CN113655046B - 一种从混合组合化学分子库中垂钓活性小分子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于表面增强拉曼光谱联合高分辨质谱技术HRMS从组合化学混合物库中进行垂钓筛选活性单体成分或者活性成分组的方法，结合SERS和HRMS分析技术从小分子混合化合物群中垂钓筛选出基于靶蛋白的活性成分单体或活性成分组。该方法测量干扰小，假阳性低，所需样品量极微，信号强且灵敏度高，同时操作简便，可实现高通量筛选，化合物库可重复利用，为靶向药物筛选途径提供了新策略。

Description

一种从混合组合化学分子库中垂钓活性小分子的方法
技术领域
本发明属于药物筛选技术领域，具体涉及一种从混合组合化学分子库中垂钓活性小分子的方法。
背景技术
在新药研发过程中，发现具有生物活性的先导候选物非常重要，传统先导化合物的选择方法成本较高，耗时较长，且失败的风险较大。
组合化学是一门将化学合成、组合理论、计算机辅助设计及机械手结合，并在短时间内巧妙将不同构建模块根据组合原理，系统反复连接，从而产生大量分子多样性群体，形成化合物库(compound library)，然后，运用组合原理，对库成分进行筛选优化，得到可能的有目标性能的化合物结构的科学。利用组合化学方法可以快速地生成数量庞大、分子多样性丰富的化合物库，这在一定程度上突破了药物筛选中化合物数量和多样性不足的问题。组合化学大幅度提高了新化合物的合成和筛选效率，减少了时间和资金的消耗。但其成分复杂，作用活性不明确，使其成分分离纯化与活性筛选较费时费力。通常在完成繁琐且艰巨的分离纯化、结构分析鉴定过程之后，组合化学分子库的各类结构小分子还需进行结构活性的确认、靶点蛋白的确认以及生物活性筛选。整个新型结构的发现过程成本高、周期长且所需样本量大，不适合进行大规模、高通量的筛选。
表面增强的拉曼散射(Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS)是基于物理增强和化学增强的一种信号增强技术，被广泛应用于生物医学领域，如核酸、蛋白质、细胞、组织等的检测。它基于金属附在粗糙分子表面或位于金属材料间隙或尖端时放大由局部表面等离子体激发产生的电磁场，使吸附在金属表面上待测物的拉曼信号增强103-106倍，对低浓度分析物进行高灵敏检测。SERS技术可以在液体环境下提供超高敏感性被测物的固有分子指纹信息，特异性强、灵敏度高，可以准确而灵敏地检测到蛋白质的特征峰，当小分子化合物影响蛋白质互作时，特征峰值又会出现明显改变，因此在药物高通量筛选方面有着重大意义。基于此技术的分子垂钓是一种基于药物靶点与活性分子的相互作用，从复杂的生物样品中亲和选择配体，以实现先导化合物的发现的高通量生物分析方法，具有特异性强、效率高、对样品预处理要求少等特点。同时高分辨质谱强大的分离和结构鉴定，使得两种技术的有机结合可以从多组分复杂体系中快速寻找出重要蛋白的配体。有专利CN101339167A使用生物质谱对小分子化合物进行筛选，但其分离体系及前处理办法均非常繁琐，且很难在回收和解离液中获得较为纯粹的游离和结合的配合物。因此，急需一种能够操作简便且特异性较强地得到探针上可结合靶蛋白或靶蛋白结合受体蛋白的方法。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明提供了一种高分辨质谱技术HRMS和表面增强的拉曼散射SERS联用，检测利用纳米探针从组合化学分子库中垂钓筛选出的作用于靶蛋白的小分子活性结构的一种通用关键技术。本发明突破了传统组合化学寻找活性母体结构的周期长、用量大且靶点不明确等弊端，同时该技术与高分辨串联质谱仪联用，利用该仪器可从复杂体系中快速分离以及优秀的结构解析能力等特点，使得该发明可适用于结构已知且体系复杂的组合化学分子库，可达到快速灵敏的高通量活性母体结构或小分子单体的垂钓筛选目的。
本发明提供了一种从混合组合化学分子库中垂钓活性成分单体或活性成分组的方法，包括以下步骤：
步骤S1，将金属纳米粒子或磁珠活化后与靶蛋白进行耦联，得到可用于组合化学分子库垂钓的探针结构；
步骤S2，将制备好金属纳米粒子探针或磁珠探针，加入至组合化学化合物库中，孵育，进行分子垂钓；
步骤S3，将垂钓后的探针用高浓度甲醇或乙腈充分溶解，上清液冻干后用质谱甲醇复溶，用质谱检测，获得垂钓得到的化合物的分子量和结构信息；
步骤S4，将制备的金属纳米粒子探针或磁珠探针与拉曼信号分子耦联，再将金属纳米粒子探针和磁珠探针分别与靶蛋白或靶蛋白结合受体蛋白耦联，加入S2垂钓筛选出的化合物；
步骤S5，检测拉曼信号，判断所筛选出的化合物是否具有抑制靶蛋白与靶蛋白受体结合的作用。
