CN113252621A

CN113252621A - 一种细胞内Hg2+和Ag+的同时荧光成像方法

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Publication number: CN113252621A
Application number: CN202010089345.4A
Authority: CN
Inventors: 王卫; 唐凯; 王世颖; 李欣; 万均; 罗细亮
Original assignee: Qingdao University of Science and Technology
Current assignee: Qingdao University of Science and Technology
Priority date: 2020-02-12
Filing date: 2020-02-12
Publication date: 2021-08-13

Abstract

Hg²⁺和Ag⁺是两种具有严重毒性的、分布广泛的环境污染物，即使在低浓度下也会对环境和人类构成严重威胁，造成严重且永久的损害。本发明提出了一种细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像方法，该方法采用纳米胶囊‑核酸生物分子复合物能够灵敏、高效地实现对细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像，本发明提出并构建的纳米胶囊‑核酸生物分子复合物具有结构简单、生物相容性好、设计巧妙、制备简单、性能稳定、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、对Hg²⁺和Ag⁺特异性强、响应时间短、便于实时监测等诸多优点，能够方便、快捷地实现细胞内Hg²⁺和Ag⁺的高灵敏、高选择性的同时荧光成像。

Description

一种细胞内Hg2+和Ag+的同时荧光成像方法

技术领域

本发明涉及Hg²⁺和Ag⁺的同时成像，具体涉及一种用于细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像的纳米胶囊-核酸生物分子复合物及其制备方法，属于环境监测及纳米生物技术领域。

背景技术

汞离子(Hg²⁺)和银离子(Ag⁺)是两种具有严重毒性的金属离子，也是广泛分布的环境污染物，即使在低浓度下也会对环境和人类构成严重威胁，造成严重的、永久的损害。更为严重的是，通过受污染的水体，Hg²⁺和Ag⁺可以在农产品和水产品中不断积累，进入人类的食物链。如果长时间暴露于受到Hg²⁺和Ag⁺污染的环境中，会导致人类身体的、神经系统的退行性疾病的缓慢发生。为此，世界卫生组织(WHO)和美国环保署(EPA)都分别对饮用水的标准作出严格的限定。其中，美国环境保护署(EPA)提出了饮用水中汞的最大容许值为10nM，饮用水中最大Ag⁺含量是50μg/L。因此，建立灵敏、准确、高效的同时检测Hg²⁺和Ag⁺的分析方法对于环境监测、食品安全和生物医药等领域至关重要。

目前，用于同时检测Hg²⁺和Ag⁺的检测方法远远少于单个离子的检测方法，可采用的传统技术主要包括电感耦合等离子体质谱法(ICP-AES)、原子吸收/发射光谱法和极谱法等方法。但是，这些方法常常需要繁杂的操作、耗时的分析和贵重、复杂的仪器设备等，限制了它们在资源有限的环境中的使用。由于荧光传感技术具有灵敏、简单、快捷等优点而得到日益广泛的研究。不可否认，文献报道的方法存在检测灵敏度不高、选择性不足等问题。为了克服这些缺点，迫切需要开发出既简单、灵敏、又经济、高效的测定方法来满足生物、环境、医药等领域对Hg²⁺和Ag⁺的同时检测的需求。

据文献报道，当金属离子进入错配的DNA碱基对时，金属离子和DNA碱基对之间会产生一种吸引力，将它们结合在一起。例如，Ag⁺进入胞嘧啶环境后，通过特异性的识别反应，形成结构稳定的胞嘧啶-Ag⁺-胞嘧啶碱基对配位复合物；与Ag⁺类似，Hg²⁺也能够特异性地和核苷酸“桥连”，选择性地识别胸腺嘧啶碱基并形成强而稳定的胸腺嘧啶-Hg²⁺-胸腺嘧啶配位复合物。

