CN109142752A

CN109142752A - 紧密连接蛋白与致炎因子在血脊髓屏障损伤诊断中的应用

Info

Publication number: CN109142752A
Application number: CN201811037307.3A
Authority: CN
Inventors: 蔡小军; 李在望
Original assignee: Wuxi Peoples Hospital
Current assignee: Wuxi Peoples Hospital
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2019-01-04

Abstract

本发明公开了紧密连接蛋白与致炎因子在制备或筛选诊断或治疗血脊髓屏障损伤的试剂或药物中的应用。本发明的实验研究证实，通过紧密连接蛋白和致炎因子的表达水平联合诊断血脊髓屏障是否发生了损伤及其损伤程度，以便早期诊断、预防以及治疗。本发明为制备或筛选诊断或治疗血脊髓屏障损伤的试剂或药物提供了理论支持和依据。

Description

紧密连接蛋白与致炎因子在血脊髓屏障损伤诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及紧密连接蛋白与致炎因子在血脊髓屏障损伤诊断中的应用。

背景技术

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后往往会造成受损平面以下肢体和躯干严重的运动、感觉功能缺损，且这些神经功能缺损往往是不可逆的。SCI后的神经功能缺损由原发性损伤和继发性损伤所造成，原发性损伤是指脊髓直接遭受机械暴力所造成的损伤，而继发性损伤是原发性损伤后一系列“瀑布”式损伤激活的自身破坏过程。血脊髓屏障(Blood Spinal Cord Barrier，BSCB)在SCI的病理生理过程中扮演着重要的角色，其破坏在继发性损伤中起着重要作用。因此，如何保护SCI后BSCB结构和功能的完整性是控制继发性损伤的关键环节。

研究表明，SCI后BSCB遭到破坏，血液中的白细胞侵入到神经组织，而这些白细胞可产生大量基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)及致炎因子等多种物质。而MMPs及致炎因子不仅导致BSCB中的内皮细胞损伤，而且可导致脊髓的胶质细胞(星形胶质细胞及小胶质细胞)过度活化，脊髓胶质细胞活化后同样可大量分泌致炎因子、活性氧及MMPs等损伤因子，进一步损伤 BSCB中的内皮细胞，最终使非脊髓损伤区的BSCB和神经组织也遭到破坏。因此，抑制这种脊髓继发性损伤的恶性循环作用(正反馈损伤)是重建SCI后神经组织微环境稳态和干预SCI的重要策略。

由于原发性脊髓损伤直接破坏了脊髓组织并引起脊髓组织释放大量损伤性介质而导致BSCB自我调节功能损害、渗透性增加，从而进一步导致脊髓肿胀压迫局部血管，最终引发局部血流中断以及因缺血缺氧或血栓形成致脊髓局部细胞损伤和梗死。而脊髓损伤后水肿消退时缺血脊髓组织恢复血液再灌注可进一步引起其继发性损伤，并导致BSCB的结构和功能的进一步破坏。因此，缺血再灌注损伤与脊髓损伤后的继发性损伤以及BSCB的破坏密切相关。发展与完善BSCB 体外缺血缺氧再灌注损伤病理模型，能在排除体内其他干扰因素的条件下，直接、准确地了解脊髓缺血/再灌注损伤后BSCB结构和功能的改变，有效模拟整体脊髓损伤后BSCB的病理改变，从而为脊髓损伤研究提供强有力的支持。

BSCB是中枢神经系统高度分化的神经血管特殊化内皮结构，由脊髓微血管内皮细胞、基膜和胶质膜(星形胶质细胞及小胶质细胞的终足形成)等结构组成，是维持脊髓神经组织微环境稳态的具有高度选择性的屏障结构。其中，脊髓微血管内皮细胞分泌的紧密连接蛋白在维持血脊髓屏障的功能完整性方面起着极其重要的作用。紧密连接蛋白是同一个或相邻内皮细胞为消除细胞间隙的“接触点” 而分泌的特殊蛋白，其可以维持细胞的极性，是CNS正常屏障结构的重要组成部分。所以，紧密连接蛋白的脱失可被认为是CNS屏障结构损伤的敏感标记物。

此外，炎症反应是脊髓继发性损伤中的主要原因。脊髓原发性损伤后血管壁损伤，血液中白细胞和致炎因子可通过BSCB进入神经组织，而进入CNS的白细胞又可分泌大量致炎因子，“激活”BSCB的组成细胞(内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞)进一步分泌致炎因子，破坏BSCB的完整性，使脊髓继发性损伤作用不断放大。