在某些实施例中，所述步骤S2中所述探针与组合化学化合物的体积比例为3:1。
在某些实施例中，所述步骤S2中孵育的时间为4h以上或过夜。
在某些实施例中，所述步骤S3中充分溶解步骤为，金属纳米粒子探针：用乙酸重悬，快速震摇至明显的银镜反应出现，收集上清离心；磁珠探针：用甲醇重悬，均匀反应20min，收集上清离心。
在某些实施例中，所述步骤S5中的判断具体为：
若检测到SERS信号明显由强变弱或由弱变强，则垂钓筛选出的化合物为针对特定靶点的靶向小分子抑制剂；
若SERS信号没有明显改变，则垂钓筛选出的化合物不是针对特定靶点的靶向小分子抑制剂。
在某些实施例中，所述金属纳米粒子探针为金纳米粒子探针或银纳米粒子探针。
在某些实施例中，所述拉曼信号分子为4-MBA或4-ABP。
在某些实施例中，所述靶蛋白为程序性死亡配体1(PD-L1)。
本发明首次将分子垂钓技术与组合化学化合物库相结合，联合HRMS和表面增强的拉曼散射SERS技术从组合化学混合化合物中垂钓筛选基于靶蛋白的小分子活性单体或者活性成分组；该方法测量干扰小，假阳性低，所需样品量极微，信号强且灵敏度高，同时操作简便，可实现高通量筛选；化合物库可重复利用，且应用组合化学得到的化合物分子数量庞大，分子多样性强，为活性小分子筛选提供庞大的分子库；分子垂钓技术可以有针对性的筛选分子库中针对靶蛋白或靶蛋白结合受体蛋白的抑制剂，针对性强，比以往的技术效率更高。本发明为靶向药物筛选途径提供了新策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中BMS-202小分子抑制剂的液相和质谱图。
图2为实施例1中从组合化学库1中垂钓得到的小分子抑制剂的液相和质谱图。
图3为实施例1中从组合化学库2中垂钓得到的小分子抑制剂的液相和质谱图。
图4为实施例1中从组合化学库5中垂钓得到的小分子抑制剂的液相和质谱图。
图5为实施例2中从组合化学库5垂钓得到的BMS-202的拉曼检测结果。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施案例所描述的内容仅用于说明和解释本发明，并不用于限制权利要求书中所详细描述的本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备如无特别说明，均为常规方法，所使用的试验材料如无特别说明，均可从商业公司获取。
实施例1建立HRMS-SERS分析技术联用方法
1.1探针材料的制备
合成银纳米粒子：取一只250mL三口烧瓶在酸缸浸泡过夜，第二天取出冲洗干净后再用注射用水洗涤三次，保证壁内纯净无杂质。放入烘箱烘干，冷却至室温。期间精确称量0.018g硝酸银粉末，小心倒入三口烧瓶中。加入100mL超纯水，摇匀，接上冷凝管并设定电热套温度为100℃，将溶液搅拌加热至微沸后立刻快速加入2mL 1％的柠檬酸钠溶液。观察溶液颜色变化：浅黄，到深黄，再到灰绿，观察到颜色不再发生变化，稍稍降温到90℃，继续磁力搅拌，维持40min得到银纳米粒子分散体系。用紫外分光光度计测定银纳米粒子的吸光度曲线：将银纳米粒子5倍稀释后检测，观察最大吸收波长范围(420-480nm)正确，并没有其他杂峰，即可初步判断合成粒径均一。利用公式：A＝kbc(A＝Amax，k＝3×1011M-1cm-1，b＝1cm)计算银纳米粒子的浓度。4℃保存备用。
1.2制备靶蛋白探针的耦联以及样品(化合物库)
靶蛋白为PD-L1(用于HRMS-SERS分析技术方法建立、验证、应用)和PD-1蛋白(用于HRMS-SERS分析技术方法应用)，通过氨基耦联法将其连接在活化后的银纳米粒子探针和羧基磁珠探针上；
银纳米粒子探针的制备：浓缩AgNPs为0.29nM以上，加入新鲜配制的吐温20，反应30min后加入5.0μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(2.5mM)和5.0μLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(2.5mM)，反应1h，离心去除多余的活化剂，重悬浮。加入5μLDomain Z(0.05mg/mL)反应2h，离心后洗涤，加入1μL PD-1蛋白(1mg/mL)耦联4h，离心后洗涤一次，加入组合化学库中耦联过夜，离心后去上清，用高浓度甲醇(500μL)重悬沉淀，室温快速振荡，取上清离心，再取上清冷冻干燥，得到的结晶产品玻璃瓶4℃保存待测。
