CN114739974A - 一种二维平面结合SERS检测新冠病毒SARS-CoV-2抗原的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种二维平面结合SERS检测新冠病毒SARS‑CoV‑2抗原的方法，属于生物技术领域。本发明检测方法利用新冠病毒SARS‑CoV‑2S蛋白‑核酸适配体特异性识别的原理，通过附着新冠病毒SARS‑CoV‑2S蛋白免疫金纳米粒子的二维平面与S蛋白发生特异性免疫之后，再与免疫金信号纳米粒子结合，构筑成三明治结构；然后通过便携式拉曼光谱仪，可以直接测出其SERS信号，且实现了对新冠病毒SARS‑CoV‑2S蛋白低至1TU/ml的超高检测灵敏度。通过上述方式不但不需要进行核酸提取或依赖抗体进行检测，而且能在较短时间内特异性超灵敏的检测出新冠病毒SARS‑CoV‑2蛋白，为初期筛查感染新冠病毒SARS‑CoV‑2S的病原创造了有利、有效的方式。
Description
技术领域
本发明涉及一种二维平面结合SERS检测新冠病毒SARS-CoV-2抗原的方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎疫情的全球大流行，对全球公共健康、社会和经济运转造成了重大影响。在药物研发迟滞及疫苗有效性未得到充分验证的情况下，对人群进行大规模的快速筛查，寻找潜在的感染者(尤其是轻症和无症状患者)，并进行集中隔离，切断传播途径和保护易感人群是首要的任务。因此对于新冠病毒SARS-CoV-2感染，早期诊断尤为重要。
SARS-CoV-2的临床诊断依赖于既往接触史、临床表现和实验室检测，包括拭子核酸/抗原检测、血清学检测等来对新冠感染进行确诊。由于冠病毒的复杂性，联合采用多种技术可以有效提高诊断的准确性。总的来说，核酸检测仍然是新冠诊断的金标准，但其存在耗时较长、无法现场检测的缺点。血清学检测最主要的特点是检测耗时短、准确性高，但只有在患者感染后1周后才产生可被检测的抗体。而抗原检测利用针对新冠抗原蛋白制备的特异性单克隆抗体，对呼吸道、消化道等样本中的新冠抗原蛋白进行直接检测，兼具方便、快速和低价且灵敏度较高的优势，可对刚出现感染症状的患者进行及时检测，可对疑似人群进行早期分流和快速管理。但是，抗原检测的灵敏度和特异性急需提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于核酸适配体识别的二维平面结合SERS检测新冠病毒SARS-CoV-2抗原的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种二维平面结合SERS检测新冠病毒SARS-CoV-2抗原的方法，包括如下步骤：
1)制备拉曼金属纳米粒子；
2)拉曼金属纳米粒子与拉曼报告分子混合，室温孵育1-10分钟，离心，弃去上层清液，重新分散在PBS-T(MgCl2)溶液中，再与SARS-CoV-2的适配体混合后，-20℃下冷冻1-5h，解冻后，用PBS-T(MgCl2)洗涤数次后，加入TBS溶液封闭剩余活性位点，室温孵化，离心，用PBS-T(MgCl2)溶液洗涤数次，最后弃去上层清液，重新分散在PBS-T(MgCl2)溶液中，获得免疫金信号纳米粒子；
3)取金属纳米粒子，离心，弃去上清液，重新分散在去离子水中，再与巯基修饰的SARS-CoV-2适配体混合后，-80℃下冷冻0.5-5h，解冻后，获得增强信号金纳米粒子；取上述增强信号金纳米粒子，滴在二维平面上，烘箱30℃-80℃烘干，放入PBS和TBS混合液，室温下封闭，取出，用PBS-T(MgCl2)溶液洗涤，制得所述的增强型捕获新冠SARS-CoV-2病毒的二维平面基底；
4)取待测样品，滴到增强型捕获新冠SARS-CoV-2病毒的二维平面基底，再滴入步骤2)的免疫金信号纳米粒子，室温孵育，PBS溶液洗涤数次，构筑成三明治夹心结构；
5)拉曼检测。
本发明利用耦合特性和核酸适配体S Aptamer 1特异性识别，将修饰核酸适配体SAptamer 1的金纳米粒子附着在二维平面上，实现对新冠病毒SARS-CoV-2S蛋白的靶向捕获、和富集，再通过核酸适配体S Aptamer 1特异性识别结合具备拉曼信号表达的金属球颗粒，形成夹层(三明治式)结构，利用便携式拉曼光谱仪，在短时间内实现对新冠病毒SARS-CoV-2抗原的超灵敏、快速检测。
本发明所述的核酸适配体(Aptamer，Apt)是一段DNA(脱氧核糖核酸)，通常是利用体外筛选技术--指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands byexponential enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。对于蛋白类抗体，由于蛋白质作为探针分子，易受pH、温度等环境因素影响而变性、且合成价格昂贵，而适配体由DNA或RNA构成(主要是DNA)，比蛋白质体积更小，经SELEX筛选富集后，可以拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度，同时合成更容易，稳定性更好。因此在生物医学领域具有广泛的应用价值，尤其在生物检测和富集方面具有很大的应用潜力。
