CN110780078A - 一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测试剂盒技术领域，具体是公开了一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括包被Occludin包被抗体的酶标板、HRP标记的羊抗兔IgG、兔抗人Occludin多克隆抗体、洗涤液、样品稀释液、显色剂、终止液、质控品和标准品，所述试剂盒以Occludin包被抗体和羊抗兔IgG为基础，以双抗体夹心法建立Occludin蛋白检测的ELISA方法。本发明克服了现有技术的不足，可以有效地检测血清样本中的Occludin蛋白的水平操作简便、快速，并且检测准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。

Description

一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒
技术领域
本发明涉及检测试剂盒技术领域，具体属于一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒。
背景技术
血脑屏障(BBB)是维持中枢神经系统独特内环境稳定的重要结构，是中枢神经系统神经元赖以进行各项生理活动的前提与基础。血脑屏障的基本结构包括：脑微血管内皮细胞及其间紧密连接(TJ)，内皮基膜及星形胶质细胞终足。其中，脑微血管内皮细胞及其间紧密连接是血脑屏障的核心结构。
各组织器官紧密连接(的基本超微结构特点类似，均表现为：透射电镜下，相邻细胞交界处局部胞膜外层融合；冰冻烛刻电镜下，细胞交界处融合胞膜内大量“纤维”彼此吻合并形成复杂的三维网状结构。目前认为，TJ在结构上是由一组蛋白分子元件所构成的复合体。这些分子元件包括：①跨膜蛋白，主要由Occludins,claudins,junctionassociatedmolecules(JAM)等蛋白家族构成；②胞架附属蛋白，主要由zonulaoccludens(ZO)等蛋白家族构成。细胞膜上这些TJ分子元件彼此相互作用并与邻近细胞膜上紧密连接蛋白相聚合、促使胞膜局部“融合”进而形成冰冻虫刻电镜下紧密连接所表现的复杂三维网状超微结构。在组织分布上，构成的多种蛋白其表达有明显的组织特异性。这些表达不同的蛋白分子在人体内可以组装形成具有不同通透性功能的组织屏障进而适应不同组织器官的功能需要。在血脑屏障中，目前发现构成的主要蛋白有：①跨膜蛋白Occludins，claudin-5，claudin-1，JAM等；②胞浆附属蛋白ZO-1，ZO-2，ZO-3，7H6，cingulin等。
Occludin是最早发现的跨膜蛋白，持续高表达于脑内皮细胞边缘，呈连续带状分布。经四次跨膜，形成了胞内的梭基端结构域、氨基端结构域和两个胞外的结构域。梭基末端结构域富含丝氨酸，苏氨酸，赂氨酸残基，这是一些蛋白质酪氨酸激酶的目标。它对修正紧密连接蛋白装配和功能维持具有重要作用；梭基端的胞外结构域富含酪氨酸残基；可能与紧密连接的选择性扩散作用有关；氨基端的胞外结构域中含有大量的酪氨酸和甘氨酸残基，它能可逆破坏屏障的完整性氨基末端结构域的去除，则会扰乱的密封和屏障性能。通过不同的结构域，与其他蛋白相互作用，共同维持着紧密连接复合体结构和功能的稳定。
Occludin与脑血管内皮细胞的“屏障”作用密切相关，其正常表达对血脑屏障功能的稳定具有积极作用，Occludin的高表达可以降低血脑屏障的通透性。因此，Occludin对脑微血管内皮细胞间紧密连接和血脑屏障通透性的改变起着至关重要的作用。通过检测脑出血后血脑屏障紧密连接蛋白Occludin表达变化，对于阐明脑出血后脑屏障紧密连接破坏具有重要意义。
现临床上主要通过增强CT和脑脊液检测来判断血脑屏障损伤。增强CT指的是在CT平扫基础上，对发现的可疑部位，在静脉注射造影剂后有重点的进行检查的一种手段，血脑屏障损伤后造影剂可漏入脑实质，籍此通过CT扫描时判断血脑屏障损伤。脑脊液检测通过检测脑脊液清蛋白与血液清蛋白的比值来判断血脑屏障损伤程度，由于脑脊液中的清蛋白是通过血脑屏障来源于血浆，血脑屏障通透性增加，脑脊液中清蛋白含量增加，脑脊液清蛋白与血液清蛋白的比值在小于9.9-14为轻度损伤，15-30为中度损伤，31-100为严重损伤。
由于增强CT在使用时需要注射显影剂，极少数人对造影剂可产生过敏反应，另据患者普遍反映，注射造影剂后会明显产生不适感；且检测费用昂贵；另增强CT是在CT技术的基础上升级，也具有CT的普遍缺点。
经研究发现，在正常对照组脑组织中，微血管内皮细胞连接处均可见大量Occludin强阳性表达，并呈连续条带状分布；在脑出血发生后6h，即可检测到血肿周围脑微血管内皮细胞间Occludin的表达降低，呈弱阳性表达；脑出血发生后24h至72h其表达维持在较低水平，呈阴性或弱阳性表达；随着时间的推移，Occludin表达下降的情况逐渐缓解，7d时脑出血组与正常对照组的内皮细胞间紧密连接表达强度无明显差别。
因此，发明人利用Occludin蛋白检测作为单一标志物，采用酶联免疫吸附实验对Occludin蛋白定量检测从而对血脑屏障损伤进行判断，为了提高检测的灵敏度，快速准确地检测Occludin蛋白，满足行业对快速灵敏检测的需求，本发明基于Occludin蛋白特异性抗体，并在特异性抗体的基础上开发了商业化的Occludin蛋白ELISA检测试剂盒，可作为Occludin蛋白定量检测的有效、快速的检测手段。