因此，我们将紧密连接蛋白及BSCB组成细胞分泌的致炎因子联合作为 BSCB损伤的诊断因素及其损伤程度评估的指标，从而判断脊髓损伤后的神经功能缺损程度。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了紧密连接蛋白与致炎因子在制备或筛选诊断或治疗血脊髓屏障损伤的试剂或药物中的应用。本发明的紧密连接蛋白与致炎因子在联合诊断血脊髓屏障损伤、评估其损伤程度及治疗血脊髓屏障损伤的疗效中起着关键作用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了紧密连接蛋白与致炎因子在制备或筛选诊断或治疗血脊髓屏障损伤的试剂或药物中的应用。

其中，所述紧密连接蛋白为ZO-1和/或Occludin。

其中，所述致炎因子为白细胞趋化因子和/或白细胞粘附因子和/或前炎症因子。

其中，所述白细胞趋化因子为MIP-1α和/或MIP-1β。

其中，所述白细胞粘附因子为ICAM-1和/或VCAM-1。

其中，所述前炎症因子为TNF-α和/或IL-1β和/或iNOS和/或COX-2。

其中，所述试剂或药物为调控紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达水平的试剂或药物。

其中，所述试剂或药物为调控白细胞趋化因子MIP-1α、MIP-1β和/或白细胞粘附因子ICAM-1、VCAM-1的表达水平的试剂或药物。

其中，所述试剂或药物为调控前炎症因子TNF-α、IL-1β、iNOS和COX-2 的表达水平的试剂或药物。

其中，所述筛选的试剂或药物为EGFR抑制剂PD168393。

本发明将原代培养的脊髓来源的混合胶质细胞(星形胶质细胞与小胶质细胞混合的细胞)与原代培养的脊髓来源的微血管内皮细胞用于构建血脊髓屏障，此原代多细胞共培养能更好地还原BSCB的生理结构；该混合胶质细胞与微血管内皮细胞共培养构建的血脊髓屏障通过氧糖剥夺/复氧损伤构建其病理模型，为筛选保护血脊髓屏障损伤的药物或诊断试剂提供工具。本发明还通过氧糖剥夺/复氧损伤BSCB后观察至48h以模拟脊髓原发性损伤后导致的继发性损伤，从而为研究如何保护SCI后BSCB结构和功能的完整性这一控制继发性损伤的关键环节提供依据。并且，本发明还研究了BSCB在氧糖剥夺/复氧损伤后白细胞趋化因子、白细胞粘附分子、前炎症因子的分泌与紧密连接蛋白表达以及BSCB通透性之间的动态变化关系，进而为寻找重建SCI后神经组织微环境稳态和干预 SCI的重要策略提供支撑。

有益效果：本发明具有以下优点：实验研究证实，通过本发明的紧密连接蛋白和致炎因子的表达水平来联合诊断血脊髓屏障是否发生了损伤及其损伤程度，以便早期诊断、预防以及治疗。本发明为制备或筛选诊断或治疗血脊髓屏障损伤的试剂或药物提供了理论支持和依据。

附图说明

图1大鼠脊髓来源混合胶质细胞原代培养与鉴定图；

图2大鼠脊髓来源微血管内皮细胞原代培养与鉴定图；

图3 transwell共培养体系建立的血脊髓屏障OGD/R损伤模型示意图；上室内(图B)培养的是脊髓微血管内皮细胞，箭头所指为聚碳酸酯膜。图C为transwell 共培养体系，其中方框是嵌入底室的上室，底室内培养的是混合胶质细胞。

注：图3A中1W、2W、3W、4W为：1周、2周、3周、4周；mixed glials：混合胶质细胞；microvascular endothelial cells：微血管内皮细胞；OGD/R：氧糖剥夺/复氧；FITC-dextran leakage test：异硫氰酸荧光剂标记的右旋糖酐渗漏实验； TEER：内皮细胞间跨膜电阻；

图4体外血脊髓屏障OGD/R损伤后，在复氧后不同时间点FITC-dextran渗漏到底室的浓度变化分析图及内皮细胞跨膜电阻的检测变化分析图；

图5体外血脊髓屏障OGD/R损伤后，在复氧后不同时间点检测BSCB组成细胞分泌白细胞趋化因子和白细胞粘附因子的动态变化；

图6体外血脊髓屏障OGD/R损伤后，在复氧后不同时间点用ELISA法检测 BSCB组成细胞分泌致炎因子的动态变化；

图7体外血脊髓屏障OGD/R损伤后，在复氧后不同时间点检测紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达变化图；

图8血脊髓屏障OGD/R损伤后，前炎症因子(TNF-α,iNOS,COX-2 and IL-1β) 与跨膜间电阻(TEER)、FITC-dextran渗透性及紧密连接蛋白表达水平之间的关系；

图9A为不同浓度EGFR抑制剂PD168393对BSCB损伤后不同时间点 FITC-dextran的渗漏(通透性)的影响；图9B为不同浓度EGFR抑制剂PD168393 对BSCB损伤后不同时间点内皮细胞跨膜电阻的影响；