正是由于Hg²⁺和Ag⁺分别对胸腺嘧啶、胞嘧啶碱基对的特异性的识别作用而形成结构稳定的金属-碱基对配位复合物，该作用对于这两种金属离子的高灵敏、高特异性检测具有重要意义。本发明根据Hg²⁺和Ag⁺的这一反应特性，将其分别与富含胸腺嘧啶、胞嘧啶的核酸生物分子相结合，巧妙地应用到具有中空、多孔结构的纳米材料领域，为Hg²⁺和Ag⁺的同时、高灵敏检测及成像提供了新型、特异、高效的检测技术。迄今为止，采用中空多孔纳米材料、利用碱基错配对两种金属离子的生物识别作用构建纳米胶囊-核酸生物分子复合物用于细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时成像技术还未见文献报道。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，针对基于生物分子识别技术的纳米胶囊-核酸生物分子复合物用于同时检测Hg²⁺和Ag⁺的技术未见报道，因此，本发明的第一目的：提出并构建一种新型的可同时检测Hg²⁺和Ag⁺的纳米胶囊-核酸生物分子复合物，具体是利用中空、多孔的纳米金作为纳米胶囊，分别设计并合成可被Hg²⁺和Ag⁺识别的核酸生物分子，并将其分别组装到纳米胶囊表面，一方面作为堵孔材料用于封堵纳米胶囊的孔口，防止孔内物质的外泄；另一方面分别作为Hg²⁺和Ag⁺的识别分子可与Hg²⁺和Ag⁺发生特异性的碱基错配识别反应，形成稳定的T-Hg²⁺-T、C-Ag⁺-C碱基对的同时发生构象转化而脱离纳米胶囊表面，从而使封堵的孔口被打开，纳米胶囊内的染料分子得以释放，分离上清液，在不同波长的激发光照射下产生荧光发射，根据荧光发射信号的强弱实现对Hg²⁺和Ag⁺的同时检测。该技术可实现对于含量低至痕量的Hg²⁺和Ag⁺样品的高灵敏、高选择性的同时检测与成像。即便样品中同时含有极微量的Hg²⁺和Ag⁺，也能够获得令人满意的检测结果。本发明的第二目的：提供一种细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像方法。

本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。本发明提出的可同时检测Hg²⁺和Ag⁺的纳米胶囊-核酸生物分子复合物是以中空、多孔结构的纳米金作为纳米胶囊，利用其中空、多孔的结构特性，在其内部分别装载客体分子如荧光染料；为了实现对Hg²⁺和Ag⁺的同时检测，分别设计并合成了2种核酸生物识别分子，通过对碱基种类及其数量的设计，确保其对且仅对目标金属离子Hg²⁺或Ag⁺具有特异性的响应，而对其它任何共存离子和干扰离子没有响应。在此基础上，又对采用的2种荧光信号分子进行了相关的实验和筛选，为了克服同时采用的2种荧光分子之间的相互干扰和使用条件的限制，综合考虑溶解性好、荧光强、Stokes位移大、光学性质稳定、信噪比高、无光漂白、受环境影响小、生物相容性好等性能，最终选择采用的荧光染料优选罗丹明B和荧光素Cy5。结果表明，两种荧光信号分子的选择和使用成为本发明的关键条件之一。为了实现生物分子对Hg²⁺和Ag⁺的特异性识别，同时也为了防止荧光信号分子的泄漏，本发明分别设计并合成了可分别被Hg²⁺和Ag⁺识别的生物分子，并将其分别组装到纳米胶囊表面用于封堵孔口，起到防止孔内荧光分子外泄的作用；所述的可分别识别Hg²⁺和Ag⁺的生物分子是经过特别设计并合成的、具有一定碱基长度的分别富含胸腺嘧啶、胞嘧啶的核酸生物分子，其中，特异性识别Hg²⁺的碱基序列为：5’-TTT GTTTGT TGG AAAACC TTC TTT CTTA-3’，特异性识别Ag⁺的碱基序列为：5’-ACC ACC CAC CAAGGAATT CCT CCC TCC T-3’，由于这2种序列对且仅对相应的金属离子有响应，因此，该检测体系能够完全避免相互干扰，确保同时检测的准确性和特异性。

作为可分别识别Hg²⁺和Ag⁺的两种核酸生物分子是通过静电组装方式被分别组装到中空、多孔结构的纳米金表面，而纳米金表面则需要通过采用正电荷修饰剂进行预先修饰，优选采用地正电荷修饰剂是聚二烯丙基二甲基氯化铵。当靶标Hg²⁺和Ag⁺存在时，被组装到纳米胶囊表面的核酸生物分子分别对Hg²⁺和Ag⁺发生特异性的响应，两种离子分别与其相应的核酸生物分子特异性结合，使其构象发生改变，从纳米胶囊表面脱落，使封堵的孔口被打开，从而导致RhB和Cy5从纳米胶囊内部被释放出来。对释放出的两种荧光染料分别给予相应波长的激发，均得到显著增强的两种染料的荧光信号。当加入不同浓度的Hg²⁺和Ag⁺时，荧光信号与加入的离子浓度呈现良好的线性关系。因此，根据测得的荧光信号强度就可以实现对Hg²⁺和Ag⁺的同时检测。