本发明所述的拉曼光谱是一种散射光谱，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，但是与入射光束相比，所产生的信号极其微弱。而一些具有特殊纳米结构的金属(如金、银、铜等)，其表面可以产生6-10个数量级的增强拉曼信号，因此表面增强拉曼散射(SERS)可以用来克服这种固有局限性，利用纳米结构金属表面(主要是金或银)上的局部表面等离子体激元共振的激发而产生的巨大电磁场增强来检测痕量物质。表面增强拉曼散射(SERS)技术因其不受水溶剂的影响，高灵敏度，非破坏性，操作简单快捷，低成本，所需样品少等优点而被广泛应用于生物学分析，例如活细胞分类，癌症检测，生物成像和病毒检测。
本发明优先采用识别S蛋白核酸适配体,包括但不限于识别S蛋白核酸适配体。
优选地，步骤2)中所述的S蛋白核酸适配体S Aptamer 1为5-CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCTGGTCCAAGGGCGTTAATGGACA-3。
本发明的金属纳米粒子包括金或银纳米粒子。
优选地，所述的纳米金属溶胶通过以下方法制得：取200mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取2-4mL质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾20-30min反应结束，冷却至室温，制成纳米金属溶胶。
优选地，所述的金属纳米粒子的粒径为30-35nm,紫外吸收波长为536nm。
优选地，所述的附着新冠病毒SARS-CoV-2S蛋白免疫金纳米粒子的二维平面是镀有50-100nm厚度金膜的硅片。
优选地，洗涤液PBS-T(MgCl2)的配制：PBS溶液中加入浓度为10-50mM的MgCl2及浓度为0.01％-1％的吐温-20。
优选地，在金纳米粒子的制备过程中，将50-100ul金纳米粒子与2-8ul 30uM NBA溶液混合，室温孵化1-10分钟。
优选地，步骤5)包括：将病毒样本滴在制得的附着新冠病毒SARS-CoV-2S蛋白免疫金纳米粒子的二维平面上反应后，再滴免疫金信号纳米粒子反应(或其他反应顺序)，室温孵育，PBS-T(MgCl2)溶液洗，直接进行拉曼检测，在1-30分钟(优选20min)内实现新冠抗原的快速检出拉曼光谱结果。
优选地，优选便携式拉曼光谱仪或其他类型拉曼光谱仪，激发波长优选为785nm。
优选地，本发明的具体步骤为：
(1)纳米金溶胶的制备：取200mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾20-30min反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶。
2)免疫金信号纳米粒子的制备：将金纳米粒子与拉曼报告分子NBA(尼罗蓝A)混合，室温孵育1-10分钟，离心，弃去上层清液，重新分散在PBS-T(MgCl2)溶液中，再与适配体S Aptamer 1混合后，-20℃下冷冻1-5h，解冻后，用PBS-T(MgCl2)洗涤数次后，加入TBS溶液封闭剩余活性位点，室温孵化，离心，用PBS-T(MgCl2)溶液洗涤数次，最后弃去上层清液，重新分散在PBS-T(MgCl2)溶液中，获得免疫金信号纳米粒子。
3)增强型捕获新冠SARS-CoV-2病毒的二维平面基底的制备：取金纳米粒子，离心，弃去上清液，重新分散在去离子水中，再与巯基修饰的适配体S Aptamer 1混合后，-80℃下冷冻0.5-5h，解冻后，获得修饰了S蛋白适配体的金纳米粒子；取上述金纳米粒子，滴在二维平面上，烘箱30℃-55℃烘干，放入PBS和TBS混合液，室温下封闭，取出，用PBS-T(MgCl2)溶液洗涤，制得所述的增强型捕获新冠SARS-CoV-2病毒的二维平面基底。
4)夹层(三明治式)结构的制备：将不同浓度的新冠假病毒SARS-CoV-2(106TU/ml、105TU/ml、104TU/ml、103TU/ml、102TU/ml、10TU/ml、1TU/ml)滴于制得的增强型捕获新冠SARS-CoV-2病毒的二维平面基底后，室温孵育，PBS-T溶液洗涤数次，再滴上免疫金信号纳米粒子，室温孵育，PBS溶液洗涤数次，构筑成三明治夹心结构。