图10体外BSCB氧糖剥夺/复氧损伤后给予PD168393进行干预，并应用 ELISA法在复氧后不同时间点检测BSCB分泌白细胞趋化因子的变化。图10A为EGFR抑制剂PD168393对体外BSCB氧糖剥夺/复氧损伤后不同时间点分泌白细胞趋化因子CCL3(MIP1α)的影响。图10B为EGFR抑制剂PD168393对体外BSCB氧糖剥夺/复氧损伤后不同时间点分泌白细胞趋化因子CCL4(MIP1β)的影响。*P<0.05，#<0.01；

图11体外BSCB氧糖剥夺/复氧损伤后给予PD168393进行干预，并应用 ELISA法在复氧后不同时间点检测BSCB分泌白细胞粘附因子的变化。图11A为EGFR抑制剂PD168393对体外BSCB氧糖剥夺/复氧损伤后不同时间点分泌白细胞粘附因子VCAM-1的影响。图11B为EGFR抑制剂PD168393对体外BSCB 氧糖剥夺/复氧损伤后不同时间点分泌白细胞粘附因子ICAM-1的影响。*P<0.05， #<0.01；

图12体外BSCB氧糖剥夺/复氧损伤后给予PD168393进行干预，并应用 ELISA法在复氧后不同时间点检测BSCB分泌前炎症因子的变化。图12A为 EGFR抑制剂PD168393对体外BSCB氧糖剥夺/复氧损伤后不同时间点分泌 TNF-α的影响。图12B为EGFR抑制剂PD168393对体外BSCB氧糖剥夺/复氧损伤后不同时间点分泌iNOS的影响。图12C为EGFR抑制剂PD168393对体外 BSCB氧糖剥夺/复氧损伤后不同时间点分泌IL-1β的影响。图12D为EGFR抑制剂PD168393对体外BSCB氧糖剥夺/复氧损伤后不同时间点分泌COX-2的影响。*P<0.05，#<0.01；

图13体外BSCB在氧糖剥夺/复氧后给予PD168393进行干预，在糖氧剥夺3h后进行复氧6h再检测各组细胞ZO-1及Occludin的表达。图13A1-A3分别为ZO-1和DAPI免疫荧光双标图片，图13B1-B3分别为Occludin和DAPI免疫荧光双标图片，其中bar＝20μm，图13A为ZO-1、Occludin、β-actin的典型 Western Blot图片，图13B为ZO-1、Occludin相对表达量的统计条图。*P＜0.05；

图14 EGFR抑制剂(PD168393)明显抑制了SCI后BSCB通透性的增加，减轻了脊髓水肿；

图15 EGFR抑制剂(PD168393)抑制了内皮细胞间紧密连接蛋白(Occludin 和ZO-1)的破坏；

图16 EGFR抑制剂(PD168393)抑制脊髓损伤后致炎因子的表达。

具体实施方式：

下面通过实施例来进一步阐述本发明。

实施例1体外血脊髓屏障模型及血脊髓屏障氧糖剥夺/复氧(oxygen glucosedeprivation/re-oxygenation,OGD/R)损伤模型的建立

1、大鼠脊髓来源的混合胶质细胞原代培养与鉴定

1.1混合胶质细胞的原代培养

(1)器械消毒30min；

(2)取新生1天内的SD大鼠，全身浸入75％酒精中消毒2min；

(3)在无菌操作台内采用无菌方法迅速取出脊髓(用大头针固定大鼠四肢，用镊子将颈部皮肤拉开，从颈髓处用剪子将脊柱剪断，找到椎管，将镊子勾入椎管，向后向上拉将椎管去除至尾部，暴露颈髓、胸髓、腰髓，用镊子将脊髓取出，置于一盛放无菌HBSS溶液的玻璃培养皿中(置于冰上低温操作)，一把镊子固定脊髓一端，另一把镊子从固定那端开始挤压脊髓，直至脊髓从脊膜中推出，放入另一盛放无菌HBSS溶液的培养皿中，清洗3遍；