一种制备本发明提出的可同时检测Hg²⁺和Ag⁺的纳米胶囊-核酸生物分子复合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)通过选择不同种类及其数量的碱基，分别设计并合成了2种核酸生物识别分子，确保其分别对且仅对目标金属离子Hg²⁺或Ag⁺具有特异性的响应，而对其它任何共存离子和干扰离子没有响应；

(2)在具有中空、多孔结构的纳米金载体溶液中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，10-12h后离心分离，用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液清洗；

(3)加入荧光分子罗丹明B溶液，10-12h后加入可识别Hg²⁺的核酸生物分子溶液，10-12h后离心分离，用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液清洗，备用；

其中，所述的可识别Hg²⁺的核酸生物分子的碱基序列为5’-TTT GTT TGT TGG AAAACC TTC TTT CTTA-3’；

(4)重复执行步骤(2)后加入荧光分子Cy5溶液，10-12h后加入可识别Ag⁺的核酸生物分子溶液，10-12h后离心分离，用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液清洗，备用；

其中，所述的可识别Ag⁺的核酸生物分子的碱基序列为5’-ACC ACC CAC CAA GGAATT CCT CCC TCC T-3’；

(5)将(3)步和(4)步所得产物分别用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液稀释后混合，离心分离，即可制得用于细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时成像的纳米胶囊-核酸生物分子复合物。

一种本发明提出的细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像的方法，包括以下步骤：

(1)取适量细胞悬浮液，用含有Hg²⁺和Ag⁺的溶液对细胞进行培养后离心，移除上清液；

(2)加入本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物溶液进行细胞孵育，10-50min后分别给予相应波长的激发进行细胞内Hg²⁺和Ag⁺的激光共聚焦扫描成像，所述的细胞是Hela细胞。

本发明的有益效果：本发明提出的可同时检测Hg²⁺和Ag⁺的纳米胶囊-核酸生物分子复合物不但能够实现对Hg²⁺和Ag⁺的同时检测，还能够实现细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像，解决了目前成像技术单一、难以高效、灵敏、快捷地同时进行多种离子的荧光成像问题。

结果表明，与现有技术相比，采用该体系同时检测Hg²⁺和Ag⁺的检测灵敏度得到显著提高，可同时实现对Hg²⁺和Ag⁺的高灵敏、高选择性的检测。尤为重要的是，所设计合成的2种核酸生物识别分子分别对且仅对目标金属离子Hg²⁺或Ag⁺具有特异性的响应，而对其它任何共存离子和干扰离子没有响应。当样品中仅含其中一种金属离子Hg²⁺或Ag⁺时，该体系也能灵敏地检测出所含金属离子对应的荧光信号。因此，本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物除了用于Hg²⁺和Ag⁺的同时检测，也可用于仅含Hg²⁺或Ag⁺的样品的单独检测，三种检测体系均能获得高灵敏、高选择性的检测结果。

本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物具有结构简单、易合成、性能优异、稳定、适用范围广、高效、灵敏等优点，并且不会受到其它常见干扰物质如Cd²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺等金属离子的影响，具有高的特异性和选择性。实验结果表明，相比于其它常见的技术方法，采用本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物对Hg²⁺和Ag⁺进行了同时检测，显示出高灵敏度和优异的选择性，对Hg²⁺的检测限低至8.24×10^-14M；对Ag⁺的检测限低至5.11×10^-14M。同时，还获得了对Hg²⁺和Ag⁺的更宽的检测范围。

采用本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物用于细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像，具有结构简单、生物相容性好、设计巧妙、制备简单、性能稳定、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、对Hg²⁺和Ag⁺特异性强、响应时间短、便于实时监测等诸多优点，能够方便、快捷地实现细胞内Hg²⁺和Ag⁺的高灵敏、高选择性的同时荧光成像。