磁珠探针的制备：取500nm大小的羧基磁珠，稀释浓度为0.5mg/mL，加入新鲜配制的吐温20，反应30min后加入5.0μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(100mM)和5.0μL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(100mM)，反应1h，离心去除多余的活化剂，重悬浮。加入5μL Domain Z(0.05mg/mL)反应2h，离心后洗涤，加入1μL PD-L1蛋白(1mg/mL)耦联4h，离心后洗涤一次，加入组合化学库中耦联过夜，离心后去上清，用高浓度甲醇(500μL)重悬沉淀，室温快速振荡，取上清离心，再取上清冷冻干燥，得到的结晶产品玻璃瓶4℃保存待测。
组合化学库准备：各组合化学库用无水乙醇或二甲基亚砜配置为1mg/mL的储备液，其工作液用缓冲液稀释，使样品中乙醇或二甲基亚砜的浓度低于5％。
制备BMS-202和组合化学库1混合样：混合物中BMS-202的浓度为20μg/mL；
制备BMS-202和组合化学库2混合液：混合液中BMS-202的浓度为10μg/mL；
制备BMS-202和组合化学库5混合液：混合液中BMS-202的浓度为20μg/mL；
1.3建立快速液相串联高分辨质谱方法
1.3.1液相及质谱条件
1.3.1.1色谱条件，色谱柱：Thermoscientific Hypersil GOLD(50*2.1mm,1.9μm)；流动相：0.1％甲酸(A)-乙腈(B)；流速：0.3mL/min；柱温：25℃；进样量：1μl；梯度如下表1所示：
表1液相色谱洗脱程序
Figure BDA0003151394960000071
1.3.1.2质谱条件，Sheath gas flow rate:40，Aux gas flow rate:15，Sweepgas flow rate:0，Spray Voltage:3.25KV，Capillary temp:250℃，S-lens RF level:0，Aux gas flow rate:300℃；
1.3.1.3质谱结果，在组合化学库中加入4μL的对PD-1/PD-L1有明确抑制效果的小分子抑制剂(BMS-202)，从质谱分子量图中验证该小分子抑制剂是否可被垂钓；质谱结果如图1-4显示，该小分子抑制剂(M/Z＝378.2190)，在不同的组合化学分子库中均可被金属纳米粒子探针所垂钓(M/Z＝378.2192、M/Z＝378.2193)。
实施例2表面增强的拉曼光谱检测
1.制备金(银)纳米粒子
1.1制备金纳米粒子
金纳米粒子(AuNPs)：取一只250mL三口烧瓶，用王水(1份浓硝酸加入3份浓盐酸)清洗，第二天取出冲洗干净后再用注射用水洗涤三次，保证壁内纯净无杂质。放入烘箱烘干，冷却至室温。烧瓶中加入2mL 1％的HAuCl4加水至200mL，接上冷凝管，用电热套加热至150℃，搅拌加热回流至微沸。加入2mL 1％柠檬酸钠，控制温度，观察颜色变化，从淡黄色到黑色(110℃-120℃)，再到红色(90℃)，降温至90℃，保持该温度40min，得到金纳米粒子分散体系。
1.2制备银纳米粒子
银纳米粒子(AgNPs)：取一只250mL三口烧瓶在酸缸浸泡过夜，第二天取出冲洗干净后再用注射用水洗涤三次，保证壁内纯净无杂质。放入烘箱烘干，冷却至室温。期间精确称量0.018g硝酸银粉末，小心倒入三口烧瓶中。加入100mL超纯水，摇匀，接上冷凝管并设定电热套温度为100℃，将溶液搅拌加热至微沸后立刻快速加入2mL 1％的柠檬酸钠溶液。观察溶液颜色变化：浅黄，到深黄，再到灰绿，观察到颜色不再发生变化，稍稍降温到90℃，继续磁力搅拌，维持40min得到银纳米粒子分散体系。用紫外分光光度计测定银纳米粒子的吸光度曲线：将银纳米粒子5倍稀释后检测，观察最大吸收波长范围(420-480nm)正确，并没有其他杂峰，即可初步判断合成粒径均一。利用公式：A＝kbc(A＝Amax，k＝3×1011M-1cm-1，b＝1cm)计算银纳米粒子的浓度。4℃保存备用。
1.3磁纳米粒子的制备
百迈格生产的商品化羧基磁珠，配置浓度为0.5mg/mL，用磁珠保存液冲洗并磁分离重复三次，重悬在保存液中以防止磁珠聚集，于4℃保存备用。
1.4合成靶点蛋白抑制剂筛选相关的两种拉曼探针(拉曼信号分子偶联在银纳米粒子上)
偶联蛋白时为了减少与非位点特异性结合，提高蛋白的靶向效率，我们在PD-1蛋白的C端添加了一段Fc标签并使用Protein A结构域B高效特异性的识别PD-1的Fc段。
