CN114384058B - 一种基于高分辨激光共聚焦拉曼研究小分子与靶蛋白相互作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于高分辨激光共聚焦拉曼研究小分子与靶蛋白相互作用的方法，通过将小分子与光亲和性玻片在紫外光照射下，发生光交联反应使小分子以化学键键合到光亲和性玻片上，从而构建起小分子阵列，之后小分子阵列与靶蛋白共孵育，使小分子能与相应靶蛋白特异性结合，最后通过高分辨激光共聚焦拉曼光谱仪检测小分子阵列上的靶蛋白的拉曼位移，从而筛选出能与靶蛋白特异性结合的小分子；本发明是一种新颖的药物活性筛选的方法，将激光共聚焦拉曼光谱仪的无损、无接触、快速检测的特点与微阵列微量、高通量的特点巧妙结合，具有广阔的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及药物筛选技术领域，具体涉及一种基于高分辨激光共聚焦拉曼研究小分子与靶蛋白相互作用的方法。
背景技术
中药在中国被用于治疗许多疾病有着十分悠久的历史，如今在美国、澳大利亚、欧洲等许多国家中药也被广泛使用。许多中药在临床上被证明是有效的，然而其药效物质基础和作用机制却并不明确。中药不同于化学合成药物或天然药物有着明确的化学组成和化学结构，其由一个庞大的化合物群组合而成。因此研究中药的有效活性成分、体内作用靶点和分子机制给科学家们带来了不小的挑战。
为此，我们努力探索以期能找到一种普遍适用于中药小分子高通量活性筛选的方法。目前，微阵列在高通量筛选上有着广泛的应用。通过文献调研，以及相关的实验研究，我们发现一种光亲和性玻片非常适合用来构建中药复杂的体系中化学成分的阵列。这种光亲和性微阵列是通过光亲和性分子三氟甲基苯基双吖丙啶(Trifluoromethylaryldiazirines，TAD)与合适的连接臂组合并通过化学键的方式固定在玻片上构建而成的。小分子与玻片上的光活性基团TAD通过光交联反应就构建成了小分子微阵列。
光交联反应只需在一定能量的紫外光照几分钟至几小时即可完成，是非常绿色环保的合成手段。另外，与传统方法不同，该方法不依赖于特定官能团，TAD在紫外光照下产生高反应性的卡宾，可以插入多种化学键，如C(sp3)-H,C(sp2)-H,O-H,C-Cl,N-H,Si-H,以及C＝C双键等，同时最大程度地保留了小分子的原有化学结构，这是研究小分子与抗体或酶等蛋白质结合的必要前提。因此，这种非选择性的光化学偶联方法会普遍适用于各种中药小分子及天然药物和合成药物微阵列的构建。
拉曼是一种光散射技术，拉曼光谱是基于光与物质相互作用后，发出的带有物质特征信息的散射光谱。一张拉曼谱图通常由一定数量的拉曼峰构成，每个拉曼峰代表相应散射光的波长位置和强度，它对应于一种特定的分子键振动，不仅包括单一的化学键如C-C、C＝C、C-H、O-N等，也包括数个化学键组成的基团的振动，例如苯环的呼吸振动、多聚物长链的振动和晶格振动。因此，拉曼光谱可以准确地鉴别和分析物质种类。另一方面，它还具有非接触性、非破坏性，实时原位和样品用量极少的特点。激光共聚焦拉曼相较于传统拉曼具有更高的空间分辨率和光谱分辨率，这使得在微阵列上使用拉曼技术检测微量物质成为可能。
传统的靶蛋白与小分子体外结合活性鉴别都是间接的方法，以α-葡萄糖苷酶为例，酶活性评估是以对硝基苯基α-D-葡萄基丙醛苷为底物的紫外分光光度法来评价这些活性化合物的抑制活性。这是一种间接的酶活评估方法，还不能排除假阳性的实验结果。
如何基于拉曼光谱技术与微阵列技术来直接鉴别靶蛋白与小分子体外结合，是一个亟待解决又有相当应用前景的技术问题。
发明内容
本发明将激光共聚焦拉曼光谱仪的无损、无接触、快速检测的特点与微阵列微量、高通量的特点巧妙结合，发明了一种基于激光共聚焦拉曼研究小分子与靶蛋白相互作用的方法。
本发明的技术方案如下：
一种基于激光共聚焦拉曼研究小分子与靶蛋白相互作用的方法，所述方法为：
(1)光交联反应制备小分子微阵列
避光条件下，将小分子标准品配制成DMSO(二甲基亚砜)溶液，用移液枪取样在光亲和性玻片(PALC玻片)上点样，点样完成后将玻片转移至真空烘箱烘干，接着将烘干的玻片置于紫外灯下照射，使光交联反应充分完成，在玻片上制得小分子微阵列，之后玻片经洗涤，氮气吹干，备用(装入玻片盒中，-20℃密封保存)；
进一步：
小分子标准品例如：戈米辛J、阿卡波糖、三七皂苷Ft1；小分子标准品的DMSO溶液浓度为10mM，点样量为1μL/点，一块PALC玻片一般点9～12点；
真空烘箱的温度为41℃，真空度为-0.1Mpa，烘干时间为1h；
紫外灯发射的紫外光波长为365nm，紫外灯照射时间为3h；