5)新冠病毒SARS-CoV-2S蛋白的检测：待形成明治夹心结构干了之后通过便携式拉曼光谱仪，直接进行拉曼检测(激光波长785nm)。
本发明的优点和有益效果：
本发明的检测方法利用新冠病毒特异性识别的原理，通过增强型捕获新冠SARS-CoV-2病毒的二维平面基底上金纳米粒子的S蛋白适配体与S蛋白(或其他抗原组分)发生特异性免疫之后，再与免疫金信号纳米粒子结合，构筑成三明治结构。本发明方法以适配体作为特异性识别元件，特异性结合SARS-CoV-2病毒上的S蛋白，不需要进行核酸提取、扩增，相比于免疫分析法中使用抗体作为识别元件，一方面能够稳定纳米材料在检测体系中的分散状态；另一方面能够高特异性和高亲和力地识别目标蛋白，并且超灵敏、稳定性较好，制备成本低，在很大程度上提高了检测的准确性，检测速度更快。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为本发明的原理示意图。
图2为不同浓度假病毒检测限以及其他病毒(HKU1和H3N2)特异性检测
具体实施方式
为了探索检测新冠SARS-CoV-2病毒抗原的可行性，使用购买于复百澳(苏州)生物医药科技有限公司的假型新冠SARS-CoV-2病毒(PSV)，一种能够表达SARS-CoV-2S蛋白的慢病毒作为靶标。这种PSV已被广泛用于模拟SARSCoV-2假病毒颗粒，是一种逆转录病毒，能够整合另外一种不同种类病毒的囊膜糖蛋白，从而形成的具有外源性病毒的囊膜，而基因组保持着反转录病毒本身基因组特性的病毒，该病毒的囊膜表面含有新冠病毒的刺突糖蛋白(S蛋白)，可以模拟新冠病毒颗粒。
1)纳米金溶胶的制备：取200mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取4.5mL质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾30min反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶。
2)免疫金信号纳米粒子的制备：将100ul金纳米粒子与5ul 30uM提供拉曼信号的报告分子NBA(尼罗蓝A)混合，室温孵育10分钟，离心，弃去上层清液，重新分散在PBS-T(MgCl2)溶液中，再与适配体S Aptamer 1混合后，-20℃下冷冻2h，解冻后，用PBS-T(MgCl2)洗涤2次后，加入TBS溶液封闭剩余活性位点，室温孵化1h，离心，用PBS-T(MgCl2)溶液洗涤2次，最后弃去上层清液，重新分散在300ul PBS-T(MgCl2)溶液中，获得免疫金信号纳米粒子。
Aptamer 1的序列为：5-SH-CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCTGGTCCAAGGGCGTTAATGGACA-3
3)增强型捕获新冠SARS-CoV-2病毒的二维平面基底制备：取100ul将金纳米粒子，离心，弃去上清液，重新分散在去离子水中，再与巯基修饰的适配体S Aptamer 1混合后，-80℃下冷冻3h，解冻后，获得修饰了识别S蛋白的适配体的增强信号金纳米粒子；取上述增强信号金纳米粒子，滴在二维平面上，所述的二维平面是渡有金膜的硅片。烘箱30℃-55℃烘干，放入PBS和TBS混合液，室温下封闭，取出，用PBS-T(MgCl2)溶液洗涤，制得所述的增强型捕获新冠SARS-CoV-2病毒的二维平面基底。
4)夹层(三明治式)结构的制备：将1ul不同浓度新冠假病毒SARS-CoV-2(106TU/ml、105TU/ml、104TU/ml、103TU/ml、102TU/ml、101TU/ml、100TU/ml)分别滴于制得增强型捕获新冠SARS-CoV-2病毒的二维平面基底后，室温孵育30min，PBS-T溶液洗涤1-3次，再滴上6ul增强信号金纳米粒子，室温孵育30min，PBS溶液洗涤3次，构筑成三明治夹心结构(免疫金信号纳米粒子-抗原蛋白-增强型捕获新冠SARS-CoV-2病毒的二维平面基底)。
5)新冠病毒SARS-CoV-2S蛋白的检测：待形成明治夹心结构干了之后通过便携式拉曼光谱仪，直接进行拉曼检测(激光波长785nm)。
检测的结果见图2。
结果证明，至少能检测到10TU mL-1。(指每毫升中含有的具有生物活性病毒颗粒数为10个)。且当用同样的方式，将其他病毒结合，检测结果无信号。由此可证明，此方案检测新冠病毒为特异性检测。
和现有的抗原检测方法相比，胶体金抗原检测试纸条的灵敏度和准确度较低，较难实现病毒感染早期的诊断。本发明的方法将具有超高灵敏度的表面增强拉曼光谱技术(SERS)与能够特异性识别病毒S蛋白抗原的核酸适配体相结合，实现了在15分钟内快速、超高灵敏地检测出新型冠状病毒及其变异株。一方面，该SARS-CoV-2诊断平台利用耦合型表面增强拉曼技术，该技术具有单分子检测的能力，从而实现更高的识别率和更低的检出极限(10TU mL-1),此外还包含了三种识别适配体，极大地减少了因病毒突变而导致的假阴性。另一方面，该检测平台无需提取、扩增等核酸PCR方法所需的预处理，极大地节省了检测时间。由于快速、超灵敏、易于操作等特点以及混合检测的能力，这一传感器在大规模范围内筛查新冠病毒和其他流行病感染者方面具有巨大的应用前景。