附图说明

图1.利用纳米胶囊-核酸生物分子复合物同时对Hela细胞内Hg²⁺和Ag⁺的共聚焦荧光显微成像照片，其中，D和E为暗场照片，F为D和E叠加后的明场照片。

具体实施方式

以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

下面通过实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。

实验仪器：THZ-82A气浴恒温振荡器(金坛市医疗器械厂)；Leica TCS SP5 II激光共聚焦扫描仪(德国莱卡公司)。

实验试剂：罗丹明B(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；Cy5(Solarbio，北京索莱宝科技有限公司)；聚二烯基丙二甲基氯化铵(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；3-4μm巯基磁珠(天津市倍思乐色谱技术开发中心)；特异性识别Hg²⁺的核酸碱基序列为5’-TTTGTT TGT TGG AAAACC TTC TTT CTTA-3’，特异性识别Ag⁺的核酸碱基序列为5’-ACCACC CACCAAGGAATT CCT CCC TCC T-3’(上海生工生物工程股份有限公司)，MOPS缓冲溶液pH＝7.0，浓度为0.01M(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

实施例1：

一种可用于细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像的纳米胶囊-核酸生物分子复合物的制备方法，包括如下步骤：

(2)在400μL具有中空、多孔结构的纳米金载体溶液中加入200μL 11.664mg/mL的聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，37℃10h后离心分离，用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液清洗；

(3)加入罗丹明B溶液2μL(终浓度1.0×10^-5mol/L)，用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液稀释至100μL，37℃10h后加入10μL可识别Hg²⁺的核酸生物分子溶液(终浓度1.0×10^-6mol/L)，37℃10h后离心分离，用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液清洗，备用；

(4)重复执行步骤(2)后加入荧光分子Cy5溶液2μL(终浓度1.0×10^-5mol/L)，用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液稀释至100μL，37℃10h后加入10μL可识别Ag⁺的核酸生物分子溶液(终浓度1.0×10^-6mol/L)，37℃10h后离心分离，用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液清洗，备用；

其中，所述的可识别Ag⁺的核酸生物分子的碱基序列为5’-ACCACC CAC CAAGGAATT CCT CCC TCC T-3’；

(5)将(3)步和(4)步所得产物分别用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液稀释后混合，离心分离，即可制得同时检测Hg²⁺和Ag⁺的纳米胶囊-核酸生物分子复合物；

所述的具有中空、多孔结构的纳米金材料按文献方法获得(W.Wang,C.Chen,X.Li,S.Y.Wang andX.L.Luo.Chem.Commun.,2015,51,9109–9112.)。

实施例2:

一种细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像的方法，包括如下步骤：

(1)取适量细胞悬浮液，离心分离，移除上清液，加入100μL含有Hg²⁺和Ag⁺的、浓度均为1.0×10^-12M的溶液培养细胞，37℃、20.0min后离心，移除上清液；

(2)用MOPS缓冲溶液稀释实施例1中制得的纳米胶囊-核酸生物分子复合物，将其加入到上步处理好的细胞中，置于37℃恒温水浴箱孵育细胞15.0min；

(3)将孵育好的细胞置于共聚焦显微镜的载物台上，分别采用激发波长535nm、648nm进行细胞内Hg²⁺和Ag⁺的激光共聚焦扫描成像；

其中，所述的细胞是Hela细胞。

实验结果表明，采用该体系同时检测Hg²⁺和Ag⁺，在确保高特异性的前提下，灵敏度得到显著提高，检测限低至：8.24×10^-14M和5.11×10^-14M；同时，还获得了对Hg²⁺和Ag⁺的更宽的线性检测范围，获得的线性检测范围分别为：1.0×10^-13～1.0×10^-7M和1.0×10^-13～1.0×10^-8M；尤为重要的是，该体系中采用的2种核酸生物识别分子分别对且仅对目标金属离子Hg²⁺或Ag⁺具有特异性的响应，而对其它任何共存离子和干扰离子没有响应。当样品中仅含其中一种金属离子Hg²⁺或Ag⁺时，该体系也能灵敏地检测出所含金属离子的准确含量而不会受到任何干扰。因此，本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物除了用于Hg²⁺和Ag⁺的同时检测及成像，也可用于仅含Hg²⁺或Ag⁺的样品的单独检测及成像，三种检测体系均能获得高灵敏、高选择性的检测及成像结果。