发明内容
本发明的目的是提供了一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，克服了现有技术的不足，可以有效地检测血清样本中的Occludin蛋白的水平操作简便、快速，并且检测准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。
为解决上述问题，本发明所采取的技术方案如下：
一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括包被Occludin包被抗体的酶标板、HRP标记的羊抗兔IgG、兔抗人Occludin多克隆抗体、洗涤液、样品稀释液、显色剂、终止液、质控品和标准品，所述试剂盒以Occludin包被抗体和羊抗兔IgG为基础，以双抗体夹心法建立Occludin蛋白检测的ELISA方法。
进一步，所述Occludin包被抗体的浓度为10ng/L，所述兔抗人Occludin多克隆抗体的浓度为15ng/L，所述羊抗兔IgG的浓度为1ng/L。
进一步，所述质控品和校准品来自于人体血清，所述质控品的浓度为100ng/L，所述校准品的浓度梯度为120±12ng/L、80±8ng/L、40±4ng/L、20±2ng/L、10±1ng/L、0ng/L，校准品或质控品的缓冲液为含有0.1mol/L的PB、0.15mol/L的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％tween-20、pH值为6.5的缓冲液。
进一步，所述显色剂包括显色剂A和显色剂B，所述显色剂A为10g/L的过氧化脲素溶液，所述显色剂B为2g/L的TMB·2HCl溶液，显色液使用时取等体积的A、B液混匀。
进一步，所述洗涤液为25倍浓缩的磷酸缓冲液，所述终止液为2M H2SO4溶液。
进一步，所述试剂盒的检测对象为血清、细胞上清、血浆或组织。
根据上述试剂盒在Occludin蛋白定量检测中的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：
1)加样：先加入50ul待测样本/Occludin校准品/Occludin质控品，再加入50ulOccludin结合抗体于相应孔中，轻拍混匀，设空白孔；
2)温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；
3)洗板：取出反应板，甩尽板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；
4)加酶：每孔加入两滴或100ul的GR酶结合物，空白孔不加；
5)温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；
6)洗板：取出反应板，甩尽板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；
7)显色：每孔加入显色剂A、B溶液各一滴或各50ul，充分混匀，置37℃温育15分钟；
8)终止：每孔尽快加入终止液1滴轻拍混匀；
9)测定：用酶标仪以空白对照调零，测定各孔OD.值；
10)结果计算：以校准品浓度作横坐标，OD.值作纵坐标，以双对数拟合绘制校准曲线。通过待测样本的OD.值可在校准曲线上查出其对应浓度值。
本发明与现有技术相比较，本发明的实施效果如下：
本发明所述一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，选用Occludin抗原和羊抗兔IgG，可以有效地检测血清样本中的Occludin蛋白的水平操作简便、快速，并且检测准确度和精密度好、特异性高、灵敏度好、稳定性好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。
试剂盒的主要组成部分的包被和检测抗体均为自主研发产品，因此相对于进口国外产品大大降低了成本，将在Occludin蛋白和血脑屏障损伤的相关基础和临床研究中发挥重要作用，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明不仅限于这些实例，在为脱离本发明宗旨的前提下，所为任何改进均落在本发明的保护范围之内。
实施例1
本实施例提供了一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒的组成成分及其制备方法：
1、试剂盒的组成
1)Occludin包被板：包被Occludin单克隆抗体的微孔板48孔/96孔板
2)Occludin校准品1套A-F：来源于人血清，浓度120±12ng/L、80±8ng/L、40±4ng/L、20±2ng/L、10±1ng/L、0ng/L，可溯源至制造商选定的测量程序。 1×0.5ml
3)Occludin结合抗体：兔抗人Occludin多抗。 1×2.5ml/1×5.0ml
4)Occludin酶结合物：HRP标记的羊抗兔IgG。 1×5.0ml/2×5.0ml
