧光强度的目的。所用的光子晶体的种类有：不同粒径大小(195～255nm)的聚(苯乙烯-丙烯酰胺)的乳液通过自组装沉积成膜。

本发明主要是利用三维光子晶体的光子禁带性质，即对于在光子禁带的频率范围内光不能透过而被反射的性质，在光子晶体薄膜表面修饰含有特定碱基的荧光标记的DNA单链分子，光子晶体反射膜的作用使DNA的荧光强度有很大的增强。

本发明的优点在于：

1.本发明把光子晶体强反射性能与DNA与重金属离子高选择性识别性质相结合，制备的重金属离子薄膜荧光传感器具有高灵敏性、高选择性。利用光子晶体对特定波长光的强反射作用，放大荧光信号的变化，提高荧光检测的灵敏度；利用DNA碱基与重金属离子高度专一的配位作用，提高检测的选择性；并解决传统重金属离子传感器中检测剂处于溶液状态，易污染检测体系的问题，使重金属离子的实际检测更为方便、快捷，为开发新型薄膜荧光传感器提供一个全新的研究思路

2.本发明优势在于实现重金属离子薄膜荧光传感器的可再生性。选择与重金属离子作用更强的物质，洗脱薄膜传感器上已有的被检测物，从而实现器件的可再生性，解决传统传感器中检测剂与待测物发生不可逆反应，只能一次性使用的问题。

附图说明

附图1：粒径分别为195nm(a)、217nm(b)、234nm(c)和255nm(d)的P(St-AM)核壳微球制备的光子晶体薄膜的俯视SEM照片；a′、b′、c′、d′分别为其相应的侧面图

附图2：粒径分别为195、217、234和255nm的P(St-AM)核壳微球制备的光子晶体(实线)以及喷金处理后(短线)的反射光谱；

附图3：粒径分别为195、217、234和255nm的P(St-AM)核壳微球制备的光子晶体的透射光谱及DNA分子的荧光光谱(黑色线)

附图4：不同禁带的修饰DNA的光子晶体薄膜592nm处的荧光强度(λ_em＝592nm，λ_ex＝488nm)

附图5：修饰DNA的黄色光子晶体与0.2μM的Hg²⁺作用不同时间后的荧光光谱(a)、荧光强度(b)及与Hg²⁺作用前(c)和作用30min后(d)的荧光显微镜照片；

附图6：DNA修饰的光子晶体薄膜与不同浓度的Hg²⁺作用的荧光光谱(a)及荧光淬灭效率(b)；

附图7：修饰DNA的光子晶体薄膜在浓度为1.0μM的不同金属离子溶液中浸泡30min后592nm处的荧光淬灭效率；

附图8：DNA修饰的黄色光子晶体薄膜检测Hg²⁺的循环实验中592nm处的荧光强度变化；

附图9：绿色光子晶体薄膜(a)及旋涂纳米C₆₀(b)后的扫描电镜照片；

附图10：DNA-C₆₀-光子晶体(不同光子禁带)复合薄膜与300nMAg⁺作用前后的荧光增强倍数(a)及绿色光子晶体薄膜的荧光光谱变化(b)；

附图11：不同浓度的Ag⁺与DNA-C₆₀-光子晶体复合薄膜作用后的荧光强度。

具体实施方案

实施例1

1.光子晶体增强的高效DNA汞离子(Hg²⁺)薄膜荧光传感器

1.1聚(苯乙烯-丙烯酰胺)光子晶体的制备

利用乳液聚合法制备不同粒径的聚(苯乙烯-丙烯酰胺)(P(St-AM))微球，采用竖直沉积法于恒温恒湿条件下在硅基底上P(St-AM)乳胶微球自组装成膜。硅片在铬酸洗液中超声清洗，蒸馏水冲洗干净后竖直放置于装有浓度为～0.2wt％的单分散P(St-AM)水乳液的小瓶中，在恒温恒湿箱中于80℃、湿度80％的条件下自组装成膜约48h，即得到呈不同颜色的光子晶体薄膜。用扫描电子显微镜对其表面形貌和膜厚度进行了表征(附图1)。用反射光谱和透射光谱对其光子禁带进行了表征(附图2，3)。

1.2P(St-AM)光子晶体上DNA分子的修饰

沉积在Si基底上的光子晶体薄膜在真空条件下喷金，电流为2mA，时间为1min。配制10nM DNA(碱基序列为：5′-(SH)-(CH₂)₆-CCTCTCTTTCTCCCCTgTTTgTgT(RhodamineGreen)-3′)水溶液，将喷金的光子晶体薄膜浸于其中1h，则会在喷金的光子晶体薄膜表面组装上DNA分子。这是由于所用DNA分子一端带有活性基团巯基，可通过Au-S键进行自组装。然后水洗，氮气吹干，备用。四种不同禁带的光子晶体修饰DNA后测其荧光性质，选择荧光最强的光子晶体(DNA荧光波长与禁带相匹配)，即禁带在579nm的黄色光子晶体(附图4)。

1.3Hg²⁺的检测

修饰了DNA分子的黄色光子晶体薄膜浸入不同浓度的Hg²⁺水溶液中一定时间，然后水洗，氮气吹干。以荧光共聚焦显微镜测其荧光光谱，并记录荧光图像。测试电压1000V，扫速4S，间距2nm，测试范围520-620nm，激发波长488nm，输出功率90％。所制备的对照样用同样的方法和条件进行测试，以作对比。每个样品平行测定五次，荧光强度取其平均值。通过荧光显微镜观察作用前后光子晶体的荧光图像，研究灵敏度、选择性，研究光子禁带、响应时间、金属离子浓度等参数对荧光的影响；计算荧光淬灭效率、最低检测限等，见附图5-8。

