CN103528987B - 抗体修饰与太赫兹波谱联用的转基因蛋白检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗体修饰与太赫兹波谱联用的转基因蛋白检测方法。目的是提供的方法应具有准确性高、检测快速方便的特点。技术方案是：抗体修饰与太赫兹波谱联用的转基因蛋白检测方法，包括如下步骤：（1）石英玻片清洗；（2）石英玻片表面修饰；（3）石英玻片表面活化；（4）抗体固定；（5）石英玻片表面多余位点封闭；（6）固定转基因蛋白；（7）采集石英玻片上待测点与参比点的太赫兹时域波谱；（8）比较石英玻片待测点与参比点太赫兹时域波谱。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测转基因蛋白的方法，尤其涉及一种抗体修饰与太赫兹波谱联用的转基因蛋白检测方法。
背景技术
随着生物技术的发展，转基因技术的广泛应用，转基因产品渐渐走进了人们的生活。由于对转基因生物出现的新组合和性状在不同遗传背景下的表达以及对环境和人类的影响尚缺乏认识，因此，对转基因生物做好安全性检测和评估是非常必要的。目前检测转基因产品的方法很多，比如聚合酶链式反应、酶联免疫法等等，不过这些方法相对比较耗时，难以满足日益增长的快速检测需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述背景技术的不足，提供一种抗体修饰与太赫兹波谱联用的转基因蛋白检测方法，该方法应具有准确性高、检测快速方便的特点。
本发明采用的技术方案入下：
抗体修饰与太赫兹波谱联用的转基因蛋白检测方法，包括如下步骤：
（1）石英玻片清洗；
在石英玻片一面上做标记，先后使用去离子水、洗洁精溶液、去离子水、浓盐酸/甲醇溶液、去离子水、浓硫酸和去离子水清洗，并用氮气吹干；
（2）石英玻片表面修饰；
取3-氨基丙基-三甲氧基硅烷溶液置于经过清洗的石英玻片的标记面上，取另一经过清洗且标记面朝下的石英玻片盖上，在湿润环境下修饰后分开石英玻片，之后用甲醇超声清洗石英玻片，氮气吹干后保存；
（3）石英玻片表面活化；
称取N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、二甲氨基吡啶，量取三乙基胺及无水二甲基甲酰胺，配置上述物质的混合液；取上述混合液置于经过表面修饰的石英玻片的标记面上，取另一经过表面修饰且标记面朝下的石英玻片盖上，活化后分开石英玻片，之后用甲醇超声清洗并用氮气吹干；
（4）抗体固定；
取Pluronic 127、海藻糖，并用PBS缓冲液溶解，取溶解后的混合溶液与抗体溶液混匀，在经过表面活化的石英玻片的标记面上抗体点样两次，分别是待测点与参比点，保持湿润环境并过夜；
（5）石英玻片表面多余位点封闭；
配制酪蛋白/PBS溶液，充分溶解，在离心管中加入经过抗体固定的石英玻片和上述酪蛋白/PBS溶液混匀并静置；之后依次取出石英玻片，用PBS缓冲液清洗石英玻片两次，最后在PBS缓冲液中保存；
（6）固定转基因蛋白；
将转基因蛋白溶解在PBS缓冲液中，稀释成不同待测浓度，并将待测转基因蛋白溶液滴加在已封闭好的石英玻片上的待测点，湿润环境下孵育，之后清洗并用氮气吹干；
（7）采集石英玻片上待测点与参比点的太赫兹时域波谱；
在太赫兹时域波谱系统的波谱频宽为0.1-3.5THz区间分别采集同一石英玻片上待测点与参比点的太赫兹时域波谱；
（8）比较石英玻片待测点与参比点太赫兹时域波谱；
用绘图软件在同一图中逐个画出各个样品上待测点与参比点太赫兹时域波谱图形，若待测点的最高峰峰值小于参比点脉冲峰峰值的X值，表明该石英玻片上待测点上有转基因蛋白；若待测点的最高峰峰值占参比点脉冲峰峰值的X值及以上，表明该石英玻片不含转基因蛋白或转基因蛋白浓度过低无法检测出。
所述步骤（1）、（2）、（3）、（5）中石英玻片的清洗均在染色缸和染色架中进行。