本发明的灵敏度达到10TU mL-1，比荧光试纸条灵敏度高3-4个数量级，比核酸检测荧光PCR相比灵敏1-2个数量级。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种二维平面结合SERS检测新冠病毒SARS-CoV-2 抗原的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagcaccgac cttgtgcttt gggagtgctg gtccaagggc gttaatggac a 51
Claims (10)
1.一种二维平面结合SERS检测新冠病毒SARS-CoV-2抗原的方法，包括如下步骤：
1)制备拉曼金属纳米粒子；
2)拉曼金属纳米粒子与拉曼报告分子混合，室温孵育1-10分钟，离心，弃去上层清液，重新分散在PBS-T溶液中，再与SARS-CoV-2的适配体混合后，-20℃下冷冻1-5h，解冻后，用PBS-T洗涤数次后，加入TBS溶液封闭剩余活性位点，室温孵化，离心，用PBS-T溶液洗涤数次，最后弃去上层清液，重新分散在PBS-T溶液中，获得免疫金属信号纳米粒子；
3)取金属纳米粒子，离心，弃去上清液，重新分散在去离子水中，再与巯基修饰的SARS-CoV-2适配体混合后，-80℃下冷冻0.5-5h，解冻后，获得增强信号金属纳米粒子；取上述增强信号金属纳米粒子，滴在二维平面上，烘箱30℃-55℃烘干，放入PBS和TBS混合液，室温下封闭，取出，用PBS-T溶液洗涤，制得附着新冠病毒SARS-CoV-2S蛋白增强信号金属纳米粒子的二维平面；
4)取待测样品，滴到附着免疫纳米粒子的二维平面上，再滴入步骤2)的免疫金属信号纳米粒子，室温孵育，PBS溶液洗涤数次，构筑成三明治夹心结构；
5)拉曼检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，SARS-CoV-2适配体采用S蛋白核酸适配体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的S蛋白核酸适配体SAptamer1为5-CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCTGGTCCAAGGGCGTTAATGGACA-3。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的拉曼金属纳米粒子通过以下方法制得：取200mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液在磁力搅拌下加热至沸腾；然后取2-4mL质量分数为1％柠檬酸钠溶液，加入沸腾的氯金酸溶液中，待沸腾20-30min反应结束，冷却至室温，制成纳米金溶胶。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的金属纳米粒子的粒径为30-35nm,紫外吸收波长为536nm。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二维平面是渡有金膜的硅片。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的洗涤液PBS-T为：PBS溶液中加入浓度为10-50mM的MgCl2及浓度为0.01％-1％的吐温-20。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的免疫金属信号纳米粒子制备中，将50-100ul金纳米粒子与2-8ul 30uM NBA溶液混合，室温孵化1-10分钟。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)包括步骤：将病毒样本滴在制得的附着新冠病毒SARS-CoV-2S蛋白增强信号金属纳米粒子的二维平面上反应后，再滴免疫金属信号纳米粒子反应，室温孵育，PBS-T(MgCl2)溶液洗，直接进行拉曼检测，在1-30分钟内实现新冠抗原的快速检出拉曼光谱结果。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，拉曼光谱仪为便携式拉曼光谱仪，激发波长为785nm。
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