所制含有特定碱基的的DNA分子修饰光子晶体薄膜，在其与金属粒子选择性配位后构象转变，从而引起荧光性质发生变化，利用光子晶体对特定波长光的强反射性能，放大荧光信号的变化，提高了荧光检测的灵敏度，制备了高灵敏(Hg²⁺最低检测限4nM)、高选择性、可再生性薄膜荧光传感器。

2.检测Ag⁺的DNA-C₆₀-光子晶体复合薄膜荧光传感器

2.1聚(苯乙烯-丙烯酰胺)光子晶体的制备

利用乳液聚合法制备不同粒径的聚(苯乙烯-丙烯酰胺)(P(St-AM))微球，采用竖直沉积法于恒温恒湿条件下在硅基底上P(St-AM)乳胶微球自组装成膜。硅片在铬酸洗液中超声清洗，蒸馏水冲洗干净后竖直放置于装有浓度为～0.2wt％的单分散P(St-AM)水乳液的小瓶中，在恒温恒湿箱中于80℃、湿度80％的条件下自组装成膜约48h，即得到呈不同颜色的光子晶体薄膜。用扫描电子显微镜对其表面形貌和膜厚度进行了表征(附图9)。用反射光谱和透射光谱对其光子禁带进行了表征。

1.2P(St-AM)光子晶体上DNA分子的修饰

在绿色光子晶体表面旋涂纳米C₆₀，然后浸入含有胞嘧啶C标记荧光素FAM的DNA单链分子的水溶液中30min，其碱基序列为5′-FAM-CTCTCTTCTCTTCATTTTT CAACACAACACAC-3′。四种不同禁带的光子晶体修饰DNA后测其荧光性质，选择荧光最强的光子晶体(DNA荧光波长与禁带相匹配)，即禁带在525nm的绿色光子晶体(附图10)。

1.3Ag⁺的检测

修饰了DNA分子的绿色光子晶体薄膜浸入不同浓度的Ag⁺水溶液中一定时间，然后水洗，氮气吹干。测其荧光光谱。每个样品平行测定五次，荧光强度取其平均值。利用DNA碱基与纳米C₆₀之间的π-π堆积相互作用，该DNA单链分子吸附在纳米C₆₀的表面，而这种吸附作用导致荧光基团的荧光淬灭。所制C₆₀-光子晶体薄膜与Ag⁺作用形成C-Ag⁺-C配位，吸附在C₆₀表面的单链DNA构象发生转变，形成“发卡型”结构，因而从C₆₀表面脱离，荧光基团恢复荧光，利用光子晶体对特定波长的光具有强布拉格反射的特性，选择禁带匹配的绿色光子晶体，可以实现对荧光信号的放大，引起该薄膜表面荧光强度发生明显变化，实现对Ag+的高灵敏检测。研究灵敏度、选择性，研究光子禁带、响应时间、金属离子浓度等参数对荧光的影响；计算荧光淬灭效率、最低检测限等，见附图11。

所制含有特定碱基的的DNA分子修饰光子晶体薄膜，在其与金属粒子选择性配位后构象转变，从而引起荧光性质发生变化，利用光子晶体对特定波长光的强反射性能，放大荧光信号的变化，提高了荧光检测的灵敏度，制备了高灵敏(Ag²⁺最低检测限5nM)、高选择性。

Claims (3)

1.一种DNA修饰的光子晶体荧光传感器检测金属离子的制备方法，其特征在于：含有特定碱基的荧光标记的DNA单链分子修饰在光子晶体薄膜表面，可用过化学键或其他作用进行修饰，选择光子禁带与荧光波长相匹配的光子晶体，利用其布拉格反射特性增强荧光，放大荧光信号的变化，提高检测灵敏度；同时，利用特定碱基与金属离子的专一配位作用，提高检测选择性；选取合适物种洗脱被检测金属离子，实现荧光传感器的可再生性。

2.一种DNA修饰的光子晶体荧光传感器检测金属离子的制备方法，其特征在于：选取含胸腺嘧啶T的罗丹明G标记的DNA分子，在喷金的光子晶体表面通过Au-S键组装DNA分子，利用T与Hg²⁺之间的选择性配位，同时利用光子晶体的布拉格反射增强荧光，并以巯基丙氨酸为洗脱剂，实现高灵敏、高选择性、可再生性检测Hg²⁺，最低检测限4nM。

3.一种DNA修饰的光子晶体荧光传感器检测金属离子的制备方法，其特征在于：在绿色光子晶体表面旋涂纳米C₆₀，然后浸入含有胞嘧啶C标记荧光素FAM的DNA单链分子。所制C₆₀-光子晶体薄膜与Ag⁺作用形成C-Ag⁺-C配位，吸附在C₆₀表面的单链DNA构象发生转变，形成“发卡型”结构，荧光发生变化，利用光子晶体对特定波长的光具有强布拉格反射的特性，选择禁带匹配的绿色光子晶体，可以实现对荧光信号的放大，引起该薄膜表面荧光强度发生明显变化，实现对Ag+的高灵敏检测，最低检测限5nM。