所述步骤（3）中混合液为粉红色。
所述步骤（4）中Pluronic 127质量与PBS缓冲液质量的比值为0.01%，海藻糖质量与PBS缓冲液质量的比值为20%，混合液与抗体溶液的混合比例均为1:1。
所述太赫兹时域光谱系统，在充氮气的情况下采集样本的太赫兹时域光谱；测量环境湿度要求<0.2%。
所述X值为90%。
本发明具有的有益效果是：本发明联用抗体修饰技术与太赫兹波谱技术，利用已固定转基因蛋白与未固定转基因蛋白的检测点的太赫兹时域波谱差异来检测转基因蛋白；因太赫兹波对大分子（DNA、蛋白质）敏感，故该方法准确性高；与酶联免疫法相比，该方法能避免后续的荧光显色步骤，节约时间，并且能做到免标记；由于固定转基因蛋白之前的所有步骤均能事先完成，仅固定转基因蛋白与或许相应太赫兹波谱占用时间很短，因此该检测方法能满足日益增长的快速检测需求。
附图说明
图1为石英玻片俯视示意图。
图2为获取太赫兹波谱的原理图。
图3为可以区分样本和参比的太赫兹时域波谱示意图。
图中有，石英玻片A，待测点B，参比点C，标记面D，检测器E。
具体实施方式
太赫兹波是一种波长介于微波与红外辐射之间的电磁波，其频率为0.1-10THz。它的光子能量非常低，仅为X射线的一百万分之一，而且太赫兹波的光子能量低于各种化学键的键能，故不会引起对人体或检测材料有害的电离反应。一般情况下，有机分子内化学键的振动吸收频率主要表现在普通红外波段。但是对于分子与分子之间的相对弱的相互作用（如氢键等）以及偶极子的旋转与振动跃迁、大分子的骨架振动、晶体中晶格的低频振动吸收频率等，一般表现在太赫兹红外波段。因此，尽管太赫兹辐射的能量很低，但是大量的分子，尤其是许多有机大分子（DNA、蛋白质等）在这一频段内，表现出强烈的吸收和色散。太赫兹时域波谱技术（Terahertz time domain spectroscopy，THz-TDS）是国际上近年来发展起来的一项新的研究与检测技术。至今，太赫兹时域波谱技术已经在国防、医药、化学、食品、材料等方面有着许多的应用。由于转基因蛋白抗体及转基因蛋白均属于蛋白质，因此使用太赫兹时域波谱手段检测转基因蛋白具有非常大的潜力。
所述太赫兹时域波谱系统推荐采用z-omega公司生产的型号为z3的太赫兹时域波谱系统。
所述的转基因蛋白为Cry1Ab抗虫蛋白。
所述的转基因蛋白抗体为Cry1Ab抗体。
下面结合实施实例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
抗体修饰与太赫兹波谱联用的转基因蛋白检测方法，包括如下步骤（1）～（8）：
（1）石英玻片A清洗；
在若干片石英玻片（1-100个）的一面用钻头做好数字标记（1、2、3……），将石英玻片依次放在染色架中，再将染色架放入配套的染色缸中。首先使用去离子水清洗5遍，然后在200ml体积分数为2%的洗洁精溶液中超声清洗1小时，置于摇床上振荡过夜。过夜后再次使用去离子水清洗5遍，并在通风橱中加入200ml的浓盐酸/甲醇溶液（浓盐酸与甲醇体积比为1:1），摇床振荡1小时。振荡结束后使用去离子水清洗5遍，再在通风橱中加入200ml质量分数为98%浓硫酸，摇床振荡1小时。最后使用去离子水清洗石英玻片5遍，氮气吹干。
（2）石英玻片表面修饰；
换上干净手套，取若干个培养皿，每个培养皿中放置两个离心管的盖子作为支架，再将清洗后的石英玻片放置在离心管盖上，数字标记面D朝上，与培养皿底面保持一定距离。再用移液枪取600μl 97%的3-氨基丙基-三甲氧基硅烷（APTMS）（Sigma-Aldrich公司）置于石英玻片上，取另一清洗后的石英玻片（数字标记面朝下）覆盖在该石英玻片上。在培养皿中滴加几滴水保持湿润环境，盖上培养皿盖，静置1小时进行修饰。修饰完成后将石英玻片分开，依次放置于染色架上。加入200ml甲醇超声清洗15min，重复三次。在通风橱内用氮气吹干石英玻片，并将石英玻片装入玻片盒中，充满氮气，使用封口膜密封好，装入干燥器中备用。
