CN108210520A - 慢性青光眼动物模型建立方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的慢性青光眼动物模型建立方法，包括步骤：（1）取GFP‑SD大鼠的结膜组织，灭菌，消化，分离结膜上皮层，得到结膜基质组织块；（2）结膜基质组织块胰酶中消化，用细胞培养液终止消化，吹打成单细胞悬浊液，经细胞筛，离心处理，弃掉上清液，得到结膜基质细胞沉淀；（3）加入适量的细胞培养液，吹打成单细胞后进行计数，体外培养，得到数量可观的结膜基质细胞；（4）结膜基质细胞用胰酶消化后，用步骤（2）的方法处理得到结膜基质细胞沉淀，加入适量的细胞培养液得到细胞悬浊液；（5）将10 ul 细胞悬浊液用微量注射器注入大鼠右眼前房内并充分混匀。该方法得到的青光眼动物模型具有长期稳定、简便易行、重复性好、成本低的优点。

Description

慢性青光眼动物模型建立方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种慢性青光眼动物模型建立方法及其应用。
背景技术
青光眼是以视神经萎缩、视野缺损及视力下降为共同特征的一组疾病，病理性眼压增高、视神经供血不足是其发病的原发危险因素，视神经对压力损害的耐受性也与青光眼的发生和发展有关。截至2010年，全球约有3千万青光眼患者，40岁以上人群患病率为3.5%（[1] Glaucoma(2017).The Lancet.2017;390:2183-2193）。青光眼是全球三大致盲疾病之一，严重影响人民的生活质量。
青光眼动物模型对于更好的理解青光眼性视神经病变的损伤机制及治疗措施有着重要的作用。目前慢性青光眼的动物模型主要有眼巩膜表面房水静脉注射高渗盐水法、激光诱导法、巩膜上静脉烧灼法、前方注射聚苯乙烯微球等方法（[2]Rodent models ofglaucoma(2010).Brain Research Bulletin.2010;81:349-358）。虽然这些方法在建模初期均能使得实验动物眼内压的增高，但这些慢性青光眼动物模型的建立大多需要较高的技术条件，甚至维持动物高眼内压的时间相对比较短暂。
有鉴于此，本发明人深入青光眼模型的研究工作，提出一种持续时间长、成本更低的慢性青光眼模型的建立方法，本案由此产生。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种长期稳定、简便易行、重复性好、成本低的慢性青光眼动物模型建立方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
慢性青光眼动物模型建立方法，包括以下步骤：
（1）取GFP-SD大鼠的结膜组织，灭菌；将结膜组织放入分散酶或IV型胶原酶消化液中，并置于细胞培养箱消化，分离弃掉结膜上皮层，得到结膜基质组织块；
（2）将前述结膜基质组织块放入胰酶中消化，用细胞培养液终止消化，并吹打成单细胞悬浊液；单细胞悬浊液经70um孔径大小的细胞筛后于离心机中离心处理，弃掉上清液，得到结膜基质细胞沉淀；
（3）在前述结膜基质细胞沉淀中加入适量的细胞培养液，吹打成单细胞后进行计数，将单细胞以一定密度种植于培养皿中进行体外培养，得到数量可观的结膜基质细胞；
（4）经步骤（3）体外培养得到的结膜基质细胞用胰酶消化后，用步骤（2）的方法处理得到结膜基质细胞沉淀，加入适量的细胞培养液得到细胞悬浊液，细胞计数，使得最终细胞密度为1 × 107 个/ml；
（5）在麻醉下将10 ul 步骤（4）得到的细胞悬浊液用微量注射器注入大鼠右眼前房内并充分混匀，使其均匀分布于前房，左眼不处理作为正常对照眼球。