5)Occludin质控品：来源于人血清，质控范围为90ng/L±13.5ng/L。1×0.5ml
6)显色剂A：主要成分为过氧化脲素。 1×5.0ml
7)显色剂B：主要成份为3,3,5,5,－四甲基联苯胺盐酸盐(TMB·2HCl)。1×5.0ml
8)浓缩洗涤液(25×)：浓缩的磷酸缓冲液，使用前按1：24稀释。
1×20.0ml
9)终止液：2mol/L硫酸溶液。 1×5.0ml
10)封板膜2张
11)自封袋 1个
2、试剂盒制备方法：
1)各种缓冲液及试剂的配制：
A、包被缓冲液：0.050M、pH9.6的CB(碳酸盐缓冲液)
Na2CO3：16.0克
NaHCO3：29.0克
蒸馏水溶解，定容至1000ml；
B、样品/洗涤缓冲液：pH7.2的10×PBS-Tween 20
Na2HPO4·12H2O：58克
KH2PO4：4克
NaCl：100克
KCl：4克
蒸馏水溶解，定容至1000ml
加Tween 20：20ml；
C、酶标记物稀释液
10×PBS-Tween 20：10ml
FCS(小牛血清)：20ml
蒸馏水溶解，定容至1000ml；
酶稳定剂：1克
生物防腐剂：1ml；
D、显色剂A：
柠檬酸：35.5克
过氧化脲：10克
蒸馏水溶解，定容至1000ml
Tween 20：10ml；
E、显色剂B：
柠檬酸：120克
EDTA-2Na：1克
TMB·2HCl：2克
蒸馏水溶解，定容至1000ml；
F、终止液：2M H2SO4
浓硫酸(95-98％)：22.2ml
蒸馏水：177.3ml
配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。
2)预包被板的制备：
将Occludin包被抗体溶于pH＝9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液中，制成预包被液，在酶标板上每孔按0.1μg/孔加入100μl，置4℃放置18-24小时，取出，甩掉包被液，用样品/洗涤缓冲液洗涤，经1(w/v)％BSA-0.05M乙醇胺封闭16小时、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。
3)结合抗体和酶结合物的稀释比例均由方阵滴定实验确定。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG使用酶标记物稀释液稀释。
实施例2
本实施例提供了一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒的检测方法包括以下步骤：
1)洗涤液的配制：将20ml浓缩洗涤液加入500ml的容量瓶中，再加入480ml蒸馏水，振荡使浓缩洗涤液充分溶解；
2)将试剂盒平衡至室温后，将所需的微孔条取出固定于板架上，编好顺序；
3)加样：先加入50ul待测样本/Occludin校准品/Occludin质控品，再加入50ulOccludin结合抗体于相应孔中，轻拍混匀，设空白孔；
4)温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；
5)洗板：取出反应板，甩尽板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；
6)加酶：每孔加入两滴或100ul的Occludin酶结合物，空白孔不加；
7)温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；
8)洗板：取出反应板，甩尽板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；
9)显色：每孔加入显色剂A、B溶液各一滴或各50ul，充分混匀，置37℃温育15分钟；
10)终止：每孔尽快加入终止液1滴轻拍混匀；
11)测定：用酶标仪以空白对照调零，测定各孔OD.值；
12)质量控制：如果Occludin最高浓度校准品OD.≥0.8，试验结果为有效；
13)结果计算：以校准品浓度作横坐标，OD.值作纵坐标，以双对数拟合绘制校准曲线。通过待测样本的OD.值可在校准曲线上查出其对应浓度值(表1为校准品浓度和对应的平均吸光度(OD)值见)。
表1：校准品浓度和对应的平均吸光度(OD)值
浓度ng/L 0 10 20 40 80 120
平均OD值 0.010 0.095 0.210 0.355 0.741 1.332
试剂盒检测
1.线性相关性：将浓度为50ng/mL的高值样本按倍比稀释为5个浓度，将每一浓度重复检测2次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r；
2.最低检测限：用零浓度样本进行检测，重复测定20次，计算测定结果的吸光度值(A值)计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD所对应的A值，根据试剂盒所用校准品的校准曲线方程，将M+2SD所对应的A值代入上述方程中，求出所对应浓度值，即为最低检测限；
3.重复性：对2个浓度水平各重复检测10次，计算10次测量浓度结果的平均值和标准差SD，按公式CV(％)＝SD/×100％计算得出变异系数CV；