(4)眼科剪将所取组织尽可能剪成小块，约1mm左右；

(5)将剪碎的组织放入15ml离心管中，用巴士吸管反复吹打，进行机械消化，至无肉眼可见组织块；

(6)200目细胞网筛过滤；

(7)收集滤液，4℃离心机中离心(1000rpm，5min)后，弃上清，细胞沉淀加入10％胎牛血清的DMEM培养液1ml制成细胞悬液；

(8)计数后以1×10⁶个/m1的细胞密度接种于培养瓶中，加入10％胎牛血清的DMEM培养液，总体积为5ml；

(9)放于饱和湿度培养箱中培养(37℃，5％CO₂，95％空气)。2-3天后换液，以后每3天换一次液直至融合，细胞融合90％后予传代。

1.2、混合胶质细胞的鉴定

制作细胞爬片，当细胞长至100％融合时进行GFAP(Abcam,ab7260)与 CD11b(Abcam，ab8879)鉴定。4％的多聚甲醛固定，4℃固定15min；PBS(pH＝7.4) 冲洗5min×3次；0.2％triton/PBS透膜15min；PBS冲洗5min×3次；山羊血清白蛋白封闭1h；PBS冲洗5min×3次；滴加兔源性GFAP(1:200)(Abcam, ab7260)与鼠源性CD11b混合抗体(Abcam，ab8879)(1:200)，4℃孵育过夜； PBS冲洗5min×3次；滴加FITC标记羊抗兔(1:300)(Abcam，ab6717)与CY3标记羊抗鼠混合抗体(1:300)(Abcam，ab97035)，室温避光孵育1h，PBS冲洗5min×3次，滴加核染料DAPI(1mg/ml)，复染5min；PBS冲洗5min×3次，50％甘油封片，荧光显微镜拍照。

结果显示：大鼠脊髓混合胶质细胞在接种4h后，开始贴壁，星形胶质细胞细胞呈不规则形，胞体肥大扁平，细胞边缘清晰。培养2天后，细胞开始铺展开，部分细胞伸出细长的突起。培养15天后，细胞已融合并连接成网。小胶质细胞较星形胶质细胞小，呈类圆形，部分有棱角，不与周边细胞连结。用DAPI标记所有细胞核，星形胶质细胞特异性标志物GFAP，小胶质细胞特异性标志物CD11b 做免疫荧光鉴定，结果显示约93％的星形胶质细胞(astrocyte)表达GFAP抗原，5％的小胶质细胞(microglia)表达CD11b抗原(见图1)，图1A1-A2相差显微镜下的脊髓混合胶质细胞，其中A1图中红色方框的高倍数图片为A2图，A1 bar＝100um，A2 bar＝40um；图1B1-B4为混合胶质细胞免疫荧光三标染色，其中GFAP(绿色)为星形胶质细胞标志物、CD11b(红色)为小胶质细胞标志物、 DAPI(蓝色)标记细胞核，B4 bar＝40um(适用于B1-B4)；图1C随机选取5个视野，统计视野GFAP⁺/CD11b⁺的比例。

2、大鼠脊髓来源的微血管内皮细胞原代培养与鉴定

2.1、微血管内皮细胞原代培养

(1)如前述取出脊髓组织后，机械消化；

(2)2000rpm离心5min，收集沉淀。

(3)离心后的沉淀在预热的ACCUTASE(ACCUTASE^TM细胞消化液， Millipore公司，SCR005)中消化(匀浆组织与预热的消化液体积比1:2)，37℃ 水浴中震荡30min。

(4)消化后的组织离心，4℃，2000rpm，离心5min，沉淀重悬于22％BSA (体积比1:1)终止消化。

(5)离心，4℃，4000rpm离心15min后，将上层吸除，沉淀物包含血管段，用HBSS清洗3遍，2000rpm离心5min×4次。

(6)沉淀即为获得的脊髓微血管内皮细胞，ACCUTASE消化，37℃，30min。

(7)加入含血清培养基(DMEM/F12，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素混合液(100×双抗)，ECGF 30ng/ml)终止消化，通过2000rmp离心5min。

(8)沉淀物清洗冲洗，重悬于含血清培养基(DMEM/F12，20％胎牛血清， 1％青霉素-链霉素混合液(100×双抗)，ECGF 30ng/ml)。接种于25cm²细胞培养瓶中，接种密度1×10⁴/cm²。细胞融合90％后予传代。

2.2、微血管内皮细胞的鉴定

制作细胞爬片，当细胞长至100％融合时进行CD31鉴定。4％的多聚甲醛固定，4℃固定15min；PBS(PH＝7.4)冲洗5min×3次；0.2％triton/PBS透膜15min； PBS冲洗5min×3次；山羊血清白蛋白封闭1h；PBS冲洗5min×3次；滴加鼠源性CD31抗体(1:200)(Abcam，ab64543)，4℃孵育过夜；PBS冲洗5min×3 次；滴加CY3标记羊抗鼠抗体(1:300)(Abcam，ab97035)，室温避光孵育1h，PBS 冲洗5min×3次，滴加核染料DAPI(1mg/ml)，复染5min；PBS冲洗5min×3次， 50％甘油封片，荧光显微镜拍照。