优选的，所述结膜组织需用灭菌PBS洗2遍。
优选的，所述结膜组织的消化条件为：放入中性蛋白酶或IV型胶原酶消化液中并置于37°C细胞培养箱中消化2小时或4°C过夜。
优选的，步骤（2）中，结膜基质组织块放入胰酶中消化时间为10 min。
优选的，所述离心处理的条件为：4°C离心机中1500rpm离心5min。
优选的，步骤（2）和（3）的细胞培养液均采用含10% FBS、1% 链霉素、1% 青霉素的DMEM培养液。
优选的，所述体外培养包括：以3-5× 105 个/ml种植于直径为100mm的培养皿中，每隔一天换液一次，待细胞长满后传代培养。
采用上述方案后，本发明建立的慢性青光眼动物模型具有与慢性青光眼病人相类似的多项病理学特征，可应用于青光眼的基础研究和防治。
采用本发明建立的慢性青光眼动物模型具有如下特点：
一、该模型具有长期稳定、简便易行、重复性好、成本低廉的优点；
二、可对建模后1w的前房进行HE染色，发现结膜基质细胞可以有效的堵住房角；
二、可对建模后3d、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10w、11w和12w的大鼠双侧眼球进行眼压测量，发现本发明建立的模型右眼眼压明显高于对侧，且可以维持稳定的眼压至少12w以上；
四、可对建模后1w、3w、7w和11w的大鼠进行荧光金逆行标记，于2w、4w、8w和12w取下眼球做视网膜平铺片，发现视网膜神经节细胞数量随着高眼压的持续时间逐渐减少；
五、可对建模后4w、8w和12w的大鼠视杯/盘进行HE染色，发现杯盘比逐渐增大，视乳头萎缩越来越明显；
六、可对建模后12w的大鼠视神经进行透射电子扫描，发现高眼压眼球的视神经轴索数量明显少于对侧对照眼球。
本发明制作的模型还可以用于慢性青光眼发病机制的研究。目前，虽然青光眼的机制尚未完全阐明，但是其共同特征是视神经的萎缩和视野缺损（视网膜神经节细胞的丢失）。本发明所建立的慢性青光眼动物模型同时具备这两个特征，因此，本发明建立的慢性青光眼动物模型可应用于慢性青光眼发生发展中发病机理的基础研究和防治慢性青光眼药物的筛查等相关研究。
以下结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
附图说明
图1A为本发明实施例体外培养的GFP-SD大鼠结膜基质细胞在相差显微镜和荧光显微镜下的照片；图1B为本发明实施例体外培养的GFP-SD大鼠结膜基质细胞注射到SD大鼠右眼前房1w后的荧光图片和对侧眼球荧光图片；图1C为本发明实施例的体外培养的GFP-SD大鼠结膜基质细胞注射到SD大鼠右眼前房1w后的荧光图片和对侧眼球的HE染色图片上。
图2为本发明实施例体外培养的GFP-SD大鼠结膜基质细胞注射到SD大鼠右眼前房即刻、1w、2w和4w后在小动物活体成像荧光显微镜下的图片。
图3为本发明实施例体外培养的GFP-SD大鼠结膜基质细胞注射到SD大鼠右眼前房后3d、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10w、11w和12w的大鼠双侧眼眼压测量结果。
图4A为本发明实施例体外培养的GFP-SD大鼠结膜基质细胞注射到SD大鼠右眼前房后12w眼球大小的对照图片；图4B为本发明实施例的体外培养的GFP-SD大鼠结膜基质细胞注射到SD大鼠右眼前房后1w和12w裂隙灯下眼球大小的对照图片。
图5A为本发明实施例体外培养的GFP-SD大鼠结膜基质细胞注射到SD大鼠右眼前房后2w、4w、8w和12w视网膜平铺片荧光显微镜图片；图5B为本发明实施例的体外培养的GFP-SD大鼠结膜基质细胞注射到SD大鼠右眼前房后2w、4w、8w和12w网膜神经节细胞存活数量的统计结果。