（3）石英玻片表面活化；
用电子天平在放有磁力搅拌子的干净的称量瓶中称取160mg的N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC），清零天平，再称取8mg二甲氨基吡啶（DMAP）。用移液枪先后量取250μl的三乙基胺及3.2ml无水二甲基甲酰胺（DMF）并加在称量瓶中。迅速将瓶口用封口膜封好，置于磁力搅拌器上，磁力搅拌10分钟，至溶液显示粉红色即可。取若干个培养皿，每个培养皿中放置两个离心管盖作为支架，再将经表面修饰后的石英玻片放置在离心管盖上面，有数字标记的一面朝上，用移液枪取600μl上述粉红色溶液置于石英玻片上，并取另一经表面修饰后的石英玻片（有数字标记的一面朝下）覆盖在该石英玻片上，静置4小时进行活化。活化过程完毕后将玻片分开，加入200ml甲醇超声清洗15分钟，再在通风橱内用氮气吹干。
所述DSC、DMAP、三乙基胺及DMF的混合液不能含水，混合液呈粉红色则证明无水，符合要求，否则该混合液需重新配制。
以上三个清洗、表面修饰表面活化步骤与现有方法都相同。
（4）抗体固定；
取出分装好的20μl的Cry1Ab抗体（选用美国Abraxis LLC公司生产的Cry1Ab抗体），解冻30分钟。将离心管盖子放入分析天平中，称取0.001g的Pluronic F-127，并倒入离心管中。再称取2g海藻糖（Trehalose）置于称量纸上，将称量好的粉末倒入上述离心管中。向离心管中加入10ml的pH值为7.6的PBS缓冲液（外购获得；或自行配备），充分混匀。取以上混合液20μl与20μl抗体溶液混匀。再取若干个培养皿，每个培养皿中放置两个离心管盖作为支架，再将石英玻片放置在离心管盖上面，有数字标记的一面朝上，用移液枪进行抗体点样，每个石英玻片上分开点两次，每次2μl，其中接近标记的点作为待测点B，远离标记的点作为参比点C。在培养皿中滴加1滴水保持湿润环境，盖上培养皿盖，过夜。
所述的Pluronic 127其作用为防止抗体间相互吸附。
所述的Trehalose其作用为防止液体蒸发，保持抗体活性。
所述的Pluronic 127质量与PBS缓冲液质量的比值为0.01%，Trehalose质量与PBS缓冲液质量的比值为20%，PBS缓冲液的密度可记为1g/ml。
所述的混合液与抗体溶液，无论抗体有没有稀释过，混合比例均为1:1。
（5）石英玻片表面多余位点封闭；
称取3g酪蛋白（Casein），量取150ml PBS溶液配制2%的Casein/PBS溶液，加热混匀至完全溶解（温度可以选择为50℃），恢复至室温。取若干50ml规格离心管，依次将石英玻片放入其中，每个离心管内一片，加入50ml以上Casein/PBS溶液，振荡混匀1.5分钟之后静置1小时进行多余位点封闭。依次取出石英玻片放在染色架上，在染色缸中用PBS缓冲液清洗石英玻片两次。最后染色缸中重新加入200ml PBS缓冲液，置于4℃冰箱保存备用。
（6）固定转基因蛋白Cry1Ab；
取出已封闭好的石英玻片，有数字标记的一面朝上放置于培养皿中。取已解冻的1mg转基因蛋白Cry1Ab，溶解在PBS缓冲液中，稀释成不同待测浓度，（将不同浓度的待测溶液分别放置在不同石英玻片的待测点上），在培养皿中滴加1滴水保持湿润环境，盖上培养皿盖，孵育1小时后清洗用氮气吹干。
（7）采集石英玻片上待测点与参比点的太赫兹时域波谱；
打开激光，电脑，锁相放大器以及氮气阀门，此时太赫兹时域波谱系统内开始充进氮气，湿度下降，激光预热半小时后方可进行测量；打开太赫兹时域波谱系统测量用的盖子，并将石英玻片放进激光光路中，用固定模具固定；在充氮气的情况下，在太赫兹时域波谱系统的波谱频宽为0.1-3.5THz区间分别采集同一石英玻片待测点与参比点的太赫兹时域波谱。其中测量环境湿度要求<0.2%，温度为室温；用以上方法逐个测量样本的太赫兹透射时域波谱并保存，获得所有石英玻样片本各自独立的波谱数据组。