结果显示：大鼠脊髓微血管内皮细胞在接种6h后开始贴壁，细胞呈长梭型，细胞边界清晰，2-3天后可见散在细胞群落，一周后细胞开始融合，排列紧密，呈典型的铺路石样结构。用DAPI标记所有细胞核，内皮细胞特异性标志物CD31 做免疫荧光鉴定，细胞纯度在95％以上(见图2)。图2A1-A2相差显微镜下的脊髓微血管内皮细胞，其中A1图中红色方框的高倍数图片为A2图，A1 bar＝100um，A2 bar＝40um；图2B1-B2为CD31+DAPI免疫荧光双标染色，其中 B1图中黄色方框的高倍数图片为B2图，B1 bar＝40um，B2 bar＝10um。

3、体外血脊髓屏障模型及血脊髓屏障OGD/R损伤模型的建立

利用transwell共培养体系建立体外BSCB模型：培养融合后的脊髓来源的混合胶质细胞用0.25％胰酶，脊髓来源的微血管内皮细胞用ACCUTASE分别消化，离心(1000rpm，5min)后，将重悬的微血管内皮细胞接种于transwell上室内，混合胶质细胞接种于底室，待细胞贴壁后，予换液。

血脊髓屏障OGD/R损伤模型的构建：待BSCB模型中的细胞90％以上融合后，将所有培养基弃去，更换成无糖无血清的培养基(无糖DMEM培养基，美国Hyclone公司)，transwell置于缺氧培养箱中(37℃、5％CO₂、95％N₂)，培养 3h后取出，重新更换为原培养基(DMEM-F12培养基，美国Hyclone公司)，在普通细胞培养箱中分别进行复氧3h、6h、12h、24h、48h，即得血脊髓屏障 OGD/R损伤模型。

实施例2血脊髓屏障OGD/R损伤模型及其通透性、紧密连接蛋白与致炎因子的检测

本实施例用跨膜电阻仪测定实施例1构建的血脊髓屏障OGD/R损伤模型在血脊髓屏障氧糖剥夺/复氧损伤后不同时间点的跨内皮细胞间电阻，并通过异硫氰酸荧光剂标记的右旋糖酐(FITC-dextran，F-D)渗漏实验检测不同时间点的内皮细胞通透性，确定BSCB氧糖剥夺损伤模型的成功建模；应用ELISA实验方法检测各组细胞分泌白细胞趋化因子(MIP-1α、MIP-1β)、白细胞粘附因子 (ICAM-1、VCAM-1)、前炎症因子(IL-1β、TNF-α、iNOS、COX-2)的差异；应用免疫荧光、Western Blot技术检测各组内皮细胞间紧密连接蛋白ZO-1、 Occludin表达的差异；并通过Pearson相关系数分析考察体外血脊髓屏障OGD/R 损伤后，在复氧后不同时间点前炎症因子与内皮细胞跨膜间电阻(TEER)、 FITC-dextran渗透性及紧密连接蛋白表达水平之间的关系。

1、分别在不同时间点测定异硫氰酸荧光剂标记的右旋糖酐(FITC-dextran)渗漏情况及内皮细胞间跨膜电阻(TEER)。结果显示①体外BSCB FITC-dextran 渗漏自OGD/R损伤后3h开始出现明显增加，6h-12h增大最明显，24h开始恢复， 48h已基本恢复正常(见图4)。②体外BSCB TEER值自OGD/R损伤后3h开始出现显著下降并持续至12h后，24h开始恢复，48h基本恢复正常(见图4)。

2、在复氧后不同时间点用ELISA法检测白细胞趋化因子(MIP-1α、MIP-1β) 和白细胞粘附因子(ICAM-1、VCAM-1)的动态变化。结果显示，MIP-1α、MIP-1β、 ICAM-1和VCAM-1水平在复氧后的前三个时间点(3、6、12h)显著升高，复氧6 h后逐渐下降，但仍然明显高于正常对照组(P<0.05,0.01)。其中VCAM-1复氧 3h-24h后与正常对照组比较，差异具有显著统计学意义(P<0.05,0.01)，见图5，图5A为各时间点MIP-1α的浓度；图5B为各时间点MIP-1β的浓度；图5C为各时间点ICAM-1的浓度，图5D为各时间点VCAM-1的浓度。*P<0.05，#<0.01。

3、在复氧后不同时间点用ELISA法检测BSCB细胞分泌前炎症因子表达变化。结果显示，前炎症因子(TNF-α、IL-1β、iNOS、COX-2)在OGD/R损伤后的3h-24h开始出现明显增加，与正常对照组比较差异具有显著统计学意义 (P<0.05,0.01)。其中TNF-α、IL-1β和COX-2复氧后6h开始恢复，iNOS复氧 12h后开始恢复(见图6)。图6A为体外BSCB损伤后不同时间点TNF-α变化；图6B为体外BSCB损伤后不同时间点IL-1β变化；图6C为体外BSCB损伤后不同时间点iNOS变化；图6D为体外BSCB损伤后不同时间点COX-2变化。* P<0.05，#<0.01。