1mL AgNPs(0.25nM)加入20μL吐温20混匀20min防止AgNPs聚沉。然后，加入10μL2.5mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和10μL 2.5mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)混匀活化1小时，离心(3500g，6min)，吸去上清后用等体积的注射用水将AgNPs重悬。迅速加入4μL Domain B(0.05mg/mL)偶联1.5小时，离心(3500g，6min)，吸去上清后用等体积的注射用水将AgNPs重悬。用拉曼信号分子4-巯基苯甲酸(4-Mercaptobenzoic acid，4-MBA)组装到AgNPs表面，加入2μL PDEδ(0.05mg/mL)和25μl 4-MBA(1.0mM)偶联1.5小时，离心(3500g，6min)，吸去上清后用等体积的注射用水将AgNPs重悬得到AgNPs4-MBA@DomainB@PD-1探针。
加入1μL乙醇胺(15mM)和1μLBSA(0.5mgmL-1)封闭20min,离心(3500g，6mins)，吸去上清后用等体积的注射用水将AgNPs重悬。
磁珠探针的制备：取500nm大小的羧基磁珠，稀释浓度为0.5mg/mL，加入新鲜配制的吐温20，反应30min后加入5.0μL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)(100mM)和5.0μL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(100mM)，反应1h，离心去除多余的活化剂，重悬浮。加入1μL PD-L1蛋白(1mg/mL)耦联4h，离心后洗涤一次，得到MNs-NPs@PD-L1探针。
BMS-202(一种小分子PD-1/PD-L1抑制剂)作为阳性药。在有BMS-202(0.17μL，1mg/mL)和没有BMS-202的情况下混合两种探针(银探针：磁探针＝500μL：150μL)，分别对两组混合物进行磁分离，用注射用水洗涤磁探针3次后用等体积注射用水重悬。
磁富集后，在633nm的激发光下进行SERS检测，可以看到明显的拉曼信号变化，加入组合化学库5中垂钓得到的BMS-202，拉曼信号明显降低。阳性药浓度越高，信号峰越低。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (7)

1.一种从混合组合化学分子库中垂钓活性成分单体或活性成分组的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1，将金属纳米粒子或磁珠活化后与靶蛋白进行耦联，得到可用于组合化学分子库垂钓的探针结构；
步骤S2，将制备好金属纳米粒子探针或磁珠探针，加入至组合化学化合物库中，孵育，进行分子垂钓；
步骤S3，将垂钓后的探针用高浓度甲醇或乙腈充分溶解，上清液冻干后用质谱甲醇复溶，用质谱检测，获得垂钓得到的化合物的分子量和结构信息；
步骤S4，将制备的金属纳米粒子探针或磁珠探针与拉曼信号分子耦联，再将金属纳米粒子探针和磁珠探针分别与靶蛋白或靶蛋白结合受体蛋白耦联，加入S2垂钓筛选出的化合物；
步骤S5，检测拉曼信号，判断所筛选出的化合物是否具有抑制靶蛋白与靶蛋白受体结合的作用；
所述判断具体为：
若检测到SERS信号明显由强变弱或由弱变强，则垂钓筛选出的化合物为针对特定靶点的靶向小分子抑制剂；
若SERS信号没有明显改变，则垂钓筛选出的化合物不是针对特定靶点的靶向小分子抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中所述探针与组合化学化合物的体积比例为3:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中孵育的时间为4h以上或过夜。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中充分溶解步骤为，金属纳米粒子探针：用乙酸重悬，快速震摇至明显的银镜反应出现，收集上清离心；磁珠探针：用甲醇重悬，均匀反应20min，收集上清离心。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述金属纳米粒子探针为金纳米粒子探针或银纳米粒子探针。
6.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述拉曼信号分子为4-MBA或4-ABP。
7.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述靶蛋白为程序性死亡配体1（PD-L1）。
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