（8）比较石英玻片待测点与参比点太赫兹时域波谱；
用绘图软件在同一图中逐个画出各个样品上待测点与参比点太赫兹时域波谱图形，若待测点的最高峰峰值小于参比点脉冲峰峰值的X值（X值可以根据需要确定，优选90%），表明该石英玻片上待测点上有转基因蛋白；若待测点的最高峰峰值占参比点脉冲峰峰值的X值及以上（X值可以根据需要确定，优选90%），表明该石英玻片不含转基因蛋白或转基因蛋白浓度过低无法检测出。
所述的绘图软件可选择origin，但不限于此。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (5)
1.抗体修饰与太赫兹波谱联用的转基因蛋白检测方法，包括如下步骤：
(1)石英玻片清洗；
在石英玻片(A)一面上做标记，先后使用去离子水、洗洁精溶液、去离子水、浓盐酸/甲醇混合溶液、去离子水、浓硫酸和去离子水清洗，并用氮气吹干；
(2)石英玻片表面修饰；
取3-氨基丙基-三甲氧基硅烷溶液置于经过清洗的石英玻片的标记面(D)上，取另一经过清洗且标记面朝下的石英玻片盖上，在湿润环境下修饰后分开石英玻片，之后用甲醇超声清洗石英玻片，氮气吹干后保存；
(3)石英玻片表面活化；
称取N,N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯、二甲氨基吡啶，量取三乙基胺及无水二甲基甲酰胺，配置上述物质的混合液；取上述混合液置于经过表面修饰的石英玻片的标记面上，取另一经过表面修饰且标记面朝下的石英玻片盖上，活化后分开石英玻片，之后用甲醇超声清洗并用氮气吹干；
(4)抗体固定；
取Pluronic F-127、海藻糖，并用PBS缓冲液溶解，取溶解后的混合溶液与抗体溶液混匀，在经过表面活化的石英玻片的标记面上抗体点样两次，分别是待测点(B)与参比点(C)，保持湿润环境并过夜；
(5)石英玻片表面多余位点封闭；
配制酪蛋白/PBS混合溶液，充分溶解，在离心管中加入经过抗体固定的石英玻片和上述酪蛋白/PBS混合溶液混匀并静置；之后依次取出石英玻片，用PBS缓冲液清洗石英玻片两次，最后在PBS缓冲液中保存；
(6)固定待测转基因蛋白；
将待测转基因蛋白溶解在PBS缓冲液中，稀释成不同待测浓度，并将待测 转基因蛋白溶液滴加在已封闭好的石英玻片上的待测点，湿润环境下孵育，之后清洗并用氮气吹干；
(7)采集石英玻片上待测点与参比点的太赫兹时域波谱；
在太赫兹时域波谱系统的波谱频宽为0.1-3.5THz区间分别采集同一石英玻片上待测点与参比点的太赫兹时域波谱；
(8)比较石英玻片待测点与参比点太赫兹时域波谱；
用绘图软件在同一图中逐个画出各个样品上待测点与参比点太赫兹时域波谱图形，若待测点的最高峰峰值小于参比点脉冲峰峰值的X值，表明该石英玻片上待测点上有转基因蛋白；若待测点的最高峰峰值占参比点脉冲峰峰值的X值及以上，表明该石英玻片不含转基因蛋白或转基因蛋白浓度过低无法检测出；
所述X值为90％。
2.根据权利要求1所述的抗体修饰与太赫兹波谱联用的转基因蛋白检测方法，其特征在于所述步骤(1)、(2)、(3)、(5)中石英玻片的清洗均在染色缸和染色架中进行。
3.根据权利要求1所述的抗体修饰与太赫兹波谱联用的转基因蛋白检测方法，其特征在于所述步骤(3)中混合液为粉红色。
4.根据权利要求1所述的抗体修饰与太赫兹波谱联用的转基因蛋白检测方法，其特征在于所述步骤(4)中Pluronic 127质量与PBS缓冲液质量的比值为0.01∶100，海藻糖质量与PBS缓冲液质量的比值为1∶5，混合液与抗体溶液的混合比例均为1:1。
5.根据权利要求4所述的抗体修饰与太赫兹波谱联用的转基因蛋白检测方法，其特征在于所述太赫兹时域光谱系统，在充氮气的情况下采集样本的太赫兹时域光谱；测量环境湿度要求<0.2％。
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