4、体外BSCB氧糖剥夺损伤后，在复氧后不同时间点采用Western blot检测紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达变化。结果显示，ZO-1和Occludin的表达水平在OGD/R损伤后均显著降低。其中紧密连接蛋白表达水平在复氧后的前 4个时间点(3、6、12和24h)明显低于正常对照组，差异具有显著统计学意义 (P<0.05,0.01)(见图7)。图7A1-A6分别为复氧3h、6h、12h、48h时ZO-1 和DAPI免疫荧光双标图片，图7B1-B6分别为复氧3h、6h、12h、48h时Occludin 和DAPI免疫荧光双标图片，其中bar＝20μm，图7C为ZO-1、Occludin、β-actin 的典型Western Blot图片，图7D为ZO-1、Occludin相对表达量的统计条图。 *P<0.05，#<0.01。

5、通过Pearson相关系数分析考察体外血脊髓屏障OGD/R损伤后，在复氧后不同时间点前炎症因子与内皮细胞跨膜间电阻(TEER)、FITC-dextran渗透性及紧密连接蛋白表达水平之间的关系。结果显示，TNF-α、iNOS、COX-2与 IL-1β浓度与紧密连接蛋白的表达水平及TEER水平呈负相关，而与FITC-dextran 的渗透率呈现正相关关系(见图8)。血脊髓屏障OGD/R损伤后，前炎症因子 (TNF-α、iNOS、COX-2 and IL-1β)与TEER、FITC-dextran渗透性及紧密连接蛋白表达水平之间的关系。(图8A1-A4)前炎症因子与ZO-1蛋白之间相关分析的散点图(两者之间存在负相关性，r＝-0.988～-0.783，P<0.01)。(图8B1-B4)前炎症因子与Occludin蛋白相关分析的散点图(两者之间存在负相关性，r＝ -0.981～-0.776，P<0.01)。(图8C1-C4)前炎症因子与FITC-dextran渗透率之间相关分析的散点图(两者呈现正相关，r＝0.933～0.983，P<0.001)。(图8D1-D4)前炎症因子与TEER之间相关分析的散点图(两者呈现负相关，r＝-0.972～-0.714， P<0.05)。

紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达下调及白细胞趋化因子(MIP-1α、 MIP-1β)、白细胞粘附因子(ICAM-1、VCAM-1)、前炎症因子(IL-1β、TNF-α、 iNOS、COX-2)表达水平上调，表明血脊髓屏障被破坏，通透性增加；紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达水平越低，白细胞趋化因子(MIP-1α、MIP-1β)、白细胞粘附因子(ICAM-1、VCAM-1)、前炎症因子(IL-1β、TNF-α、iNOS、COX-2) 分泌的水平越高，提示血脊髓屏障通透性越大，损伤程度越严重。

实施例3紧密连接蛋白与致炎因子在药物筛选中的应用

1、EGFR抑制剂PD168393(潜在的神经保护剂)对血脊髓屏障OGD/R损伤模型通透性的影响

1.1、PD168393(美国Abcam，ab145187)工作液的制备：在1mg PD168393 粉末中加入135μl DMSO，充分溶解后加入405μl HBSS溶液，充分混匀，制成 540μl 5mM的PD168393储存液，分装后-20℃保存。

1.2实验分组：将体外BSCB模型分为5组：OGD/R损伤组，在OGD/R模型复氧时加入3个不同浓度(10nM、1nM及0.1nM)PD168393干预处理的3个治疗组，未经任何处理的BSCB模型作为正常对照组。

1.3荧光染料渗漏实验：将正常对照组，OGD/R组、PD168393治疗组分别于复氧3h，6h，12h，24h后，上室内加入200μl FITC-dextran(异硫氰酸荧光剂标记的右旋糖酐，1mg/ml，Sigma，68059)，30min后于各组底室取100μl培养基，置96孔板，4℃保存，待各组都取出后，荧光酶标仪，在540nm处读取各组底室的吸光度，根据标准曲线，计算各组渗透到底室FITC-dextran的浓度，进行内皮细胞通透性检测并进行比较。

1.4跨膜电阻检测：将正常对照组，OGD/R组、PD168393治疗组分别于复氧3h，6h，12h，24h后，采用Merk-Millipore公司的Millcell ERS-2电阻仪检测 TEER值，方法严格参照仪器说明书。TEER值反映的是小离子通透物理屏障的电阻抗，被公认为是测定血脑屏障完整性最精确和敏感的工具。TEER值的下降表明血脑屏障通透性的增加，屏障功能的破坏。通过减去没有接种细胞小室膜的 TEER值得到血脑屏障的TEER值，表达的单位是Ω×cm²。自TEER值即将稳定作为起始开始记录。EGFR抑制剂(PD168393)明显降低了体外BSCB损伤后 FITC-dextran的渗漏及改善了体外BSCB损伤后TEER值。根据荧光素渗漏实验及跨膜电阻检测实验确定EGFR抑制剂PD168393的最佳干预浓度为1nmol/L(见图9)。