图6为本发明实施例体外培养的GFP-SD大鼠结膜基质细胞注射到SD大鼠右眼前房后4w、8w和12w大鼠视杯/盘HE染色图片。
图7A为本发明实施例体外培养的GFP-SD大鼠结膜基质细胞注射到SD大鼠右眼前房后12w的大鼠小梁网透射电子扫描图片；图7B为本发明实施例体外培养的GFP-SD大鼠结膜基质细胞注射到SD大鼠右眼前房后12w的大鼠视神经进行透射电子扫描图片；图7C为本发明实施例体外培养的GFP-SD大鼠结膜基质细胞注射到SD大鼠右眼前房后12w的大鼠视神经神经轴索数量的统计结果。
具体实施方式
本发明揭示的慢性青光眼动物模型建立方法，包括以下步骤：
（1）取GFP-SD大鼠的结膜组织，用灭菌PBS洗2遍；将结膜组织放入分散酶（Dispase II）或IV型胶原酶消化液，并置于37°C细胞培养箱中消化2小时或4°C 过夜，分离弃掉结膜上皮层，得到结膜基质组织块；
（2）上述结膜基质组织块放入胰酶中消化10 min，用细胞培养液（含10% FBS和1% 链霉素和1% 青霉素的DMEM培养液）终止消化，并吹打成单细胞悬浊液；上述悬浊液经70um孔径大小的细胞筛, 于4°C离心机中1500rpm离心5min，弃掉上清液，得到结膜基质细胞沉淀；
（3）于上述结膜基质细胞沉淀中加入适量的细胞培养液（含10% FBS、1% 链霉素和1%青霉素的DMEM培养液），吹打成单细胞后进行计数，以3-5× 105 个/ml种植于直径为100mm的培养皿中，每隔一天换液一次，待细胞长满后传代培养，即可得数量可观的结膜基质细胞；
（4）将体外培养得到的结膜基质细胞用胰酶消化后，用步骤S2的方法得到结膜基质细胞沉淀，加入适量的细胞培养液的到细胞悬浊液，细胞计数，使得最终细胞密度为1 × 107个/ml；
（5）在麻醉下将10 ul (1 × 105 个)上述细胞悬浊液用微量注射器注入大鼠右眼前房内并充分混匀，使其均匀分布于前房，左眼不处理作为正常对照眼球。
上述的DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，分散酶（Dispase II）或IV型胶原酶是分解细胞和基底膜之间的半桥粒，对细胞之间的桥粒结构没有作用，是分离上皮和结缔组织专用的酶。
下面通过三种方式对建模效果进行检测：
检测一：分别冷冻包埋上述建模1w（1w=1周）后的大鼠前房组织和建模4w、8w、12w后的大鼠视神经杯/盘组织，并进行冰冻切片，进行HE染色、观察、拍照，具体如下：
苏木素-伊红（HE）染色：上述组织取下后立即用OCT包埋，液氮预冷1min，置于-80°C冰箱保存。将低温保存的标本切片，用4%组织固定液固定15min，用双蒸水洗一遍，苏木素染色5min，流水洗去苏木素，1%盐酸酒精分化10s，流水反蓝15min，0.5%伊红染色1min，蒸馏水洗后梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察拍照。参见图1A、1B、1C、2以及图4，结果显示结膜基质细胞可以有效的堵住房角，杯盘比逐渐增大，视乳头萎缩越来越明显。
检测二：分别取建模后1w、3w、7w和11w的大鼠在脑立体定位仪下将4%荧光金注射到双侧上丘脑，进行荧光金逆行标记，于2w、4w、8w和12w取下眼球在眼科手术显微镜下进行视网膜平铺片，中性树脂封片，荧光显微镜下拍照，统计分析。参见图5，结果显示视网膜神经节细胞数量随着高眼压的持续时间逐渐减少。