4.准确度：将高浓度样品A加入到低浓度样品B中，所加入样品A与样品B之间的体积比例为1：10，按公式(其中：R—回收率；V—加入样品A体积；V0－样品B的体积；C－样品B加入样品A后的检测浓度；C0—样品B的检测浓度；CS—样品A的浓度。)计算回收率，回收率在85％～115％的范围内。
5.稳定性：
将本试剂盒各试剂组分于2-8℃下放置14个月和于37℃下放置8天，分别检测试剂盒的线性相关性、最低检测限、重复性、准确度指标，检测结果见表2、表3。
表2：2-8℃下放置14个月
Figure BDA0002269354030000111
表3：37℃下放置8天
Figure BDA0002269354030000112
本试剂盒的性能评价结果：
线性相关性：在1-50ng/ml范围内，相关系数r＝0.9829；
最低检测限：0.467ng/ml，小于标准的1ng/ml；
重复性：变异系数CV为6.08％，小于15％；
准确度：回收率为98.42％。
稳定性：试剂盒具有较好的稳定性。
对比试验
选取350例血清样本，分别使用本试剂盒和对比试剂盒按上述方式进行血清Occludin检测，并对两组数据做相关性分析。结果表明，直线方程为y＝0.9995x-0.0088，相关系数R＝0.9843，可见本试剂盒和对比试剂盒有较好一致性。使用EXCEL对两组数据进行T检测(平均值的成对二样本分析)，检验水平a＝0.05，︳t︳＝0.450399,t0.05＝1.966804,︳t︳≤t0.05,两组数据具有显著相关性，说明本试剂盒具有较强临床应用性。
以上内容仅仅是对本发明构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括包被Occludin包被抗体的酶标板、HRP标记的羊抗兔IgG、兔抗人Occludin多克隆抗体、洗涤液、样品稀释液、显色剂、终止液、质控品和标准品，所述试剂盒以Occludin包被抗体和羊抗兔IgG为基础，以双抗体夹心法建立Occludin蛋白检测的ELISA方法。
2.根据权利要求1所述的一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，其特征在于：所述Occludin包被抗体的浓度为10ng/L，所述兔抗人Occludin多克隆抗体的浓度为15ng/L，所述羊抗兔IgG的浓度为1ng/L。
3.根据权利要求1所述的一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，其特征在于：所述质控品和校准品来自于人体血清，所述质控品的浓度为100ng/L，所述校准品的浓度梯度为120±12ng/L、80±8ng/L、40±4ng/L、20±2ng/L、10±1ng/L、0ng/L，校准品或质控品的缓冲液为含有0.1mol/L的PB、0.15mol/L的氯化钠、1％的牛血清白蛋白及0.05％tween-20、pH值为6.5的缓冲液。
4.根据权利要求1所述的一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，其特征在于：所述显色剂包括显色剂A和显色剂B，所述显色剂A为10g/L的过氧化脲素溶液，所述显色剂B为2g/L的TMB·2HCl溶液，显色液使用时取等体积的A、B液混匀。
5.根据权利要求1所述的一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为25倍浓缩的磷酸缓冲液，所述终止液为2M H2SO4溶液。
6.根据权利要求1所述的一种定量检测紧密连接相关蛋白Occludin的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测对象为血清、细胞上清、血浆或组织。
7.根据权利要求1所述试剂盒在Occludin蛋白定量检测中的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：
1)加样：先加入50ul待测样本/Occludin校准品/Occludin质控品，再加入50ulOccludin结合抗体于相应孔中，轻拍混匀，设空白孔；
2)温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；
3)洗板：取出反应板，甩尽板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；
4)加酶：每孔加入两滴或100ul的GR酶结合物，空白孔不加；
5)温育：用封口膜将条板封好，37℃温育30分钟；
6)洗板：取出反应板，甩尽板中液体，每孔注满洗涤液洗板5次，拍干，在洗涤过程中应避免产生气泡；
7)显色：每孔加入显色剂A、B溶液各一滴或各50ul，充分混匀，置37℃温育15分钟；
8)终止：每孔尽快加入终止液1滴轻拍混匀；
9)测定：用酶标仪以空白对照调零，测定各孔OD.值；
10)结果计算：以校准品浓度作横坐标，OD.值作纵坐标，以双对数拟合绘制校准曲线。通过待测样本的OD.值可在校准曲线上查出其对应浓度值。
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