采用本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物对细胞进行孵育后，通过内吞作用进入细胞，组装在纳米胶囊表面的核酸生物识别分子与细胞内的Hg²⁺和Ag⁺发生特异性的分子识别反应，形成稳定的T-Hg²⁺-T、C-Ag⁺-C碱基对的同时发生构象转化而脱离纳米胶囊表面，从而使封堵的孔口被打开，纳米胶囊内的染料分子得以释放，分别采用激发波长535nm、648nm进行激光共聚焦扫描成像，最终获得了细胞内Hg²⁺和Ag⁺的的荧光成像结果。

采用本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物用于细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像，具有结构简单、生物相容性好、设计巧妙、制备简单、性能稳定、细胞膜渗透能力强、胞内释放可控性强、对Hg²⁺和Ag⁺特异性强、响应时间短、便于实时监测等诸多优点，并且不会受到其它常见干扰物质如Cd²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，Cu²⁺，Fe³⁺，Zn²⁺等金属离子的影响，能够方便、快捷地实现细胞内Hg²⁺和Ag⁺的高灵敏、高选择性的同时荧光成像。

可以预见，本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物及其制备方法和检测成像技术具有巨大的医学应用潜力和广范的应用前景，将在重大疾病的早期诊断与治疗以及食品卫生、生物医药、环境监测等领域发挥重要的作用。

序列表

<110> 青岛科技大学

<120> 一种细胞内Hg2+和Ag+的同时荧光成像方法

<141> 2020-02-11

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttgtttgtt ggaaaacctt ctttctta 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accacccacc aaggaattcc tccctcct 28

Claims

1.一种细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像方法，其特征在于该方法采用了一种由2种核酸生物识别分子、2种荧光信号分子和具有中空、多孔结构的纳米金构建而成的纳米胶囊-核酸生物分子复合物。

2.一种如权利要求1所述的细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像方法，其特征在于：所述的2种核酸生物识别分子分别是富含胸腺嘧啶和胞嘧啶的核酸生物分子。

3.一种如权利要求1所述的细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像方法，其特征在于：所述的2种核酸生物识别分子分别是特异性识别Hg²⁺的5’-TTT GTT TGT TGGAAAACC TTC TTTCTTA-3’和特异性识别Ag⁺的5’-ACC ACC CAC CAAGGAATT CCT CCC TCC T-3’。

4.一种如权利要求1所述的细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像方法，其特征在于：所述的2种荧光信号分子分别是罗丹明B和荧光素Cy5。

5.一种如权利要求1所述的细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像方法，其特征在于：所述的2种核酸生物识别分子是通过静电作用被分别组装到具有中空、多孔结构的纳米金表面。

6.一种如权利要求1所述的细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像方法，其特征在于在于步骤如下：

(2)加入本发明提出的纳米胶囊-核酸生物分子复合物溶液进行孵育，10-50min后分别给予相应波长的激发进行细胞内Hg²⁺和Ag⁺的激光共聚焦扫描成像；

其中，所述的纳米胶囊-核酸生物分子复合物的制备方法，步骤如下：

(1)通过选择不同种类及其数量的碱基，分别设计并合成2种核酸生物识别分子，确保其分别对且仅对目标金属离子Hg²⁺或Ag⁺具有特异性的响应，而对其它任何共存离子和干扰离子没有响应；

(2)在具有中空、多孔结构的纳米金溶液中加入聚二烯丙基二甲基氯化铵溶液，10-12h后离心分离，用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液清洗；

其中，所述的可识别Hg²⁺的核酸生物分子的碱基序列为5’-TTT GTT TGT TGG AAA ACCTTC TTT CTTA-3’；

(4)重复执行步骤2后加入荧光分子Cy5溶液，10-12h后加入可识别Ag⁺的核酸生物分子溶液，10-12h后离心分离，用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液清洗，备用；

其中，所述的可识别Ag⁺的核酸生物分子的碱基序列为5’-ACC ACC CAC CAA GGA ATTCCT CCC TCC T-3’；

(5)将第(3)步和第(4)步所得产物分别用pH＝7.0的MOPS缓冲溶液稀释后混合，离心分离，即可制得细胞内Hg²⁺和Ag⁺的同时荧光成像的纳米胶囊-核酸生物分子复合物。