检测三：分别取建模12w后大鼠的小梁网组织和视神经组织（厚度小于1mm），于2.5%戊二醛中固定2-4h，用0.1M磷酸缓冲液（PBS）漂洗样品3次，每次15min，1%锇酸固定1-2h，再漂洗清除固定液，脱水剂梯度脱水，纯丙酮处理20min，包埋剂梯度渗透，加热聚合，切片，正染色，透射电镜观察，拍照，统计。参见图6和7A、7B、7C，结果显示，建模12w后，与对侧眼球（Control组）相比，高眼压组（COH组）的Schlemm 管被胶质填充，神经轴索的数量明显下降。
综合检测一至三以及以及图3的眼压测量结果可以看出，本发明建立的慢性青光眼动物模型持续效果长期稳定，右眼眼压明显高于对侧，且可以维持稳定的眼压至少12w以上，并且具有慢性青光眼的一些共同特征：视网膜神经节细胞数量随着高眼压的持续时间逐渐减少，杯盘比逐渐增大、视乳头萎缩明显，高眼压眼球的视神经轴索数量明显少于对侧对照眼球。该模型还具有简便易行的特点，利用体外培养结膜基质细胞，具有较好重复性，成本低廉的优势，可应用于青光眼的基础研究和防治，而且利于大范围推广使用。
以上仅为本发明的具体实施例，并非对本发明的保护范围的限定。凡依本案的设计思路所做的等同变化，均落入本案的保护范围。

Claims (8)

1.慢性青光眼动物模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取GFP-SD大鼠的结膜组织，灭菌；将结膜组织放入分散酶或IV型胶原酶消化液中，并置于细胞培养箱消化，分离弃掉结膜上皮层，得到结膜基质组织块；
（2）将前述结膜基质组织块放入胰酶中消化，用细胞培养液终止消化，并吹打成单细胞悬浊液；单细胞悬浊液经70um孔径大小的细胞筛，后于离心机中离心处理，弃掉上清液，得到结膜基质细胞沉淀；
（3）在前述结膜基质细胞沉淀中加入适量的细胞培养液，吹打成单细胞后进行计数，将单细胞以一定密度种植于培养皿中进行体外培养，得到数量可观的结膜基质细胞；
（4）经体外培养得到的结膜基质细胞用胰酶消化后，用步骤（2）的方法处理得到结膜基质细胞沉淀，加入适量的细胞培养液得到细胞悬浊液，细胞计数，使得最终细胞密度为1 ×107 个/ml；
（5）在麻醉下将10 ul 步骤（4）得到的细胞悬浊液用微量注射器注入大鼠右眼前房内并充分混匀，使其均匀分布于前房，左眼不处理作为正常对照眼球。
2.如权利要求1所述的慢性青光眼动物模型建立方法，其特征在于：步骤（1）中，所述结膜组织需用灭菌PBS洗2遍。
3.如权利要求1所述的慢性青光眼动物模型建立方法，其特征在于：所述结膜组织的消化条件为：放入中性蛋白酶或IV型胶原酶消化液中并置于37°C细胞培养箱中消化2小时或4°C过夜。
4.如权利要求1所述的慢性青光眼动物模型建立方法，其特征在于：步骤（2）中，结膜基质组织块放入胰酶中消化时间为10 min。
5.如权利要求1所述的慢性青光眼动物模型建立方法，其特征在于：所述离心处理的条件为：4°C离心机中1500rpm离心5min。
6.如权利要求1所述的慢性青光眼动物模型建立方法，其特征在于：步骤（2）和（3）的细胞培养液均采用含10% FBS、1% 链霉素、1% 青霉素的DMEM培养液。
7.如权利要求1所述的慢性青光眼动物模型建立方法，其特征在于：所述体外培养包括：以3-5× 105 个/ml种植于直径为100mm的培养皿中，每隔一天换液一次，待细胞长满后传代培养。
8.如权利要求1-8任一项权利要求所述的慢性青光眼动物模型建立方法在慢性青光眼的模拟和防治中的应用。
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