2、EGFR抑制剂PD168393(潜在的神经保护剂)对血脊髓屏障OGD/R损伤模型炎症因子及紧密连接蛋白的影响

2.1致炎因子检测：建立体外BSCB模型，并设置3个实验组(OGD/R损伤组，PD168393治疗组，对照组)。氧糖剥夺3h后分别进行复氧3h，6h，12h， 24h，应用ELISA方法检测内皮细胞培养液中致炎因子CCL3(MIP1α)， CCL4(MIP1β)，VCAM-1，ICAM-1，IL-1β，TNF-α，COX-2，iNOS表达的差异。体外BSCB损伤后白细胞趋化因子(MIP1α、MIP1β)表达明显增高，而EGFR 抑制剂PD168393可以明显降低白细胞趋化因子的表达(见图10)。体外BSCB 损伤后白细胞粘附因子(VCAM-1、ICAM-1)表达明显增高，而EGFR抑制剂 PD168393可以明显降低白细胞粘附因子的表达(见图11)。体外BSCB损伤后前炎症因子(IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS)表达明显增高，而EGFR抑制剂 PD168393可以明显降低前炎症因子的表达(见图12)。

2.2紧密连接蛋白检测：建立体外BSCB模型，并设置3个实验组(OGD/R 损伤组，PD168393治疗组，对照组)。在氧糖剥夺3h后进行复氧6h，应用免疫染色法检测各组细胞ZO-1及Occludin的表达。在另一个平行实验中，在氧糖剥夺3h后进行复氧6h后提取各组细胞的蛋白，应用Western blot法检测各组细胞ZO-1及Occludin的表达。体外BSCB OGD/R损伤后紧密连接蛋白表达明显减少，而EGFR抑制剂PD168393可以抑制紧密连接蛋白的脱失(见图13)。

实施例4动物实验--研究大鼠SCI模型中PD168393对致炎因子及紧密连接蛋白表达水平的影响情况

1.建立大鼠SCI模型，研究大鼠SCI后EGFR抑制剂PD168393(潜在神经保护剂)对BSCB通透性的影响。

(1)大鼠SCI动物模型的建立：应用标准打击器制作大鼠SCI模型。选择 T10(第10胸椎)应用龙胆紫做标记，碘伏消毒铺无菌巾后行背部正中切口，逐层分离肌肉，切断T9－T11(第9胸椎-第11胸椎)棘突上的韧带及部分肌肉，充分暴露T9－T11棘突和椎板，咬除T10棘突和椎板，充分暴露硬脊膜，应用打击器的钳夹系统固定T9、T11棘突，调整好打击棒的高度(打击棒重量为10g，其打击头部直径为2mm，其打击高度为1.25cm，下落打击致伤能量为25gcf,gram centimeter force)，使打击棒与T10段脊髓垂直，按下打击开关，打击棒垂直自由落下，打在硬脊膜表面，致伤后迅速移去打击棒，可见打击处硬脊膜迅速形成血肿，双下肢痉挛抖动，尾巴痉挛性摆动，视为造模成功。

(2)实验动物分组及干预：建立大鼠SCI模型后，随机分为EGFR抑制剂组、损伤对照组，并设立假手术组(假手术模型大鼠切除棘突及椎板并暴露硬脊膜后不行重物坠落打击损伤)，SCI后在局部通过微型渗透泵给予含有1mM PD168393 以0.5μl/h持续作用7d进行治疗(PD168393均为EGFR特异性抑制剂)，而损伤对照组和假手术组均在术后给予溶剂(2％二甲基亚砜)作对照治疗。

(3)EGFR抑制剂(PD168393)对SCI后BSCB通透性的影响：

1)EGFR活化对SCI后脊髓水肿的影响：SCI后3d，取出各组大鼠T10节段脊髓(以损伤灶为中心长1cm)组织，称重然后进行干燥，测量组织中含水量，比较各组脊髓组织水肿的差异。

2)Evans蓝(EB)染料渗漏实验：SCI后3d，将各组大鼠通过腹腔注射2％EB 染料(溶于生理盐水)后3h处死，经左心室灌注生理盐水冲洗直到从右心房流出的灌洗液不再有染料的颜色。取出T10节段脊髓(以损伤灶为中心长1cm)在 50％的三氯乙酸溶液中进行匀浆，14000g离心8min钟后，提取上清，EB荧光强度应用620nm激发波长和680nm发射波长的分光光度计进行检测，然后应用标准曲线计算渗漏到脊髓组织的EB含量。同时将部分脊髓组织应用冰冻切片机进行切片，片厚20mm，EB荧光可通过荧光显微镜进行观察和摄像，并应用MetaMorph软件计算EB荧光强度。