光交联反应完成后玻片洗涤的方法为：先用甲醇淋洗，然后转移至染缸依次用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、二氯甲烷、乙醇、超纯水分别水平振摇洗涤，通过充分的洗涤来去除玻片上游离(未发生光交联)的小分子标准品；
(2)小分子微阵列与靶蛋白共孵育
用PBS缓冲液配制靶蛋白溶液，用移液枪吸取靶蛋白溶液在步骤(1)制备好的小分子微阵列上点样，点样后将玻片转移至湿盒中，湿盒放置在恒温培养箱中，静置孵育，孵育完成后取出玻片，经洗涤，氮气吹干，备用(装入玻片盒中，-20℃密封保存)；
进一步：
靶蛋白例如：α-葡萄糖苷酶；靶蛋白溶液的点样量为10μL/点，确保完全覆盖微阵列上的小分子区域；
湿盒用浸润超纯水的棉花保湿；
恒温培养箱的温度为37℃，静置孵育的时间为1h；
孵育完成后玻片洗涤的方法为：先用PBS缓冲液淋洗，再装入染缸分别用PBS缓冲液、超纯水震摇洗涤，以去除游离的(未结合的)靶蛋白；
(3)激光共聚焦拉曼检测靶蛋白拉曼位移
将步骤(2)准备好的玻片置于载物台上，利用显微镜找到相应物质的斑点进行拉曼光谱采集，得到的拉曼谱图中发现靶蛋白特征拉曼位移，即证明相应位置的小分子与靶蛋白具有结合活性；
进一步：
用于拉曼检测的仪器为LabRAM HR Evolution(Horiba,France)，参数设置为：RTDTimes:0.5；Range:100～4000cm-1；Acq time(s):3；Accumulation:3；Objective:50X；Grating:600(500nm)；ND Filter:50％；Laser:532nm；Hole:100。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种基于高分辨激光共聚焦拉曼研究小分子与靶蛋白相互作用的方法，通过将小分子与光亲和性玻片在紫外光照射下，发生光交联反应使小分子以化学键键合到光亲和性玻片上，从而构建起小分子阵列，之后小分子阵列与靶蛋白共孵育，使小分子能与相应靶蛋白特异性结合，最后通过高分辨激光共聚焦拉曼光谱仪检测小分子阵列上的靶蛋白的拉曼位移，从而筛选出能与靶蛋白特异性结合的小分子。本发明是一种新颖的药物活性筛选的方法，将激光共聚焦拉曼光谱仪的无损、无接触、快速检测的特点与微阵列微量、高通量的特点巧妙结合，具有广阔的应用价值。
附图说明
图1戈米辛J标准品在785nm、633nm、532nm激光器激发的拉曼光谱对比图。
图2三七皂苷Ft1微阵列(NotFt1-PALC)与三七皂苷Ft1(NotFt1)标准品的拉曼光谱对比图。
图3阿卡波糖(Acarbose)与α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)标准品的拉曼光谱对比图。
图4阿卡波糖标准品(Acarbose)、阿卡波糖微阵列(Acarbose-PALC)及其与α-葡萄糖苷酶结合后(α-Glucosidase-Acarbose-PALC)的拉曼光谱对比图。
图5戈米辛J微阵列上结合的α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase-Gominsin J-PALC)与游离的α-葡萄糖苷酶标准品(α-Glucosidase)的拉曼光谱对比图。
图6固定于特制玻片上的光交联分子探针应用于中药复方活性成分筛选的过程示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步描述本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例中使用的PALC玻片按如下方法制备：
将N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯活化后的氨基玻片(厂家规格：Acmec AFISH0010氨基防脱载玻片)与含有50mM N,N-二异丙基乙胺和10mM光亲和连接链的N,N-二甲基甲酰胺溶液在室温黑暗干燥条件下孵育12h，之后依次用无水乙醇、N,N-二甲基甲酰胺振摇洗涤；将洗涤后的玻片放入装有封闭液的染缸中振摇1h，再用无水乙醇、超纯水振摇洗涤，经氮气干燥后，得到PALC玻片；
其中，
氨基玻片活化的操作方法为：将氨基玻片与含有10mM N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯与10mM N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液在室温下反应2h；
光亲和连接链为：