图14A～14E显示了EGFR抑制剂明显抑制了SCI后BSCB的破坏：EGFR 抑制剂明显抑制了SCI后BSCB通透性的异常增加，并减轻了脊髓水肿。图14A 为Evans蓝染料渗漏实验，其中图14A2为SCI后3d腹腔注射Evans蓝3h后病灶处可见大量Evans蓝染料渗漏，而PD168393治疗组Evans蓝染料渗漏明显减少(图14A3)，图14A1为未损伤对照组，未见Evans蓝染料渗漏进入脊髓组织，其中bar＝1mm。图14B为渗漏到脊髓组织Evans蓝染料定量分析条图。图14C为SCI病灶中心旁1mm(头侧)切片渗漏Evans蓝荧光照片，图14C2为损伤组，图14C3为PD168393治疗组，图14C3免疫荧光较图14C2明显减弱，提示PD168393可抑制SCI后BSCB通透性的异常增加，其中bar＝1mm。图14D 为Evans蓝荧光强度统计条图，*P<0.05。图14E为SCI后5d脊髓含水量统计条图，*P<0.05。

2、研究大鼠SCI后EGFR抑制剂(PD168393)对紧密连接蛋白表达的影响

EGFR活化对SCI后紧密连接蛋白表达的影响：SCI后3d，各组取5只SD 大鼠处死，取损伤节段脊髓，行冰冻切片，应用免疫荧光技术对各组大鼠进行 ZO-1及Occludin染色。各组取5只动物处死提取脊髓组织后匀浆。应用Western blot法检测内皮细胞表达紧密连接蛋白ZO-1，Occludin表达的差异。

图15A～D显示了EGFR抑制剂抑制了内皮细胞间紧密连接蛋白的破坏： EGFR抑制剂(PD168393)抑制了内皮细胞间紧密连接蛋白(Occludin和ZO-1)的破坏。图15A1-A3为SCI后3d脊髓切片CD31(微血管内皮细胞标志物)+ZO-1 免疫荧光双标，图15B1-B3为SCI后3d脊髓切片CD31+Occludin免疫荧光双标，其中损伤组微血管内皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达均明显减少(图 15A3、B3)，而PD168393干预后ZO-1和Occludin表达较损伤组表达有明显增加(图15A2、B2)，其中bar＝10μm。图15C为SCI后3d紧密连接蛋白ZO-1 和Occludin表达的Western blot图片，图15D为ZO-1和Occludin表达的统计条图，*P<0.05，#P<0.01。

3.研究大鼠SCI后EGFR抑制剂(PD168393)对前炎症因子表达的影响。

EGFR活化对SCI后前炎症因子表达的影响：SCI后3d，各组取5只SD大鼠处死提取脊髓组织后匀浆。应用qRT-PCR技术分析各组微血管内皮细胞表达前炎症因子IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS mRNA的差异，应用Western blot法检测前炎症因子IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS蛋白表达的差异。

图16显示SCI后前炎症因子表达明显增加，而EGFR抑制剂(PD168393) 明显抑制了SCI后前炎症因子的表达：图16A为脊髓损伤后1d RT-PCR检测 TNF-α、IL-1β、iNOS、COX-2mRNA表达情况。图16B为定量分析前炎症因子 TNF-α、IL-1β、iNOS、COX-2 mRNA表达的统计条图，*P<0.05。图16C为脊髓损伤后3d Western blot检测TNF-α、IL-1β、iNOS、COX-2蛋白表达情况。图 16D为定量分析前炎症因子TNF-α、IL-1β、iNOS、COX-2蛋白表达的统计条图，*P<0.05。

上面所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.紧密连接蛋白与致炎因子在制备或筛选诊断或治疗血脊髓屏障损伤的试剂或药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述紧密连接蛋白为ZO-1和/或Occludin。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述致炎因子为白细胞趋化因子和/或白细胞粘附因子和/或前炎症因子。

4.据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述白细胞趋化因子为MIP-1α和/或MIP-1β。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述白细胞粘附因子为ICAM-1和/或VCAM-1。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述前炎症因子为TNF-α和/或IL-1β和/或iNOS和/或COX-2。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂或药物为调控紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达水平的试剂或药物。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂或药物为调控白细胞趋化因子MIP-1α、MIP-1β和/或白细胞粘附因子ICAM-1、VCAM-1的表达水平的试剂或药物。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂或药物为调控前炎症因子TNF-α、IL-1β、iNOS和COX-2的表达水平的试剂或药物。

10.根据权利要求1~9任一项所述的应用，其特征在于，所述筛选的试剂或药物为EGFR抑制剂PD168393。