N-[2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxy]ethyl]-4-[3-(trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl]benzamide(CAS号：655224-73-0)；
封闭液为1M乙醇胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液。
实施例1戈米辛J微阵列的制备
取戈米辛J标准品配置成10mM浓度的DMSO溶液，接着用移液枪取样在PALC玻片上点样，每个点的点样量为1μL。一块PALC玻片为12点。点样完成后，所有玻片被小心转移至41℃真空烘箱烘干1小时，实验全程避光。将烘干的玻片置于365nm紫外灯下照射3小时，使光交联反应充分完成。接着，玻片用甲醇淋洗(1mL*5)，然后转移至染缸依次用50mL的DMF、二氯甲烷、乙醇、超纯水分别水平振摇洗涤6min。通过充分的洗涤来去除玻片上游离(未发生光交联)的小分子标准品。所有小分子微阵列洗涤完成后用氮气吹干，装入玻片盒中，-20℃密封保存备用。
实施例2阿卡波糖微阵列的制备
取阿卡波糖标准品配置成10mM浓度的DMSO溶液，接着用移液枪取样在PALC玻片上点样，每个点的点样量为1μL。一块PALC玻片为12点。点样完成后，所有玻片被小心转移至41℃真空烘箱烘干1小时，实验全程避光。将烘干的玻片置于365nm紫外灯下照射3小时，使光交联反应充分完成。接着，玻片用甲醇淋洗(1mL*5)，然后转移至染缸依次用50mL的DMF、二氯甲烷、乙醇、超纯水分别水平振摇洗涤6min。通过充分的洗涤来去除玻片上游离(未发生光交联)的阿卡波糖。所有小分子微阵列洗涤完成后用氮气吹干，装入玻片盒中，-20℃密封保存备用。
实施例3三七皂苷Ft1微阵列的制备
取三七皂苷Ft1标准品配置成10mM浓度的DMSO溶液，接着用移液枪取样在PALC玻片上点样，每个点的点样量为1μL。一块PALC玻片为12点。点样完成后，所有玻片被小心转移至41℃真空烘箱烘干1小时，实验全程避光。将烘干的玻片置于365nm紫外灯下照射3小时，使光交联反应充分完成。接着，玻片用甲醇淋洗(1mL*5)，然后转移至染缸依次用50mL的DMF、二氯甲烷、乙醇、超纯水分别水平振摇洗涤6min。通过充分的洗涤来去除玻片上游离(未发生光交联)的三七皂苷Ft1。所有小分子微阵列洗涤完成后用氮气吹干，装入玻片盒中，-20℃密封保存备用。
实施例4α-葡萄糖苷酶与小分子阵列共孵育实验
用PBS缓冲液(0.1M，pH 6.8±0.1)分别配置5U/mL和20U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液。等小分子微阵列自然温暖至室温后，用移液枪吸取配置好的α-葡萄糖苷酶溶液并在阵列上点样，每个点为10μL确保完全覆盖微阵列上的小分子区域。实验组酶浓度分别为5U/mL和20U/mL，对照组为PBS缓冲液。点样后将玻片小心转移至湿盒中，湿盒用浸润超纯水的棉花保湿。湿盒被放置在37℃的恒温培养箱中，静置孵育1小时。然后取出玻片，各组玻片分别用PBS缓冲液淋洗(2mL*5)，再装入染缸分别用50mL的PBS缓冲液、超纯水震摇洗涤6min。充分洗涤，以去除游离的(未结合的)α-葡萄糖苷酶。洗涤完毕，所有玻片用氮气吹干，装入玻片盒中，-20℃密封保存备用。
实施例5激光共聚焦拉曼检测微阵列上的α-葡萄糖苷酶
激光共聚焦拉曼光谱仪LabRAM HR Evolution(Horiba,France)参数设置为：RTDTimes：0.5；Range：100～4000cm-1；Acq time(s):3；Accumulation:3；Objective:50X；Grating:600(500nm)；ND Filter:50％；Laser:532nm；Hole:100；将待测玻片置于载物台上，利用50倍显微镜找到相应物质的斑点进行拉曼光谱采集。得到的拉曼谱图中发现，阳性对照药阿卡波糖阵列和中药制剂参芪降糖颗粒中的一种成分，即戈米辛J的阵列上均发现了α-葡萄糖苷酶3055cm-1处的特征拉曼位移。证明了阿卡波糖与戈米辛J具有α-葡萄糖苷酶体外结合活性。相反，如果在某一小分子微阵列上未发现α-葡萄糖苷酶特征拉曼位移，则证明该分子与α-葡萄糖苷酶不具有良好的体外结合活性。
Claims (8)
1.一种基于激光共聚焦拉曼研究小分子与靶蛋白相互作用的方法，其特征在于，所述方法为：
(1)光交联反应制备小分子微阵列
避光条件下，将小分子标准品配制成DMSO溶液，用移液枪取样在光亲和性玻片上点样，点样完成后将玻片转移至真空烘箱烘干，接着将烘干的玻片置于紫外灯下照射，使光交联反应充分完成，在玻片上制得小分子微阵列，之后玻片经洗涤，氮气吹干，备用；
(2)小分子微阵列与靶蛋白共孵育
用PBS缓冲液配制靶蛋白溶液，用移液枪吸取靶蛋白溶液在步骤(1)制备好的小分子微阵列上点样，点样后将玻片转移至湿盒中，湿盒放置在恒温培养箱中，静置孵育，孵育完成后取出玻片，经洗涤，氮气吹干，备用；
(3)激光共聚焦拉曼检测靶蛋白拉曼位移
将步骤(2)准备好的玻片置于载物台上，利用显微镜找到相应物质的斑点进行拉曼光谱采集，得到的拉曼谱图中发现靶蛋白特征拉曼位移，即证明相应位置的小分子与靶蛋白具有结合活性；
上述方法中，光亲和性玻片按如下方法制备：
将N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯活化后的氨基玻片与含有50mM N,N-二异丙基乙胺和10mM光亲和连接链的N,N-二甲基甲酰胺溶液在室温黑暗干燥条件下孵育12h，之后依次用无水乙醇、N,N-二甲基甲酰胺振摇洗涤；将洗涤后的玻片放入装有封闭液的染缸中振摇1h，再用无水乙醇、超纯水振摇洗涤，经氮气干燥后，得到光亲和性玻片；
其中，
氨基玻片活化的操作方法为：将氨基玻片与含有10mM N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯与10mM N,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液在室温下反应2h；
光亲和连接链为：
N-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基]-4-[3-(三氟甲基)-3H-双吖丙啶-3-基]苯甲酰胺，CAS号：655224-73-0；
封闭液为1M乙醇胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液。
2.如权利要求1所述基于激光共聚焦拉曼研究小分子与靶蛋白相互作用的方法，其特征在于，步骤(1)中，小分子标准品为戈米辛J、阿卡波糖或三七皂苷Ft1。
3.如权利要求1所述基于激光共聚焦拉曼研究小分子与靶蛋白相互作用的方法，其特征在于，步骤(1)中，小分子标准品的DMSO溶液浓度为10mM，点样量为1μL/点，一块光亲和性玻片点9～12点。
4.如权利要求1所述基于激光共聚焦拉曼研究小分子与靶蛋白相互作用的方法，其特征在于，步骤(1)中，紫外灯发射的紫外光波长为365nm，紫外灯照射时间为3h。
5.如权利要求1所述基于激光共聚焦拉曼研究小分子与靶蛋白相互作用的方法，其特征在于，步骤(2)中，靶蛋白为：α-葡萄糖苷酶。
6.如权利要求1所述基于激光共聚焦拉曼研究小分子与靶蛋白相互作用的方法，其特征在于，步骤(2)中，靶蛋白溶液的点样量为10μL/点。
7.如权利要求1所述基于激光共聚焦拉曼研究小分子与靶蛋白相互作用的方法，其特征在于，步骤(2)中，恒温培养箱的温度为37℃，静置孵育的时间为1h。
8.如权利要求1所述基于激光共聚焦拉曼研究小分子与靶蛋白相互作用的方法，其特征在于，步骤(3)中，用于拉曼检测的仪器为LabRAM HR Evolution Horiba,France，参数设置为：RTD Times:0.5；Range:100～4000cm-1；Acq time(s):3；Accumulation:3；Objective:50X；Grating:600,500nm；ND Filter:50％；Laser:532nm；Hole:100。
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| CN104897617A (zh) * | 2015-05-19 | 2015-09-09 | 国家纳米科学中心 | 一种微阵列生物芯片及其制备方法和应用 |
| CN104897826A (zh) * | 2015-06-16 | 2015-09-09 | 广西师范大学 | 一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相互作用的方法 |
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2021
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Photo-Cross-Linked Small-Molecule Microarrays as Chemical Genomic Tools for Dissecting Protein–Ligand Interactions;Naoki Kanoh等;CHEMISTRY;789-797 * |
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